O objetivo do presente estudo foi avaliar a pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4%, em cultura de macrófagos da linhagem RAW 264.7, cultura primária de células da linhagem osteoblástica e em tecido subcutâneo de camundongos. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana desses materiais. Em cultura de macrófagos RAW 264.7 foram avaliados os seguintes aspectos: a viabilidade celular (Ensaio de MTT), propriedades imunoestimuladoras (dosagem de óxido nítrico) e propriedades antiinflamatórias (dosagem de óxido nítrico, TNF-α e IL-1α). Em cultura primária de células da linhagem osteoblástica foram avaliados viabilidade celular (períodos de 3, 7 e 10 dias), conteúdo de proteína total (Método de Lowry modificado nos períodos de 7 e 10 dias), atividade da fosfatase alcalina (liberação de timolftaleína nos períodos de 7 e 10 dias e in situ pelo método do Fast red), proteínas da matriz não-colágena (marcação por Imunofluorescência Indireta e Fluorescência Direta por meio da utilização da faloidina e DAPI, nos períodos de 3, 7 e 14 dias) e formações nodulares de matriz mineralizada (marcação pelo vermelho de Alizarina nos períodos de 3, 7 e 14 dias). A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar, sobre 2 microrganismos indicadores (Enterococcus faecalis e Kocuria rhizophila). A biocompatibilidade após implantanção de tubos de polietileno contendo as pastas no tecido subcutâneo de camundongos isogênicos Balb/c. Os dados numéricos foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, com nível de significância de 5%. Os resultados referentes à exposição das células da linhagem RAW 264.7 de macrófagos evidenciou baixa atividade imunoestimuladora da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina 0,4%, nas diferentes concentrações avaliadas. Por outro lado, pôde-se observar atividade antiinflamatória, com inibição na liberação de óxido nítrico e das citocinas (TNF-α e IL1-α), quando da utilização da associação hidróxido de cálcio e clorexidina na concentração de 25µg/ml. Resultados semelhantes ao controle foram observados após a avaliação da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4% em cultura primária de células da linhagem osteoblástica uma vez que os dados numéricos do conteúdo de proteína total, da quantidade de fosfatase alcalina e das formações nodulares de matriz mineralizada não foram estatisticamente diferentes (p>0,05). Em relação à caracterização morfológica das culturas primárias os resultados obtidos foram semelhantes quando comparou-se a pasta Calen®, associada ou não à clorexidina a 0,4%. Em relação à atividade antimicrobiana, a associação hidróxido de cálcio e clorexidina promoveu a formação de maiores halos de inibição (em mm), em relação ao Enterococcus faecalis, embora sem diferença estatística significante com os demais grupos avaliados (p>0,05). No tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos, a análise microscópica demonstrou ser esta associação biocompatível, com tecido circunjacente e reacional, apresentando fibrosamento discreto e semelhante ao tecido conjuntivo fibroso normal, aos 63 dias de avaliação, sem diferença estatística com grupo controle (p>0,05). Com base nas metodologias empregadas e nos resultados obtidos pode-se concluir que a adição da clorexidina não apresentou benefícios adicionais à pasta à base de hidróxido de cálcio. / The aim of this study was to evaluate the calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage, and mice subcutaneous tissue. Besides we evaluated the antimicrobial activity of those materials. In RAW 264.7 macrophages culture the followed aspects were evaluated: cellular viability (MTT assay), immunestimulatory (nitric oxide detection) and anti-inflammatory (nitric oxide, TNF-α and IL-1-α detection) properties. In primary cell culture of osteoblastic lineage we evaluated the cellular viability for 3, 7 and 10 days, total protein content (Lowry modified method for 7 and 10 days), alkalinic phosphatase activity (thymolphthalein liberation for 7 and 10 days, and in situ by Fast red method), extracellular matrix noncollagen protein (stained by indirect immunofluorescence and direct fluorescence by phalloidin and DAPI for 3, 7 and 14 days), and mineralized matrix nodular formation (stained by Alizarin red for 3, 7 and 14 days). Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion test with Enterococcus faecalis and Kocuria rhizophila as indicators, and the biocompatibility after polyethylene tubes with the paste implanted into Balb/c mice subcutaneous tissue. The data were statistically analyzed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn\'s post test, considering a level of significance of 5%. The results of macrophage RAW 264.7 cells lineage exposition showed low stimullatory activity for the different concentrations evaluated of calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. On the other hand, we could observe anti-inflammatory activity with inhibition of nitric oxide and cytokines quantification (TNF--α e IL1--α), after the use of 25-µg/ml calcium hydroxide associated to chlorhexidine (25-µg/ml). Same results to the control were observed after evaluation of Calen® paste associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage because the data of total protein content, alkaline phosphatase, and mineralized matrix nodular formation were not statistically different (p>0.05). In relation to the morphological characterization of primary culture, the results obtained were the same after comparison of Calen® paste, associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. About antimicrobial activity, the association Calcium hydroxide and chlorhexidine promoted formation of largest inhibition halo (in mm) for Enterococcus faecalis, but with no statistically significant with others evaluated groups (p>0.05). The microscopic analysis in mice conjunctive subcutaneous tissue demonstrated biocompatibility of that association with the around and reactional tissue, sowing a discret fibrosis, as well as the normal conjunctive fibrous tissue after 63 days of evaluation with no statistically difference with the control group (p>0.05). Based on the methodology used, and the results obtained in this work, we could conclude that the addition of chlorexidine showed no additional benefits to the calcium hydroxide-based paste.

