Orientador: Marcelo Rocha Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T18:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_GustavoNarvaes_M.pdf: 1921416 bytes, checksum: 319cb7463f7d5db1e0d6718f74a0b426 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A dentina, assim como o osso, é um tecido mineralizado de natureza conjuntiva. Embora já tenha sido relatado que o hormônio paratireóideo (PTH), um dos reguladores da homeostasia do cálcio, participe do processo de formação de dentina, a maioria dos trabalhos envolvendo este hormônio é relacionado ao tecido ósseo. Tal hormônio, que fisiologicamente promove a reabsorção óssea, quando administrado de forma intermitente, pode promover anabolismo ósseo, sendo hoje um dos tratamentos para osteoporose. Por serem ainda pouco conhecidas as funções do PTH na dentinogênese, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração intermitente de PTH sobre a taxa de aposição e características estruturais da dentina em incisivos de camundongos. Para tanto, camundongos A/J Unib foram divididos em quatro grupos: C6, T6, C10 e T10 (n=10). Os animais dos grupos T6 e T10 receberam injeções subcutâneas de 40µg/Kg de hPTH(1-34), durante 6 e 10 dias respectivamente; os dos grupos C6 e C10 receberam injeções subcutâneas do veículo do PTH, também durante 6 e 10 dias respectivamente. Para delimitação da dentina formada no período experimental, os animais dos grupos T6 e C6 receberam injeções intraperitoneais de dois marcadores fluorescentes. Ao término do período experimental, o sangue dos animais dos grupos C6 e T6 foram coletados para quantificação de fosfatase alcalina e, suas hemimandíbulas esquerdas foram removidas para medição das taxas de aposição dentinária. Os animais dos grupos T10 e C10 foram sacrificados e as hemimandíbulas, direita e esquerda, foram processadas para os testes de microdureza knoop da dentina e conteúdo elementar (% de átomos) de cálcio (Ca), fósforo (P), oxigênio (O) e magnésio (Mg) na dentina peritubular e na dentina intertubular por meio da microanálise de energia dispersiva de raios-X (EDX). Após análise estatística pelo teste T de student, verificou-se um aumento significativo de 5% na taxa de aposição de dentina e a análise enzimática detectou um aumento significativo de 25% de fosfatase alcalina no grupo T6 em relação ao grupo C6. Os animais do grupo T10 apresentaram maior (11%) microdureza na dentina do que os animais do grupo C10. A microanálise por EDX demonstrou que o tratamento com PTH (T10) levou ao aumento do conteúdo (% de átomos) de P (23%) e Ca (53%), bem como da relação Ca/P (24%) na dentina peritubular, em relação ao grupo C10 (p<0.01). Estes resultados indicam que a administração intermitente de PTH, teve um efeito anabólico na formação de dentina em camundongos, acompanhado de significativas alterações estruturais na dentina formada / Abstract: Parathyroid hormone (PTH) has been widely studied, especially in the treatment of osteoporosis, since when administered intermittently promotes bone anabolism. Dentin is a mineralized tissue that share certain similarities to the bone. owever, the role of this hormone on dentin formation is poorly known. The purpose f this study was to investigate the effects of intermittent PTH administration on the apposition rate and structural features of dentin from mouse incisors. Forty young male mice A / J Unib were divided into four groups (n = 10): T6 and T10 = animals received subcutaneous injections of 40µg/Kg of hPTH (1-34) diluted in 0.01% acetic acid for 6 and 10 days respectively; C6 and C10 = animals received subcutaneous injections of PTH vehicle, also for 6 and 10 days, which served as control. The animals of C6 and T6 groups received intraperitoneal injections of fluorescent markers for delimitation of dentin formed during the experimental period. Dentin apposition rates, measured by fluorescence microscopy, and the detection of alkaline phosphatase (ALP) plasma levels were evaluated in the animals of T6 and C6 groups. Knoop microhardness testing and element content measurements in atom % of calcium (Ca), phosphorus (P), oxygen (O), and magnesium (Mg) in the peritubular and intertubular dentin by Energy Dispersive ray (EDX) microanalysis via Scanning Electron Microscopy (SEM) were performed in the animals of T10 and C10 groups. Statistical analysis of all tests was completed using unpaired Student's t test (two-tailed). Statistical significance limit was set at 5%, (p<0.05). Histometrical