Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-03-31T18:50:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Final.pdf: 3164642 bytes, checksum: 26c3a7b393ca571ac9b73869746ae77f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-31T18:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Final.pdf: 3164642 bytes, checksum: 26c3a7b393ca571ac9b73869746ae77f (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / REUNI / O objetivo desta pesquisa foi avaliar histologicamente a influência da fluoxetina no desenvolvimento do complexo dentino-pulpar de primeiros molares superiores de ratos. Para tal, foram utilizados 48 filhotes de ratos da linhagem Wistar cujas mães foram tratadas com cloridrato de fluoxetina durante a gestação e lactação, divididas em quatro grupos: grupo controle gestação (CG), grupo controle gestação e lactação (CL), grupo tratado com fluoxetina durante a gestação (FG) e grupo tratado com fluoxetina durante a gestação e a lactação (FL). Foram administrados cloreto de sódio ou cloridrato de fluoxetina na dose de 20 mg/kg a essas mães do 1º ao 21º dia de gestação e durante os 21 dias da lactação, por via oral. Posteriormente, cada grupo foi dividido em 2 subgrupos, de acordo com a idade do desenvolvimento do elemento dentário a ser estudado (15 e 25 dias de vida) e em cada subgrupo havia 6 filhotes (n=6). Os animais foram anestesiados, e a maxila com os elementos dentários direito e esquerdo foi seccionada frontalmente a face mesial do primeiro molar. Secções de 5 m foram coradas com Hematoxilina e Eosina, Tricrômico de Masson e Picrossírius Red e marcadas com o anticorpo para colágeno Tipo I para análise imunohistoquímica. Análises morfológicas, quantitativas e qualitativas revelaram diminuição nas espessuras da pré-dentina e dentina, diminuição no comprimento dos odontoblastos e diminuição no número de fibroblastos na zona central da polpa nos grupos tratados com fluoxetina durante a gestação e lactação. Estes dados sugerem que na dose e nas condições estudadas e quando aplicada durante a gestação e lactação, a fluoxetina pode alterar o desenvolvimento das estruturas dentárias analisadas. / Previous studies have evaluated the presence of serotonin receptors in tissues of teeth. Thus, we aimed to evaluate the use of fluoxetine (a selective serotonin reuptake inhibitor) was able to interfere with dentinogenesis and pulpogenesis these teeth of rats. For this , we used 48 puppies Wistar rats whose mothers were treated with fluoxetine during pregnancy and lactation, divided into four groups: control group gestation (CG), control group pregnancy and lactation (CL), treated group fluoxetine during pregnancy (FG) and group treated with fluoxetine during pregnancy and lactation (FL). Sodium chloride 0.9% or fluoxetine were administered in these mothers from the 1st to 21st day of pregnancy and during 21 days of lactation orally. Thereafter, each group was divided into two subgroups, according to the age of development of the tooth to be studied (15 and 25 days of life) in each subgroup were 6 pups (n = 6). Animals were anesthetized, and the jaw was removed and the maxilla with right and left teeth were sectioned frontally the mesial surface of the first molar. Sections of 5 μm were stained with hematoxylin and eosin, Masson´s Trichrome and Picrossirius Red and labeled with the antibody to collagen type I for immunohistochemical analysis. Morphological, quantitative and qualitative analyzes of odontoblasts, fibroblasts, collagen, dentin and pre-dentin revealed structural differences in the group treated with fluoxetine during pregnancy and lactation. These data suggest that, the dose and the conditions studied and when applied during pregnancy and lactation, fluoxetine may alter the development of dental structures analyzed.