As raízes de Pfaffia paniculata têm sido popularmente utilizadas com vários propósitos, assim como adjuvante na terapia contra o câncer. Recentemente demonstramos que as raízes pulverizadas de Pfaffia paniculata causam uma atenuação do crescimento do tumor de Ehrlich em sua forma ascítica. Os objetivos do presente estudo foram caracterizar os efeitos do extrato etanólico, resíduos aquoso ou butanólico de Pfaffia paniculata sobre o desenvolvimento do tumor de Ehrlich, assim como investigar seus possíveis mecanismos. Em um primeiro experimento, foi demonstrado que camundongos machos Swiss, portadores do tumor de Ehrlich ascítico, tratados com resíduo aquoso ou butanólico, apresentaram uma maior sobrevida em relação aos animais controle. Nos experimentos com o tumor na forma sólida ou ascítica, os animais receberam, diariamente, o resíduo butanólico por 16 dias (experimento com o tumor sólido) ou 15 dias (experimento com o tumor ascítico). No 8º dia de tratamento, foram inoculados com 2,5 x 106 células tumorais, no coxim plantar esquerdo, ou com 5,0 x 106 células tumorais, Intraperitonealmente. O tumor ascítico foi avaliado, 7 dias após a inoculação do tumor, pela quantificação do volume de fluído ascítico, concentração de células tumorais e número total de células tumorais. O tumor sólido foi avaliado pela mensuração diária das patas e pela morfometria da área de necrose em meio à massa tumoral em cortes corados por HE, e proliferação celular, por imunoistoquímica, 8 dias após a inoculação do tumor. Nesses experimentos, nenhum destes parâmetros avaliados apresentaram alterações nos camundongos tratados com este resíduo. A fim de se avaliar a toxicidade do resíduo butanólico, os animais foram tratados com este resíduo por 14 dias. Os animais tratados com este resíduo apresentaram uma discreta diminuição de ganho de peso. Não houve evidências de toxicidade hepática e renal, pela mensuração das atividades de enzimas indicativas de necrose e pelo exame histopatológico de figado e rim, onde não se observou necrose. Em outro experimento, alguns parâmetros da atividade macrofágica, 24 após a inoculação do tumor, foram avaliados, por citometria de fluxo. Os animais receberam o resíduo butanólico por 7 dias, e foram inoculados com 5 x 106 células tumorais, intraperitonealmente. O burst oxidativo ativado por Staphylococcus aureus foi menor em animais tratados com o resíduo, porém não foram observadas diferenças ma fagocitose e burst oxidativo espontâneo ou ativado por PMA. Por fim, estudos in vitro foram realizados. Os efeitos deste resíduo sobre a viabilidade, medido pelo ensaio do MTT, e sobre o ciclo celular, utilizando citometria de fluxo, de células do tumor de Ehrlich foram avaliados. As maiores concentrações do resíduo levaram a uma diminuição da viabilidade e um aumento de morte celular. Assim, o tratamento com este resíduo, in vivo, causou uma atenuação do desenvolvimento tumoral, provavelmente devido a uma diminuição na formação do fluído ascítico ou a morte celular. Os efeitos deste resíduo foram mais pronunciados em cultura celular. / The roots of Pfaffia paniculata have been popularly used for various purposes, as well as an adjuvant for cancer therapy. Recently we have shown that the powdered roots of Pfaffia paniculata promote an attenuation of the Ehrlich tumor growth in its ascitic form. The aims of the present study were to characterize the effects of the ethanolic extract, aqueous or butanolic residues of Pfaffia paniculata on Ehrlich tumor development in mice, as well as investigate its possible mechanisms. In a first experiment, it was shown that aqueous or butanolic residues-treated Swiss mice bearing Ehrlich ascites tumor presented a higher survival time than control animal. In the experiments with the tumor in its solid or ascitic forms, the animals were given, daily, the butanolic residue for 16 days (experiment with solid tumor) or 15 days (experiment with ascitic tumor). On the 8o day of treatment, they were inoculated with 2,5 x 106 tumor cells, on the left footpad, or with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The ascitic tumor was evaluated, 7 days after the inoculation of the tumor, by the quantification of the volume of the ascitic fluid, concentration of tumor cells and total number of tumor cells. The solid tumor was evaluated by the daily measurement of the footpads and morphometry of the necrosis within the tumor area on HE stained slices, and cell proliferation by immunohistochemistry, 8 days after the inoculation of the tumor. In these experiments, none of these parameters showed any alterations in mice treated with the residue. In order to evaluate the toxicity of butanolic