analysis by fluorecence microscopy showed that the animals of T6 group had a significant increase of 5% in the dentin apposition rate when compared with the control animals (C6). In the T6 group, ALP plasma levels were 25% higher than those in the C6 group. The results obtained from the knoop microhardness testing, demonstrated that the animals of T10 group showed greater microhardness than did the control animals (C10) (10%). In addition, EDX microanalysis showed that the P (23%) and Ca (53%) atom % content in the peritubular dentin was increased in the T10 group, compared with C10 group. The Ca/P ratio of T10 animals was also higher than the C10 animals (24%). The chemical composition of intertubular dentin did not differ between the groups. These results indicate that the short-time PTH administration had an anabolic effect on the dentin formation of incisor teeth of young healthy mice; this effect was following by mechanical and composition changes in the dentin / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Marcelo Rocha Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:02:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pessoa_JulianaIsabelitaCyrino_M.pdf: 1330572 bytes, checksum: 9bb6bbc1a1159fcdb5025fd37c60de5f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Gelatinases são endopeptidases zinco-dependentes que formam uma das classes das metaloproteinases da matriz (MMPs). O objetivo deste estudo foi localizar, em dentina saudável de molares de ratos, onde há atividade de gelatinases por meio da técnica de zimografia in situ. Para tanto, 10 ratos Wistar com 8 semanas de idade foram sacrificados, suas hemimandíbulas foram removidas, fixadas em paraformaldeído, lavadas em PBS+glicerol e descalcificadas em EDTA+glicerol. E, seguida as peças foram lavadas em PBS+glicerol+sucrose e incluídas em Paraplast. Cortes longitudinais da região de molares foram incubados com Dq Gelatin (Invitrogen) diluído em tampão Tris/HCl/CaCl2. Com os controles, cortes foram incubados com Dq Gelatin (Invitrogen)+inibidor de MMPs ou apenas com tampão Tris/HCl/CaCl2. Após a incubação foi possível observar, por meio de microscopia de fluorescência confocal, atividade gelatinolítica em praticamente toda a dentina, inclusive nos prolongamentos dos odontoblastos. Próximo ao limite amelo-dentinário e também na pré-dentina, observou-se maior atividade gelatinolítica em relação a toda dentina analisada. Pode-se concluir que é possível detectar atividade de gelatinases em dentina de molares de ratos por meio da técnica de zimografia in situ e que tal atividade varia em diferentes regiões da dentina. Portanto, zimografia in situ pode ser útil na investigação do papel das gelatinases de dentina em eventos como :o processo de desmineralização-remineralização da dentina, a cárie dentária e a degradação da camada híbrida, formada em procedimentos restauradores adesivos / Abstract: Objective: The purpose of this study was to evaluate the gelatinases activity in decalcified rat molars crowns by in situ zymography. Methods: Five male Wistar rats were killed and their hemimandibles were fixed in paraformaldehyde, decalcified in EDTA+Glycerol solution and embedded in paraffin. Section from the region of molars teeth were incubated with DQ gelatin (Invitrogen) and observed under confocal microscopy. Results: By using in situ zymography was possible detected gelatinolytc activity in whole crown dentin. High activity of the gelatinases was observed in the odontoblastic process, dentin-enamel junction (DEJ) and predentin. Conclusions: It was possible to evidence gelatinases activity in fixed and decalcified dentin from rat molars, and it activity was not uniformly distributed over different compartments of the dentin. In situ zymography could be a tool in studies investigating the role of the gelatinases in the dentin development and degradation / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Cristiane Duque / Banca: Ana Cláudia Okamoto / Banca: João Eduardo Gomes Filho / Banca: Thaís Marchini de Oliveira / Banca: Vivien Thiemy Sakai / Resumo: O tratamento endodôntico de dentes permanentes jovens representa um grande desafio clínico devido a presença de paredes dentinárias finas, divergentes ou paralelas e ápice aberto, o que dificulta a desinfecção e a execução dos procedimentos convencionais. Terapias de regeneração endodôntica envolvem o uso de materiais capazes de promover uma desinfecção eficaz sem causar citotoxicidade, além