Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017 / Made available in DSpace on 2017-09-19T04:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347028.pdf: 2777968 bytes, checksum: e2e99a611a7b5f21296a003c94110659 (MD5) Previous issue date: 2017 / O melanoma é o mais grave tipo de câncer de pele pela possibilidade de metástase e desde 1975, a dacarbazina continua a ser o tratamento padrão, mesmo apresentando muitas reações adversas. O número de candidatos a agentes antitumorais vem crescendo a cada ano, porém a falta de modelos in vitro representativos de um microambiente tumoral não acompanha este crescimento. A cultura tridimensional (3D) se mostra um dos melhores modelos in vitro para mimetizar o microambiente tumoral. Neste trabalho, utilizando a estratégia de formação de esferoide, desenvolveu-se um modelo celular 3D de melanoma murino isolado ou associado a macrófagos e fibroblastos. Para o melanoma, um modelo assim ainda não foi descrito na literatura. Dentre as tentativas, o modelo foi padronizado utilizando gel de agarose 2% como base e uma densidade celular de 1,2×104/poço para a formação dos esferoides. Os esferoides formados apresentaram tamanho médio de 300 µm compatível com a literatura. Além disso, o heteroesferoide composto pelas três linhagens celulares (melanoma, macrófagos e fibroblastos) mostrou-se mais rígido e estável aparentemente, em comparação com as outras condições testadas, características estas provavelmente provenientes da alta produção de matriz extracelular. Os esferoides supostamente demonstraram a formação de duas zonas: uma periférica de células viáveis e outra interna de células necróticas, que foram confirmadas pela contagem de células, a qual diminuiu no sétimo dia em relação ao quarto dia de cultivo 3D e pela presença de grandes espaços vazios no interior dos esferoides, observados pela microscopia. O perfil inflamatório dos macrófagos presentes nos esferoides foi induzido usando lipolissacarídeo (LPS) para polarização M1 e dexametasona (DEX) para polarização M2. Após caracterização dos esferoides, estes foram incubados com o sal de isotiourônio MF03 e a dacarbazina. Os resultados revelaram que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se mais citotóxico que a dacarbazina no modelo 3D de melanoma. Adicionalmente, observou-se diferenças importantes em termos de citotoxicidade das moléculas, comparando-se o modelo bidimensional (2D) com o 3D. Diante dos resultados, conclui-se que foi desenvolvido um modelo 3D de melanoma adequado para a triagem de possíveis agentes antitumorais, sendo que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se promissor para o tratamento antitumoral de melanoma.<br> / Abstract: Melanomas is the most severe type of skin cancer, and since 1975, dacarbazine remains the standard treatment for most patients, even presenting many adverse reactions. The number of candidates to antitumor agents is increasing every year, although the lack of in vitro models to represent the tumor microenvironment disrupts the process. Three-dimensional (3D) culture is one the best in vitro models to mimic the tumor microenvironment. In this work, using spheroid strategies, a 3D murine melanoma cellular model isolated or associated with macrophages and fibroblasts was developed. Melanoma model has not been described previously. Among the attempts the model was standardized using agarose gel 2 % and a cell density of 1,2×104/well to spheroid formation. Spheroids size was around 300 µm, as described in the literature. In addition, heterospheroids composed of three cell lines (melanoma, macrophages and fibroblasts) showed more rigid and stable apparently when compared with other tried conditions, probably due to high extracellular matrix production. Spheroids supposedly showed two different regions: a peripheral zone containing viable cells and an internal zone containing necrotic cells which was demonstrated by the decrease in the number of cells on the seventh day when compared with the day four, and by presence of large empty spaces inside the spheroids, visualized by microscopy. The inflammatory profile associated with the macrophages-containing spheroids was induced using lipopolysaccharide (LPS) to M1 polarization and dexamethasone to M2 polarization. Following the characterization, spheroids were incubated with MF03 isothiouronium salt and dacarbazine. The results showed that MF03 was most cytotoxic than dacarbazine using the 3D melanoma model. Additionally, it was observed significant cytotoxic differences between bidimensional (2D) and 3D models. In conclusion, we developed a 3D melanoma model to improve the screening of new antitumor agents as well as the promising application of MF03 as a new anti-melanoma.

