Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 μM e 0,1 μM) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 μM. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 μM and 0.1 μM) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 μM. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 μM e 0,1 μM) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 μM. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 μM and 0.1 μM) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 μM. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

Abstract Dentin formation in physiological and pathological conditions has been widely studied, but the events and regulation are still not completely understood. Odontoblasts, terminally differentiated post-mitotic cells located in a single cell layer around pulp tissue, synthesize and mineralize dentin organic matrix. Growth factors, such as TGF-β1 and BMP-2, have been implicated in the regulation of the responses of odontoblasts and pulp tissue to external irritation. Matrix metalloproteinases (MMPs), a family of 28 endopeptidases collectively capable of degrading virtually all extracellular matrix components, and their specific tissue inhibitors (TIMPs) participate in the organo- and morphogenesis, physiological tissue turnover and pathological tissue destruction in many tissues, but very little is known about their presence, function, and regulation in the dentin-pulp complex cells and tissues. The aim of the work presented in this thesis was to analyze the expression and regulation of collagens, MMPs and TIMPs by TGF-β1 and BMP-2 in mature human odontoblasts and pulp tissue. Odontoblasts synthesize and secrete type I and type III collagens, with no clear effect of TGF-β1 on their expression levels. MMP-1, -2, -8, -9, -10, -11, -14, -15, -16, -19 and TIMP-1, -2, -3 and -4 were expressed by both odontoblasts and pulp tissue. MMP-3 and MMP-12 were not expressed in native odontoblasts or pulp tissue, and MMP-7, -24, and -25 were expressed only in odontoblasts. MMP-2, -10, -14, -20 and -23 were expressed more abundantly in odontoblasts, whereas pulp tissue expressed more MMP-13 and MMP-17. Growth factors differentially regulated the expression of different MMPs and TIMPs within and among the cells and tissues studied. In odontoblasts, MMP-1, -8 and -14 were down-regulated, but MMP-7, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-3 up-regulated, by either TGF-β1 or BMP-2, alone or in combination. In pulp tissue, growth factors up-regulated the expression of MMP-1, -2, -10, -13, -17 and TIMP-3, but down-regulated TIMP-4. The widespread of expression of MMPs and TIMPs by mature human odontoblasts and pulp tissue suggests that they may participate in dentin matrix organization prior to mineralization, and that growth factors may further control dentin matrix modeling, not by regulating the synthesis of type I or III collagens as previously believed, but rather by differentially regulating each MMPs and TIMPs.

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.