de induzir a diferenciação de células-tronco ou bioestimular células remanescentes do tecido pulpar mesmo após a injúria. Nesse contexto, os flavonoides, polifenóis presentes em frutas e vegetais, poderiam ser agentes interessantes para o tratamento endodôntico de dentes imaturos devido a sua amplitude terapêutica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano, citotóxico e indutor de mineralização de flavonoides com finalidade de aplicação endodôntica. Este trabalho de tese foi dividido em três capítulos. O capítulo 1 avaliou a toxicidade dos flavonoides taxifolina, crisina, pinocembrina e galangina sobre fibroblastos pelo ensaio de MTT, a atividade antimicrobiana pela determinação da concentração inibitória e bactericida mínima, e a ação antibiofilme do flavonoide com melhor efeito antimicrobiano, por meio de ensaios em placas de poliestireno e em dentina radicular bovina por meio da análise por microscopia confocal. Os resultados mostraram que o flavonoide taxifolina não foi tóxico para os fibroblastos em nenhuma das concentrações analisadas, enquanto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The endodontic treatment of young permanent teeth represents a great clinical challenge due to the presence of thin, divergent or parallel dentin walls and the open apex that makes it difficult to disinfect and perform conventional en dodontic procedures. Endodontic regeneration therapies involve the use of materials capable of promoting effective disinfection without causing cytotoxicity, in addition to inducing differentiation of stem cells or biostimulating remaining pulp tissue cell s even after injury. In this context, the flavonoids, polyphenols present in fruits and vegetables, could be interesting agents for the endodontic treatment of immature teeth due to the wide therapeutic use. Thus, the objective of the present study was to evaluate the antimicrobial, cytotoxic effects and capacity of mineralization induction of flavonoids for endodontic application. This thesis was divided into three chapters. The chapter 1 evaluated the toxicity of taxifolin, chrysin, pinocembrin and galang in flavonoids on fibroblasts by the MTT method, antimicrobial activity by determining the minimum inhibitory and bactericidal concentrations and analyzed the antibiofilm action of the flavonoid with the best antimicrobial effect, by means of the biofilm as says in polystyrene plates and in bovine root dentin and confocal microscopy analysis. The results showed that the flavonoid taxifolin was not toxic on fibrobla sts in any tested concentration, while chrysin, pinocembrin and galangin flav... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: Este estudo teve como objetivo geral utilizar células da linhagem MDPC-23 em testes de citotoxicidade de materiais e na investigação dos efeitos de proteínas bioativas no estímulo da síntese de componentes da matriz dentinária. Os objetivos específicos foram avaliar o efeito citotóxico de soluções utilizadas na lavagem de paredes cavitárias e de materiais dentários recomendados para aplicação em dentina sobre células de linhagem odontoblástica MDPC-23. Também foi intuito avaliar o efeito do concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelho sobre a expressão de genes específicos. Este trabalho, apresentado na forma de três artigos científicos, utilizou a técnica de MTT para avaliar o efeito citotóxico de soluções de CLX em variadas concentrações sobre as células MDPC-23. Esta técnica foi utilizada também para a investigação do efeito citotóxico de três diferentes cimentos de ionômero de vidro modificados por resina: Vitrebond (VB); Vitremer (VM); e RelyX Luting Cement (RX), associada ao teste de implantação destes materiais resinosos no tecido conjuntivo subcutâneo de ratos. A expressão dos genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina nas células expostas ao concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelhos foi avaliada por RT-PCR. Os resultados demonstraram que a CLX é citotóxica às células da linhagem MDPC-23 de maneira dose-dependente. Também foi demonstrado que os cimentos de ionômero de vidro são biocompatíveis ao tecido conjuntivo subcutâneo de ratos, apesar de apresentarem diferentes graus de citotoxicidade sobre as células odontoblastóides. As proteínas bioativas extraídas da dentina de coelhos apresentaram efeito estimulatório na expressão de genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina. Pode-se concluir que