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2768_1.pdf: 1864841 bytes, checksum: eb1e3e3394ac93ccec04b56b39f7653d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos prévios avaliaram a presença de serotonina no interior do epitélio e mesênquima de germes dentários. Assim, objetivamos avaliar se o uso da fluoxetina (um inibidor de recaptação de serotonina) foi capaz de interferir na dentinogênese destes germes. Para tal, foram utilizadas 12 ratas prenhes da linhagem Wistar, divididas em três grupos: grupo controle (C), grupo tratado com fluoxetina na dose de 10mg/kg de peso animal (FL) e grupo tratado com fluoxetina na dose de 20 mg/Kg de peso animal (FX). Foram administrados solução fisiológica a 0,9% ou cloridrato de fluoxetina a esses animais do 1º ao 21º dia de gestação, por via subcutânea. Posteriormente, cada grupo foi divididos em 2 subgrupos, de acordo com a idade do desenvolvimento do germe dentário a ser estudado (1 e 5 dias de vida). Os animais foram anestesiados, suas mandíbulas removidas e o maxilar superior com os germes dentários direito e esquerdo foi seccionado tangentemente a face mesial do primeiro molar. As peças foram fixadas em formol tamponado a 10%, processadas convencionalmente para microscopia de rotina e incluídos em parafina histológica. Secções de 4 μm foram coradas com HE e fotomicrografadas. Uma análise morfológica e quantitativa dos odontoblastos, dentina e pré-dentina revelou tendências a pequenas diferenças estruturais nos grupos tratados, com maior incidência nos animais com 1 dia de vida, alterações consideradas estatisticamente não significantes. Estes dados sugerem que nas doses e condições estudadas e quando aplicadas durante a gestação, a fluoxetina não alterou o desenvolvimento da dentina coronária

Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 μM e 0,1 μM) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 μM. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 μM and 0.1 μM) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 μM. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 μM e 0,1 μM) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 μM. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 μM and 0.1 μM) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 μM. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.

Este estudo translacional avaliou o efeito da aplicação direta de materiais capeadores à base de óleo de copaíba sobre a polpa dentária de ratos. O biomaterial foi analisado de acordo com os processos inflamatórios, reparadores e regenerativos. Cavidades classe I foram preparadas na face oclusal dos molares superiores e inferiores de ratos da linhagem Wistar (n=120). Posteriormente, uma cavidade padronizada foi realizada com broca carbide esférica ¼. Exposições pulpares foram obtidas e após a hemostasia com algodão estéril e água destilada, foi realizado o capeamento pulpar com aplicação de biomateriais diretamente no tecido pulpar. Os biomateriais utilizados foram: COP (Óleo de Copaíba); Ca(OH)2 (hidróxido de cálcio), Ca(OH)2+COP; MTA (agregado trióxido mineral); MTA+COP; BIODENTINA (Biodentine®); BIODENTINA+COP. Todas as cavidades foram restauradas com cimento provisório. Os animais foram sacrificados após o período de 7, 14, 28 dias de acordo com os princípios de ética e experimentação animal. Vinte e um grupos foram criados a partir da combinação de tempos e materiais, cada grupo foi constituído de 5 animais. As peças foram preparadas e processadas pela técnica histológica e coradas pela HE (hemotoxilina e eosina) realizando cortes aleatórios, sendo analisados ao microscópio óptico em 100X de aumento por 2 examinadores. Os critérios avaliados foram: respostas inflamatória e degenerativa, organização tecidual, dentina reacional e reparativa. No último tempo experimental (28 dias) de todos os grupos foi analisado a superfície (mm2) e o volume (mm3) da ponte de dentina formada pela técnica da micro-CT (microtomografia computadorizada) de alta resolução. Os dados foram estatisticamente analisados utilizando o teste T pareado, determinando a superfície e volume da dentina reparadora formada entre os grupos experimentais. Nas análises histológicas foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney realizando comparações entre os grupos (?