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: As células tronco mesenquimais tem por definição a autorrenovação, fonte de proliferação e a diferenciação celular em várias linhagens, sendo cartilagem, osso e tecido adiposo. Quanto características funcionais destacam-se cinco características: Suporte estrutural ou arcabouço, controle da inflamação, inibição da apoptose, ação anti-fibrose e por fim a diferenciação, cada um sendo responsável por secretar citocinas e hormônios de crescimento. As plaquetas, os hormônios de crescimento e fase de remodelamento de feridas crônicas abrangem várias etapas, começando pela fase da hemostasia e terminando na fase do remodelamento que vai garantir a força e o fechamento da ferida. Cada fase tem sua importância e secretam também inúmeros fatores de crescimento e citocinas importantes. A linha de curativos biológicos vem sendo desenvolvida há 15 anos no Laboratório de Engenharia Celular. Os resultados com o uso destes biocurativos têm sido excelentes, no entanto observa-se que quanto mais antiga é a lesão, ou maior a idade, maior é também a dificuldade no fechamento da área, e o risco de infecção secundária aumenta. Diante disto, encontrou-se uma oportunidade de melhoria do produto com os avanços no cultivo de células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, esta técnica propicia a obtenção de diferentes fatores de crescimento que modulam o fechamento de feridas. Uma das etapas do projeto foi avaliar pacientes idosos com feridas crônicas acima de três anos, a média obtida dos hor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells are by definition self-renewal, a source of proliferation and cell differentiation in various strains, being cartilage, bone and adipose tissue. As for functional characteristics, five characteristics stand out: structural support or framework, inflammation control, inhibition of apoptosis, anti-fibrosis action and finally differentiation, each one being responsible for secreting cytokines and growth hormones. Platelets, growth hormones and chronic wound remodeling phase span several stages, beginning with the hemostasis phase and ending at the remodeling phase that will ensure strength and wound closure. Each phase has its importance and also secrete countless important growth factors and cytokines. The line of biological dressings has been developed for 15 years in the Laboratory of Cellular Engineering. The results with the use of these bio-curatives have been excellent, however, it is observed that the older the lesion, or the greater the age, the greater the difficulty in closing the area, and the risk of secondary infection increases. In view of this, there was an opportunity to improve the product with advances in the cultivation of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue, this technique provides the achievement of different growth factors that modulate the closure of wounds. One of the steps of the project was to evaluate elderly patients with chronic wounds over three years, the average obtained from growth hormones compared to healt... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os carboidratos galactose, sorbitol e glicerol foram usados para se avaliar a capacidade de células in vitro de plantas em utilizar fontes alternativas de carbono em culturas de células em suspensão de três diferentes espécies (Bauhinia forficata Link, Curcuma zedoaria Roscoe e Phaseolus vulgaris). Culturas crescendo em sacarose como fonte de carbono foram usadas como controle. A sacarose foi a fonte de carbono que condicionou os melhores resultados de crescimento expressos em ganho de massa fresca e massa seca, bem como de acúmulo protéico para as três espécies testadas. O glicerol e o sorbitol não proporcionaram ganho significativo de massa fresca e nem de massa seca nas culturas de nenhuma das três espécies testadas, exceto um pequeno ganho de massa seca observado para B. forficata quando o glicerol foi empregado como fonte de carbono. A galactose proporcionou aumento de massa fresca e massa seca apenas em culturas de C. zedoaria e B. forficata, sendo que este aumento foi inferior ao proporcionado pela sacarose nas culturas das mesmas espécies. A análise da atividade das enzimas do metabolismo da sacarose indicou que culturas de células em suspensão de C. zedoaria e de P. vulgaris apresentam as duas vias de degradação da sacarose; a via clássica caracterizada pela atividade das enzimas invertases e hexoquinase e a via alternativa caracterizada pela atividade das enzimas sacarose sintase e UDP glicose pirofosforilase. A ausência de atividade da enzima sacarose sintase nas culturas de Bauhinia sugere que células em suspensão desta espécie degradam a sacarose apenas pela via clássica. / not available