as células MDPC-23 são um modelo que pode ser utilizado nos testes de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The general aim of this in vitro and in vivo study was to evaluate the cytotoxicity of rinsing solutions and dental materials as well as to determine the expression of genes related with the dentinogenesis. The specific objectives were to evaluate the cytotoxicity effects of rinsing solutions used to clean cavity walls and dental materials used to restore dental cavities. The effects of EDTA soluble dentin proteins (members of TGF-â superfamily) on specific gene espression was also evaluated. For this porpose three scientific papers were prepared: 1) MTT assay was employed to investigate the cytotoxic effects of different concentrations of chlorhexidine to MDPC-23 cells as well as to; 2) to determine the cytotoxicity of three different resin-modified glass-ionomer cements (RMGIC): Vitrebond (VB); Vitremer (VM); and RelyX Luting Cement (VM). The results of this in vitro study was compared to the in vivo study in which RMGICs were implanted into the connective tissue of rats; 3) Type-1 collagen and fibronectin gene expression on cells exposed to EDTAsoluble dentin proteins was assessed by means of semi-quantitative RT-PCR. The results demonstrated that chlorhexidine is cytotoxic to MDPC-23 cells in a dose-dependent way. It was also demonstrated that RMGICs are biocompatible following implantation into surgical pockets prepared in the dorsal connective tissue of rats in spite of the different degrees of in vitro cytotoxicity presented by these materials to MDPC-23 cells. The stimulatory effects of the bioactive molecules on the expression of the genes that encodes to type-1 collagen and fibronectin was clearly demonstrated. Based on the experimental conditions, it was concluded that MDPC-23 cells are suitable model to be used on cytotoxicity tests of dental materials and rinsing solutions as well as to evaluate the dentinogenesis mechanisms. / Orientador: Carlos Alberto de Souza Costa / Coorientador: Claudio Miguel da Costa Neto / Banca: Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Mestre

Orientador: Luciano Tavares Angelo Cintra / Coorientador: André Luiz Fraga Briso / Banca: Edilson Ervolino / Banca: Eloi Dezan Junior / Banca: Mario Tanomaru Filho / Banca: Carlos Estrela / Resumo: Introdução: Através de modelo experimental caracterizado por nosso grupo de pesquisa, e protocolo clareador adaptado, verificamos que o peróxido de hidrogênio (H2O2) contido no gel clareador pode gerar efeitos ao tecido pulpar, que ainda não estão completamente compreendidos. Outros estudos mostram uma indução à mineralização, levando à posterior calcificação de grande parte do tecido pulpar e à formação de nódulos. Objetivos: Os objetivos deste trabalho foram divididos em duas etapas: 1 - Verificar os efeitos do H2O2 na expressão de marcadores da mineralização no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de osteocalcina (OCN) e osteopontina (OPN); e a presença de resposta celular específica ao estresse oxidativo, por meio de imunomarcação com anticorpo para espécies reativas de oxigênio (EROs); 2 - Determinar a capacidade de resposta ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de Heme-oxigenase-1 (HO-1); investigar os efeitos do gel clareador sobre a diferenciação odontoblástica, por meio da imunomarcação do fator de transcrição Jun-D; e a influência do estresse oxidativo gerado pelo H2O2 na identificação de células-tronco mesenquimais (CTMs) do tecido pulpar, por meio da técnica de imunofluorescência, com identificação concomitante de positividade celular para CD90, CD73, CD105 e negatividade para CD45. Materiais e métodos: Foram utilizados 60 ratos Wistar que tiveram os molares superiores direitos ou esquerdos clareados com 0,01 mL de ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction Through an experimental model characterized by our research group, and adapted bleaching protocol, we verified that the hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) of bleaching gel can generate effects on the pulp tissue, which are not yet completely understood. Studies show an induction to mineralization, leading to subsequent calcification of a large part of the pulp tissu e and to the formation of nodules. Objectives The objective s of this study were divided into two stages: 1 - To verify the effects of H 2 O 2 on the expression of mineralization markers in pulp tissue, through of