=5%). A BIODENTINA demonstrou uma tendência de acelerar o processo de regeneração pulpar, iniciando a deposição de dentina reparativa ao sétimo dia do capeamento. Este material apresentou uma dentina mais espessa em comparação com os outros biomateriais. O MTA também demonstrou uma eficiência na formação da ponte dentinária, entretanto em 20% das amostras não foi observada a presença de dentina reparadora. Ao acrescentar o COP nestes materiais, a formação da ponte dentinária apresentava heterogênea e incompleta, além disso esses grupos continham um processo inflamatório aumentado. A dentina reparadora do grupo de Ca(OH)2 demonstrou presença de túnel, com característica heterogênea. A adição do COP ao Ca(OH)2 aumentou a formação de dentina nas paredes ao redor da câmara pulpar em 80% das amostras, porém esta dentina não apresentava melhora na qualidade. Desta forma, o capeamento pulpar com COP isolado ou associado a Ca(OH)2, MTA e BIODENTINA não formou uma ponte de dentina completa e homogênea no local da exposição pulpar. / This translational study evaluated the effect of the direct application of copaiba oil based capping materials on the rat pulp. The biomaterial was analyzed according to inflammatory, repairing and regenerative processes. Class I cavities were prepared on the occlusal surface of the upper and lower molars of Wistar rats (n = 120). Subsequently, standardized cavities was performed with ¼ spherical carbide drill. Pulp exposures were obtained and after their hemostasis with sterile cotton and distilled water, pulp capping was done with application of biomaterials directly on the pulp tissue. The biomaterials used were: COP (Copaíba oil); Ca(OH)2 (calcium hydroxide), Ca(OH)2+COP; MTA (aggregate mineral trioxide); MTA+COP; BIODENTINE (Biodentine®); BIODENTINA+COP. All cavities were restored with temporary cement. The animals were sacrificed after the period of 7, 14, 28 days according to the principles of ethics and animal experimentation. Twenty-one groups were created from the combination of times and materials, each group consisted of 5 animals. The specimens were prepared and processed by histological technique and stained by HE (haemotoxin and eosin); randomized cuts were examined under optical microscope with 100X enlargement by two different examiners. The evaluated criteria were inflammatory and degenerative response, tissue organization, reactive and reparative dentin. In the last experimental period (28 days) of all groups, the surface (mm2) and the volume (mm3) of the reactive and reparative dentin formed were analyzed by the high-resolution micro-CT (computerized microtomography) technique. The data were statistically analyzed using the paired T-test, determining the surface and volume of the reparative dentin formed between the experimental groups. In the histological analyzes, the non-parametric Mann-Whitney test was used, comparing groups (? = 5%). BIODENTINE demonstrated a tendency to accelerate the process of pulpal regeneration, initiating the deposition of reparative dentin on the seventh day of the capping. This material had a thicker dentin compared to the other biomaterials. The MTA also demonstrated an efficiency in the formation of the dentin bridge; however, 20% of the samples did not observe the presence of reparative dentin. When adding the COP in these materials, the formation of the dentin bridge was heterogeneous and incomplete, in addition these groups contained an increased inflammatory process. The repair dentin of the Ca(OH)2 group showed a tunnel with a heterogeneous characteristic. The addition of COP to Ca(OH)2 increased dentin formation in the walls around the pulp chamber in 80% of the samples, but this dentin did not show improvement in quality. Thus, pulp cap with COP isolated or associated with Ca(OH)2, MTA and BIODENTINE did not form a complete and homogeneous dentin bridge at the site of pulp exposure.

Este estudo translacional avaliou o efeito da aplicação direta de materiais capeadores à base de óleo de copaíba sobre a polpa dentária de ratos. O biomaterial foi analisado de acordo com os processos inflamatórios, reparadores e regenerativos. Cavidades classe I foram preparadas na face oclusal dos molares superiores e inferiores de ratos da linhagem Wistar (n=120). Posteriormente, uma cavidade padronizada foi realizada com broca carbide esférica ¼. Exposições pulpares foram obtidas e após a hemostasia com algodão estéril e água destilada, foi realizado o capeamento pulpar com aplicação de biomateriais diretamente no tecido pulpar. Os biomateriais utilizados foram: COP (Óleo de Copaíba); Ca(OH)2 (hidróxido de cálcio), Ca(OH)2+COP; MTA (agregado trióxido mineral); MTA+COP; BIODENTINA (Biodentine®); BIODENTINA+COP. Todas as cavidades foram restauradas com cimento provisório. Os animais foram sacrificados após o período de 7, 14, 28 dias de acordo com os princípios de ética e experimentação animal. Vinte e um grupos foram criados a partir da combinação de tempos e materiais, cada grupo foi constituído de 5 animais. As peças foram preparadas e processadas pela técnica histológica e coradas pela HE (hemotoxilina