BEZERRA, A. V. Efeito do ranelato de estrôncio na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos murinos in vitro. 55 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Morfofuncionais) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Programa de Pós Graduação em Ciências Morfofuncionais (pcmf.ufc@gmail.com) on 2017-11-28T12:14:43Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-11-28T13:41:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-28T13:41:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_avbezerra.pdf: 2366656 bytes, checksum: 838cff6e33710583d5948915908acda8 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / The bone tissue is classified as a specialized connective tissue composed by organic and inorganic matrix, osteoclasts and osteoblastic lineage cells. In pathologic procedures, the bone tissue’s homeostasis can be reestablished with some pharmacological therapies, as strontium ranelate, widely used to treat osteoporosis post menopause, because of its inhibitory effects over the osteoclasts and the activation of the osteoblasts. The mechanisms involved, however, are still not completely clarified. OBJECTIVES: This paper has as objective to evaluate the direct effect of strontium ranelate in murine proliferation and activation of osteoblasts, and the possible mechanisms involved. METHODOLOGY: To evaluate the viability and cell proliferation were performed trials of MTT and immunolabeling with Ki67, respectively, after 24 and 48 hours of osteoblasts’ incubation with strontium ranelate. For the MTT, it was used different concentrations of ranelate (0,01; 0,1; 1; 10; 100 and 1000 mM), and by the obtained results, two concentrations (0,01 and 0,1 mM) were selected for the next trials: immunolabeling with Ki67, Western Blot to investigate the protein expression of BMP2, SMAD2/3OPG, RANKL, and alkaline phosphatase (FAO). It was still performed the quantification of the levels of FAO in a culture medium, using specific kits of LABTEST®, after 24, 48, 72 and 120 hours of incubation with strontium ranelate. The mineralization was evaluated by the von Kossa Staining Protocol for Calcium among 7, 14, and 21 days. RESULTS: A significant increase of the viability of osteoblasts was observed after these cells incubation with 0,01 and 0,1 mM of strontium ranelate for 24 hours. BMP2 increased significantly in these two concentrations of the drug used in the period of 24 hours by the Western Blot trial. In the trial to measure the FAO in culture medium, it was observed a significant increase of FAO after incubation with 0,1mM of ranelate for 24 hours. In the von Kossa trial, it was observed an increase and acceleration of mineralization in concentrations of 0,01 and 0,1 mM.CONCLUSION: The results suggest a positive effect of the strontium ranelate in proliferation, viability, and activation of osteoblasts, possibly because of the higher expression of BMP and FAO by osteoblasts. Therefore, promising studies can be performed with the strontium ranelate with its application in regenerating bone defects. / O tecido ósseo é classificado como um tecido conjuntivo especializado composto por matriz orgânica e inorgânica, osteoclastos e células da linhagem osteoblástica. Nos processos patológicos, a homeostasia do tecido ósseo pode ser reestabelecida com algumas terapias farmacológicas como o Ranelato de estrôncio, já largamente utilizado para tratamento da osteoporose pós-menorpausa, devido seus efeitos inibitórios sobre os osteoclastos e ativação de osteoblastos. Os mecanismos envolvidos, no entanto, ainda não foram completamente esclarecidos. OBJETIVOS: Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito direto do ranelato de estrôncio na proliferação e ativação de osteoblastos murinos, e os possíveis mecanismos envolvidos. METODOLOGIA: Para a avaliação da viabilidade e proliferação celular foram realizados os ensaios de MTT e imunomarcação com Ki67, respectivamente, após 24 e 48 horas de incubação dos osteoblastos com ranelato de estrôncio. Para o MTT foram utilizadas diferentes concentrações de ranelato (0,01; 0,1; 1; 10; 100 e 1000 mM), e a partir dos resultados obtidos, duas concentrações (0,01 e 0,1 mM) foram selecionadas para os ensaios posteriores: imunomarcação com Ki67, Western Blot para investigar a.expressão proteica de BMP2, SMAD2/3, OPG, RANKL e fosfatase alcalina (FAO) . Foi realizado, ainda, a quantificação dos níveis de FAO no meio de cultura, utilizando “kits” específicos da LABTEST®, após 24, 48, 72 e 120h de incubação com ranelato de estrôncio. A mineralização foi avaliada pelo teste de Von Kossa nos períodos de 7, 14 e 21 dias. RESULTADOS: Um aumento significativo na viabilidade de osteoblastos foi observado após a incubação dessas células com 0,01 e 0,1mM de ranelato de estrôncio por 24h, assim como um aumento importante na proliferação celular com a dose de 0,01 mM no período de 24h. A BMP2 aumentou de forma significativa nas duas concentrações da droga utilizadas no período de 24 pelo ensaio de Western Blot. No ensaio para a dosagem de FAO no meio de cultura, foi observado aumento significativo de FAO após a incubação com 0,1mM de ranelato em 24 horas. No ensaio de Von Kossa foi observada aumento e aceleração da mineralização nas concentrações de 0,01 e 0,1 mM. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem um efeito positivo do ranelato de estrôncio na proliferação, viabilidade e ativação de osteoblastos, uma vez que aumentou a expressão de BMP e FAO pelos osteoblastos. Desse modo, estudos promissores podem ser realizados com o ranelato de estrôncio com o seu emprego na regeneração de defeitos ósseos.