immunolabelling of the osteocalcin (OCN) and o steopontin (OPN); and the presence of specific cellular response to oxidative stress, by immunolabeling with antibody to reactive oxygen species (ROS); 2 - To determine the capacity of response to oxidative stress generated by H 2 O 2 in pulp tissue, through of immunolabelling of Heme - oxigenase - 1 (HO - 1); to investigate the effects of the bleaching gel on the odontoblastic differentiation, through the immunolabelling of the transcription factor Jun - D; and the influence of the oxidative stress generated by H 2 O 2 on the identification of mesenchymal stem cells ( MSC s) of the pulp tissue by the immunofluorescence technique, with the concomitant identification of cellular positivity for CD90, CD73, CD105 and negativity for CD45. Materials and methods Sixty Wistar rats were used, and the right or left upper molars were bleached with 0.01 mL of 3... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:56:55Z : No. of bitstreams: 1 souza_ppc_me_arafo.pdf: 243435 bytes, checksum: 28d373d64f165dedc9e32182238f196c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo geral utilizar células da linhagem MDPC-23 em testes de citotoxicidade de materiais e na investigação dos efeitos de proteínas bioativas no estímulo da síntese de componentes da matriz dentinária. Os objetivos específicos foram avaliar o efeito citotóxico de soluções utilizadas na lavagem de paredes cavitárias e de materiais dentários recomendados para aplicação em dentina sobre células de linhagem odontoblástica MDPC-23. Também foi intuito avaliar o efeito do concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelho sobre a expressão de genes específicos. Este trabalho, apresentado na forma de três artigos científicos, utilizou a técnica de MTT para avaliar o efeito citotóxico de soluções de CLX em variadas concentrações sobre as células MDPC-23. Esta técnica foi utilizada também para a investigação do efeito citotóxico de três diferentes cimentos de ionômero de vidro modificados por resina: Vitrebond (VB); Vitremer (VM); e RelyX Luting Cement (RX), associada ao teste de implantação destes materiais resinosos no tecido conjuntivo subcutâneo de ratos. A expressão dos genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina nas células expostas ao concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelhos foi avaliada por RT-PCR. Os resultados demonstraram que a CLX é citotóxica às células da linhagem MDPC-23 de maneira dose-dependente. Também foi demonstrado que os cimentos de ionômero de vidro são biocompatíveis ao tecido conjuntivo subcutâneo de ratos, apesar de apresentarem diferentes graus de citotoxicidade sobre as células odontoblastóides. As proteínas bioativas extraídas da dentina de coelhos apresentaram efeito estimulatório na expressão de genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina. Pode-se concluir que as células MDPC-23 são um modelo que pode ser utilizado nos testes de... . / The general aim of this in vitro and in vivo study was to evaluate the cytotoxicity of rinsing solutions and dental materials as well as to determine the expression of genes related with the dentinogenesis. The specific objectives were to evaluate the cytotoxicity effects of rinsing solutions used to clean cavity walls and dental materials used to restore dental cavities. The effects of EDTA soluble dentin proteins (members of TGF-â superfamily) on specific gene espression was also evaluated. For this porpose three scientific papers were prepared: 1) MTT assay was employed to investigate the cytotoxic effects of different concentrations of chlorhexidine to MDPC-23 cells as well as to; 2) to determine the cytotoxicity of three different resin-modified glass-ionomer cements (RMGIC): Vitrebond (VB); Vitremer (VM); and RelyX Luting Cement (VM). The results of this in vitro study was compared to the in vivo study in which RMGICs were implanted into the connective tissue of rats; 3) Type-1 collagen and fibronectin gene expression on cells exposed to EDTAsoluble dentin proteins was assessed by means of semi-quantitative RT-PCR. The results demonstrated that chlorhexidine is cytotoxic to MDPC-23 cells in a dose-dependent way. It was also demonstrated that RMGICs are biocompatible following implantation into surgical pockets prepared in the dorsal connective tissue of rats in spite of the different degrees of in vitro cytotoxicity presented by these materials to MDPC-23 cells. The stimulatory effects of the bioactive molecules on the expression of the genes that encodes to type-1 collagen and fibronectin was clearly demonstrated. Based on the experimental conditions, it was concluded that MDPC-23 cells are suitable model to be used on cytotoxicity tests of dental materials and rinsing solutions as well as to evaluate the dentinogenesis mechanisms.