e eosina) realizando cortes aleatórios, sendo analisados ao microscópio óptico em 100X de aumento por 2 examinadores. Os critérios avaliados foram: respostas inflamatória e degenerativa, organização tecidual, dentina reacional e reparativa. No último tempo experimental (28 dias) de todos os grupos foi analisado a superfície (mm2) e o volume (mm3) da ponte de dentina formada pela técnica da micro-CT (microtomografia computadorizada) de alta resolução. Os dados foram estatisticamente analisados utilizando o teste T pareado, determinando a superfície e volume da dentina reparadora formada entre os grupos experimentais. Nas análises histológicas foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney realizando comparações entre os grupos (?=5%). A BIODENTINA demonstrou uma tendência de acelerar o processo de regeneração pulpar, iniciando a deposição de dentina reparativa ao sétimo dia do capeamento. Este material apresentou uma dentina mais espessa em comparação com os outros biomateriais. O MTA também demonstrou uma eficiência na formação da ponte dentinária, entretanto em 20% das amostras não foi observada a presença de dentina reparadora. Ao acrescentar o COP nestes materiais, a formação da ponte dentinária apresentava heterogênea e incompleta, além disso esses grupos continham um processo inflamatório aumentado. A dentina reparadora do grupo de Ca(OH)2 demonstrou presença de túnel, com característica heterogênea. A adição do COP ao Ca(OH)2 aumentou a formação de dentina nas paredes ao redor da câmara pulpar em 80% das amostras, porém esta dentina não apresentava melhora na qualidade. Desta forma, o capeamento pulpar com COP isolado ou associado a Ca(OH)2, MTA e BIODENTINA não formou uma ponte de dentina completa e homogênea no local da exposição pulpar. / This translational study evaluated the effect of the direct application of copaiba oil based capping materials on the rat pulp. The biomaterial was analyzed according to inflammatory, repairing and regenerative processes. Class I cavities were prepared on the occlusal surface of the upper and lower molars of Wistar rats (n = 120). Subsequently, standardized cavities was performed with ¼ spherical carbide drill. Pulp exposures were obtained and after their hemostasis with sterile cotton and distilled water, pulp capping was done with application of biomaterials directly on the pulp tissue. The biomaterials used were: COP (Copaíba oil); Ca(OH)2 (calcium hydroxide), Ca(OH)2+COP; MTA (aggregate mineral trioxide); MTA+COP; BIODENTINE (Biodentine®); BIODENTINA+COP. All cavities were restored with temporary cement. The animals were sacrificed after the period of 7, 14, 28 days according to the principles of ethics and animal experimentation. Twenty-one groups were created from the combination of times and materials, each group consisted of 5 animals. The specimens were prepared and processed by histological technique and stained by HE (haemotoxin and eosin); randomized cuts were examined under optical microscope with 100X enlargement by two different examiners. The evaluated criteria were inflammatory and degenerative response, tissue organization, reactive and reparative dentin. In the last experimental period (28 days) of all groups, the surface (mm2) and the volume (mm3) of the reactive and reparative dentin formed were analyzed by the high-resolution micro-CT (computerized microtomography) technique. The data were statistically analyzed using the paired T-test, determining the surface and volume of the reparative dentin formed between the experimental groups. In the histological analyzes, the non-parametric Mann-Whitney test was used, comparing groups (? = 5%). BIODENTINE demonstrated a tendency to accelerate the process of pulpal regeneration, initiating the deposition of reparative dentin on the seventh day of the capping. This material had a thicker dentin compared to the other biomaterials. The MTA also demonstrated an efficiency in the formation of the dentin bridge; however, 20% of the samples did not observe the presence of reparative dentin. When adding the COP in these materials, the formation of the dentin bridge was heterogeneous and incomplete, in addition these groups contained an increased inflammatory process. The repair dentin of the Ca(OH)2 group showed a tunnel with a heterogeneous characteristic. The addition of COP to Ca(OH)2 increased dentin formation in the walls around the pulp chamber in 80% of the samples, but this dentin did not show improvement in quality. Thus, pulp cap with COP isolated or associated with Ca(OH)2, MTA and BIODENTINE did not form a complete and homogeneous dentin bridge at the site of pulp exposure.

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.