Os carboidratos galactose, sorbitol e glicerol foram usados para se avaliar a capacidade de células in vitro de plantas em utilizar fontes alternativas de carbono em culturas de células em suspensão de três diferentes espécies (Bauhinia forficata Link, Curcuma zedoaria Roscoe e Phaseolus vulgaris). Culturas crescendo em sacarose como fonte de carbono foram usadas como controle. A sacarose foi a fonte de carbono que condicionou os melhores resultados de crescimento expressos em ganho de massa fresca e massa seca, bem como de acúmulo protéico para as três espécies testadas. O glicerol e o sorbitol não proporcionaram ganho significativo de massa fresca e nem de massa seca nas culturas de nenhuma das três espécies testadas, exceto um pequeno ganho de massa seca observado para B. forficata quando o glicerol foi empregado como fonte de carbono. A galactose proporcionou aumento de massa fresca e massa seca apenas em culturas de C. zedoaria e B. forficata, sendo que este aumento foi inferior ao proporcionado pela sacarose nas culturas das mesmas espécies. A análise da atividade das enzimas do metabolismo da sacarose indicou que culturas de células em suspensão de C. zedoaria e de P. vulgaris apresentam as duas vias de degradação da sacarose; a via clássica caracterizada pela atividade das enzimas invertases e hexoquinase e a via alternativa caracterizada pela atividade das enzimas sacarose sintase e UDP glicose pirofosforilase. A ausência de atividade da enzima sacarose sintase nas culturas de Bauhinia sugere que células em suspensão desta espécie degradam a sacarose apenas pela via clássica. / not available

Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Orientador: Christiane Pienna Soares / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Andreimar Martins Soares / Resumo: Diversos estudos buscam identificar compostos com atividade seletiva para celulas tumorais e que possuam mecanismo de acao para desencadear a apoptose. Dentre as substancias isoladas de Cryptocarya sp, algumas estirilpironas, como a goniotalamina, apresentam atividade antiproliferativa e apoptogenica em diferentes linhagens celulares. No presente estudo, foram avaliadas as atividades citotoxica e pro-apoptotica da estirilpirona (criptomoscatona D2) isolada de Cryptocarya mandioccana, em linhagens celulares de carcinoma cervical humano infectada por HPV (HeLa e SiHa), nao infectada (C33A) e fibroblasto pulmonar humano transformado pelo SV-40 (MRC-5). A atividade citotoxica foi avaliada pelo ensaio do MTT e a apoptose foi avaliada, respectivamente, pelos ensaios de anexina V e a expressao de bak/bcl-2, por citometria de fluxo. Para o ensaio do MTT, as celulas foram tratadas com estirilpirona (criptomoscatona D2) nas concentracoes de 15, 30, 60 e 90-ÊM por 6, 24 e 48 horas e por 6 horas com periodo de recuperacao de 24, 48 e 72 horas pos tratamento. Para os ensaios de apoptose, as celulas foram tratadas por 6 horas e periodo de recuperacao de 24, 48 e 72 horas. O tratamento com a estirilpirona (criptomoscatona D2) ocasionou elevada citotoxicidade dose-resposta e tempo-resposta em HeLa, SiHa, C33A e MRC-5. Embora nao haja diferenca estatisticamente significativa de citotoxicidade entre as linhagens, aparentemente a citotoxicidade foi maior em HeLa e C33A (tratamento de 24 e 48 horas) que em MRC-5 e SiHa. Ainda, no periodo de recuperacao, HeLa e SiHa aparentemente restabelecem sua capacidade proliferativa, que e diretamente proporcional ao tempo de recuperacao, enquanto o mesmo comportamento nao e observado em C33A. Ao avaliar a expressao de duas proteinas da via intrinseca de apoptose (bcl-2 e bak), nao foi observada modulacao dessa expressao entre as linhagens celulares, nas diferentes tempos de recuperação pos-tratamento. / Abstract: Several attempts have been made to identify chemical compounds with selective cytotoxicity against cancer cells and apoptosis trigger activity. Among the substances isolated from Cryptocarya sp, some styrylpyrones, such as goniothalamine, demonstrate antiproliferative and apoptotic activity in abroad human cell lines. In the present study, we evaluated the antiproliferative and apoptotic activities of the styrylpyrone (cryptomoschatone D2) isolated from Cryptocarya mandioccana in HPV-infected (HeLa and SiHa) and non-infected (C33A) human cervical carcinoma cell lines, and in human lung's fibroblast immortalized with SV-40 (MRC-5). The antiproliferative activity was evaluated by the MTT assay and the apoptotic activity was investigated by measuring the expression levels of annexin V and bak/bcl-2 by flow cytometry. In the MTT assay, cells were treated with styrylpyrone (cryptomoschatone D2) at a 15, 30, 60 or 90ìM concentration for 6, 24 or 48 hours as well as for 6 hours followed by a recovery posttreatment period of 24, 48 or 72 hours. In the apoptotic assays, cells were treated for 6 hours followed by a recovery posttreatment period of 24, 48 or 72 hours. High cytotoxicity (dose-response and time-response) was observed in HeLa, SiHa, C33A and MRC-5 cell lines. Although the styrylpyrone cytotoxicity was not significantly different among the cell lines tested, the citotoxicity was apparently higher in HeLa and C33A than MRC-5 and SiHa in the case of treatments for 24 or 48 hours. Moreover, HeLa and SiHa were able to recover their prolifetative status, which were directly proportional to the posttreatment recovery time. On the other hand, C33A did not demonstrate a similar posttreatment recovery. Despite the posttreatment recovery time, the expression of the apoptotic proteins bcl-2 and bak seems not to be modulated by the treatment. / Mestre

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6758_Dissertação Keyla versao final.pdf: 1894150 bytes, checksum: ca3a7c163bff7672d128661c46b8911c (MD5) Previous issue date: 2013-08-15 / A diarreia é a segunda causa de mortalidade em <5 anos e é responsável pela diminuição da produtividade na população economicamente ativa. Dentre os agentes infecciosos envolvidos, seis patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli (DEC) merecem destaque: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroemorrágica ou produtora de toxina de Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli de aderência difusa (DAEC). O objetivo deste estudo foi determinar a frequência dos patotipos de DEC e caracterizar fenotípica e genotipicamente EAEC, DAEC, aEPEC e E. coli chain-like adhesion (CLA) isolados de fezes indivíduos de todas as idades atendidos nas Unidades de Saúde do município de Vitória, ES, entre janeiro de 2008 e junho de 2011. Os isolados de E. coli foram submetidos à: (i) PCR para detecção dos genes eae, bfpA, aat, lt, st, ipaH, stx1 e stx2; (ii) hibridização de colônia com as sondas eae, aat e daaC; (iii) adesão em cultura de células HEp-2 para evidenciar padrão de aderência agregativa (AA), difusa (DA) e chain-like adhesion (CLA). PCR para detecção de genes de virulência foi realizado em isolados de EAEC, CLA, DAEC e aEPEC. Isolados de EAEC e CLA, foram submetidos a testes de formação de biofilme e de película. Foram obtidos 328 espécimes fecais e E. coli foi isolada de 85,7%. Os seguintes patotipos foram identificados: EAEC (18,3%), DAEC (11%), aEPEC (2,6%), ETEC (0,7%). CLA foi identificada em 4,9% e EIEC, tEPEC e STEC não foram detectados. Dos 60 isolados de EAEC (AA) (25% aat+ por PCR e 35% por hibridização), fímbrias de aderência agregativa foram evidenciadas em baixa frequência (aggA- 1,7%, aafA- 0%, agg3A- 11,7%, hdA- 8,3%). EAEC típica correspondeu a 31,7% dos isolados de EAEC (aggR+), e foram significantes nestas a formação de biofilme, escore 3+ de produção de película e presença dos genes aat, agg3A, hdA, aap, sat, pet, set1A e iucA. Todos os isolados CLA apresentaram o gene pet, 87,5%, foram aggR-, formaram película e nenhum produziu biofilme. Dentre dos 42 isolados de DAEC (DA), a sonda daaC detectou 52,4%. PCR evidenciou adesinas afa/Dr (daaD e afa) em 59,5% e adesina AIDA-I não foi encontrada, sugerindo que outras adesinas estejam envolvidas na adesão da DAEC. Isolados de DAEC afa/Dr + foram estatisticamente mais isolados de <5 anos. Em aEPEC, os genes da ilha de patogenicidade OI-122 pesquisados, nleE, efa1/lifA e paa foram evidenciados em 30% dos isolados, todos provenientes de <5 anos. Características de virulência de tEAEC e DAEC Afa/Dr sugerem que sejam subpopulações relacionadas com diarreia. CLA não parece ser variante de EAEC. Palavras-chave: Escherichia. coli, Adesão em cultura de células, Reação em cadeia pela polimerase, Hibridização de colônia, genes de virulência.