Submitted by Francine Benetti (francine_benetti@hotmail.com) on 2018-04-20T19:51:50Z No. of bitstreams: 1 Tese Francine Benetti - Endodontia - Unesp Araçatuba.pdf: 3865247 bytes, checksum: fa9bbf2ed59a70e845ce04ead454d654 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Rimoli de Oliveira null (anapaula@foa.unesp.br) on 2018-04-23T14:02:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 benetti_f_dr_araca_int.pdf: 3865247 bytes, checksum: fa9bbf2ed59a70e845ce04ead454d654 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T14:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 benetti_f_dr_araca_int.pdf: 3865247 bytes, checksum: fa9bbf2ed59a70e845ce04ead454d654 (MD5) Previous issue date: 2018-04-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Através de modelo experimental caracterizado por nosso grupo de pesquisa, e protocolo clareador adaptado, verificamos que o peróxido de hidrogênio (H2O2) contido no gel clareador pode gerar efeitos ao tecido pulpar, que ainda não estão completamente compreendidos. Outros estudos mostram uma indução à mineralização, levando à posterior calcificação de grande parte do tecido pulpar e à formação de nódulos. Objetivos: Os objetivos deste trabalho foram divididos em duas etapas: 1 – Verificar os efeitos do H2O2 na expressão de marcadores da mineralização no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de osteocalcina (OCN) e osteopontina (OPN); e a presença de resposta celular específica ao estresse oxidativo, por meio de imunomarcação com anticorpo para espécies reativas de oxigênio (EROs); 2 – Determinar a capacidade de resposta ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de Heme-oxigenase-1 (HO-1); investigar os efeitos do gel clareador sobre a diferenciação odontoblástica, por meio da imunomarcação do fator de transcrição Jun-D; e a influência do estresse oxidativo gerado pelo H2O2 na identificação de células-tronco mesenquimais (CTMs) do tecido pulpar, por meio da técnica de imunofluorescência, com identificação concomitante de positividade celular para CD90, CD73, CD105 e negatividade para CD45. Materiais e métodos: Foram utilizados 60 ratos Wistar que tiveram os molares superiores direitos ou esquerdos clareados com 0,01 mL de H2O2 35%, em uma aplicação de 30 minutos, de forma randomizada. Os molares do lado não clareado serviram de controle. Após 0 horas, 2, 3, 7, 15 e 30 dias (n=10), os animais foram mortos e as maxilas processadas para avaliação histológica, imunoistoquímica (OCN, OPN, EROs, HO-1 e Jun-D) e de imunofluorescência (CD90, CD73, CD105, CD45). Os resultados foram submetidos a testes estatísticos específicos (p<0,05). Resultados: No tempo de 0 horas, houve necrose em toda a polpa coronária (p<0,05), e aos 2 e 3 dias, no terço oclusal (p<0,05); aos 7, 15 e 30 dias, não houve inflamação, assim como no controle (p>0,05). Dentina terciária estava presente aos 7 dias, aumentando em 15 e 30 dias (p<0,05). Em relação aos marcadores de mineralização, OCN foi ausente imediatamente após procedimento clareador, aumentando ao longo dos períodos, se tornando significativa aos 15 e 30 dias (p<0,05); OPN apresentou maior imunomarcação aos 7 e 15 dias no grupo clareado (p<0,05). A imunomarcação de EROs foi significativa em todos os terços da polpa coronária no grupo clareado aos 7 e 15 dias, e no terço cervical aos 2 e 30 dias, comparada ao controle (p<0,05). HO-1 revelou maior imunomarcação no grupo clareado nos terços médio e cervical da polpa coronária aos 2 e 3 dias, em todos os terços aos 7 dias, e no terço oclusal aos 15 dias, quando comparado ao grupo controle (p<0,05). Imunomarcação nuclear para Jun-D foi significativa no grupo clareado no terço cervical da polpa coronária aos 2 e 3 dias, e nos terços oclusal e médio aos 7 dias, quando comparado ao grupo controle (p<0,05), reduzindo nos demais períodos (p>0,05). Poucas células CD90+/CD73+/CD105+/CD45- foram observadas no tecido pulpar do grupo controle e do grupo clareado em todos os períodos de análise (p>0,05). Conclusões: Pode-se concluir que: 1 – A redução da inflamação e o processo de reparo pulpar após procedimento clareador está associado com o aumento de OCN, e OPN participa durante o processo de reparo; EROs está presente no processo de defesa celular contra o estresse oxidativo decorrente do H2O2. 2 – As células pulpares apresentam capacidade de resposta ao estresse oxidativo expressando HO-1 nos períodos onde há inflamação, até o início do reparo; Jun-D é presente no tecido pulpar durante a redução do processo inflamatório e início da produção de dentina terciária; a presença de estresse oxidativo não influencia o número de células CD90+/CD73+/CD105+/CD45- identificadas in vivo no tecido pulpar. / Introduction Through an experimental model characterized by our research group, and adapted bleaching protocol, we verified that the hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) of bleaching gel can generate effects on the pulp tissue, which are not yet completely understood. Studies show an induction to mineralization, leading to subsequent calcification of a large part of the pulp tissu e and to the formation of nodules. Objectives The objective s of this study were divided into two stages: 1 – To verify the effects of H 2 O 2 on the expression of mineralization markers in pulp tissue, through of immunolabelling of the osteocalcin (OCN) and o steopontin (OPN); and the presence of specific cellular response to oxidative stress, by immunolabeling with antibody to reactive oxygen species (ROS); 2 – To determine the capacity of response to oxidative stress generated by H 2 O 2 in pulp tissue , through of immunolabelling of Heme - oxigenase - 1 (HO - 1); to investigate the effects of the bleaching gel on the odontoblastic differentiation, through the immunolabelling of the transcription factor Jun - D; and the influence of the oxidative stress generated by H 2 O 2 on the identification of mesenchymal stem cells ( MSC s) of the pulp tissue by the immunofluorescence technique, with the concomitant identification of cellular positivity for CD90, CD73, CD105 and negativity for CD45. Materials and methods Sixty Wistar rats were used, and the right or left upper molars were bleached with 0.01 mL of 35% H 2 O 2 , in a direct application of 30 minutes , r andomly . T he molars on the unbleached side served as controls. After 0 hours, 2, 3 , 7, 15 and 30 days (n=10), the animals were ki lled and the jaws processed for histological, immunohistochemical (OCN, OPN, ROS, HO - 1 and Jun - D) and immunofluorescence ( CD90, CD73, CD105, CD45 ) analysis. The results were submitted to specific statistical tests ( P <0.05). Results At 0 hours, there was necrosis throughout the coronary pulp ( P <0.05), and at 2 and 3 days, in the occlusal third ( P <0.05); at 7, 15 and 30 days, there was no inflammation, as well as in the control ( P >0.05). Tertiary dentin was present at 7 days, increasing in 15 and 30 days ( P <0.05). In relation to mineralization markers, OCN was absent immediately after bleaching procedure, increasing over the periods, becoming significant at 15 and 30 days ( P <0.05); OPN has higher immunolabelling at 7 and 15 days in the bleached group ( P <0.05 ). Immuno labelling of ROS was significant in all thirds of the coronary pulp in the bleached group at 7 and 15 days, and in the cervical third at 2 and 30 days, compared to the control group ( P <0.05). HO - 1 showed higher immunolabelling in the bleached grou p in the middle and cervical thirds of the coronary pulp at 2 and 3 days, in all thirds at 7 days, and in the occlusal third at 15 days, when compared to the control group ( P <0.05). Nuclear immuno labelling for Jun - D was significant in the bleached group in the cervical third of the coronary pulp at 2 and 3 days, and in the occlusal and middle thirds at 7 days, when compared to the control group ( P <0.05), reducing in the other periods ( P >0.05). Low number of CD90+/CD73+/CD105+/CD45 - cells were observed in the pulp tissue of the control group and the bleached group in all periods of analysis ( P >0.05). Conclusions It is concluded that : 1 – The reduction of inflammation and the pulp repair process after bleach ing is associated with increased of OCN, and OPN participates during the repair process; ROS are present in the cellular defence process against oxidative stress by H 2 O 2 . 2 – The pulp cells had capacity to respond to oxidative stress expressing HO - 1 in the periods where there is inflammation, until the beginning of the repair; Jun - D is present in the pulp tissue during the reduction of the inflammatory process and the beginning of the production of tertiary dentin; the presence of oxidative stress does not influence the number of CD90+/CD73+/CD105+/CD45 - cells identified in vivo in the pulp tissue. / 15/10825-2

Orientadores: Lília Freire Rodrigues de Souza Li, Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:55:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pedroni_MarcusViniciusCosta_M.pdf: 5336681 bytes, checksum: 022385349dc7fcf62951d9f8c466360f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Osteogênese Imperfeita (OI) é um distúrbio genético caracterizado por baixa massa e fragilidade óssea, e outras manifestações do tecido conjuntivo, decorrente de defeitos qualitativos ou quantitativos do colágeno tipo I. Está associada a mutações nos genes COL1A1 e COL1A2 que codificam respectivamente as cadeias pro'alfa'1-(I) e pro'alfa'-2(I) formadoras da molécula do colágeno tipo I, e mais raramente mutações nos genes reguladores. A OI manifesta-se através de diferentes fenótipos (I-IV), segundo a classificação de Sillence et al. O objetivo deste trabalho foi a análise molecular dos genes COL1A1 e COL1A2 em famílias brasileiras portadoras de OI, em suas diferentes formas clínicas. Fizemos biópsia da pele de 12 famílias com OI para cultura primária dos fibroblastos. Desta cultura extraímos RNA total, que foi usado como molde para transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase (PCR) dos genes e sequenciamento automático direto de cDNA. A expressão gênica foi determinada por Real Time PCR e o padrão e grau de expressão das proteínas do colágeno foram analisados por Imunocitoquímica e Western blot. Identificamos nove mutações missense em heterozigose em nove famílias, e duas mutações com alteração na matriz de leitura em famílias com fenótipos dos tipos I, III ou IV de OI. No gene COL1A1 encontramos quatro mutações já descritas: c.613G>A (p.P205A); c.769G> A (p.G257R); c.859G>A (p.G287S); c.1678G>A (p.G560R). No gene COL1A2 encontramos uma mutação já descrita: c.2314G> A (p.G772S) e quatro novas mutações: c.214G>A (p.G72S); c.775G>A (p.G259S); c.793G> C (p.G265R) e c.3467G>A (p.R1156K). Encontramos hiperexpressão dos transcritos de COL1A1 e COL1A2, porém expressão normal das cadeias 'alfa'1 e 'alfa'2 da proteína do colágeno em todos os pacientes. As cadeias mutada apresentaram padrão desorganizado nas células. Pacientes com OI apresentaram hiperexpressão dos genes de colágeno tipo I sugerindo que estes genes são regulados e que as meia vidas destas proteínas estão reduzidas / Abstract: Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic disorder characterized by low bone mass and bone fragility, and other manifestations of connective tissue, due to qualitative or quantitative defects of type I collagen. It is associated with mutations in COL1A1 and COL1A2 genes, that encode respectively the pro'alpha'-1(I) and pro'alpha'-2(I) chains, forming the molecule of type I collagen, and more rarely mutations in regulatory genes. The OI is manifested by various phenotypes (I-IV), according to the classification of Sillence et al. The objective of this study was the molecular analysis of COL1A1 and COL1A2 genes in Brazilian families with OI, in its different clinical forms. We performed skin biopsy from 12 families with OI for primary culture of fibroblasts. From this culture, we made total RNA extract, which was used as template for reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR), and automated sequencing directly from cDNA. Gene expression was determined by Real Time qPCR and the level of expression of collagen proteins were analyzed by immunocytochemistry and Western Blot. We identified heterozygous mutations in 11 families that have phenotypes of types I, III or IV of OI. In the COL1A1 gene found four previously described mutations: c.613G> A (p.P205A), c.769G> A (p.G257R), c.859G> A (p.G287S), c.1678G> A (p. G560R). In the COL1A2 gene we found one previously described mutation: c.2314G> A (p.G772S) and four new mutations: c.214G> A (p.G72S), c.775G> A (p.G259S), c.793G> C (p.G265R) and c.3467G> A (p.R1156K). We found upregulation of the transcripts of COL1A1 and COL1A2 genes, but a normal expression of 'alpha'1 and 'alpha'2 protein chains in all patients. The mutant chain showed disorganized on the immunocytochemestry. Patients with OI showed upregulation of type I collagen genes, suggesting regulation and decreasing half lives of the proteins / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.