residue, the animals were treated with this residue (200mg/Kg) for 14 days. The animals treated with the residue showed a discrete decrease on weight gain. There were no evidences of hepatic and renal toxicity, by measurement of enzymes activities of necrosis, and also lack of necrosis by histopathological analysis of liver and kidney. In another experiment, some parameters of macrofagic activity, 24 hours after the inoculation of tumor, were evalueted, by flow citometry. The animals received the butanolic residue for 7 days and then were inoculated with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The oxidative burst activated by Staphylococcus aureus was reduced on animals treated with the residue, but no differences on fagocytosis and spontaneous or oxidative burst esimulated by PMA were found. Finally, in vitro studies were performed. The effects of this residue on the cell viability, measured by the MTT assay, and on the cell cycle, by flow cytometry, in Ehrlich tumor cells were evaluated. The highest concentrations of the residue caused a decrease of the cell viability and an increase of death cell. Thus, the treatment with this residue, in vivo, caused an attenuation of the tumor development, likely due to a decrease in the ascitic fluid formation or cell death. The effects of this residue on cell death were more pronounced in cultured cells. These results point to a novel agent for the cancer therapy, but further studies must be performed to elucidate the mechanisms responsible for these effects.

O laser de baixa intensidade ou terapêutico promove a biomodulação das respostas reparadoras naturais de células pulpares como os odontoblastos, sendo uma estratégia de tratamento a ser utilizada na terapia pulpar. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o efeito da irradiação do laser terapêutico de arseniato de gálio e alumínio (GaAlAs) no comportamento da linhagem odontoblástica (MDPC-23) de camundongos. Células odontoblásticas foram plaqueadas na concentração de 104 células/poço (n=5) e submetidas às irradiações nos dias 0, 1, 2 e 3 após o plaqueamento. Foram avaliadas as doses de 0,2 e 1,0 J/cm2 e comparadas ao grupo controle não irradiado. Os parâmetros analisados foram proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total, atividade de fosfatase alcalina após 3, 7, 10 e 14 dias; detecção e quantificação de matriz mineralizada após 14 dias e quantificação do fator de crescimento VEGF no sobrenadante das culturas após 7 e 10 dias. Imunofluorescência para proteínas colágenas e não-colágenas após 3, 7 e 10 dias foi realizada para verificar sua expressão qualitativa nos grupos propostos. Os resultados mostraram que o laser não afetou a viabilidade celular que ficou acima dos 90% em todos os grupos e períodos experimentais. De modo geral, os grupos irradiados apresentaram redução na proliferação, maior conteúdo de proteína total e maior atividade de ALP em relação ao observado no grupo controle. A marcação com vermelho de alizarina mostrou maior quantidade de áreas nodulares de matriz calcificada no grupo irradiado com 0,2 J/cm2, dados comprovados pela análise quantitativa. Uma maior concentração de VEGF no sobrenadante da cultura foi observada no grupo irradiado com a menor dose. A imunofluorescência revelou que a menor dose favoreceu a secreção de proteínas colágenas e não colágenas Portanto, o laser de baixa potência, dentro dos parâmetros empregados, favoreceu a expressão do fenótipo odontoblástico. / Low-level laser therapy (LLLT) has been studied as a strategy to be used in pulp therapy through biomodulation of its cells, like odontoblasts. The purpose of this investigation was to evaluate the effect of biomodulation on odontoblastic cells using low-level GaAlAs laser. Odontoblastic cells were cultured in a concentration of 104 cells/well (n=5) and submitted to the energy fluencies of 0,2 and 1,0 J/cm2 and compared to control group. There were evaluated cell proliferation and viability, total protein content and alkaline phosphatase activity ( 3, 7, 10 and 14 days), as well as detection and quantification of mineralized nodules after 14 days and VEGF quantification after 7 and 10 days. Immunofluorescence for collagen and non-collagen proteins was performed to verify their qualitative expression in the proposed groups after 3, 7 and 10 days. The results showed that LLLT did not affect cell viability in all the experimental groups. The irradiated cultures presented reduction in the proliferation, higher total protein content and ALP activity compared to the control group. Staining with red alizarin showed greater amount of nodular areas of calcified matrix in the group irradiated with 0,2 J/cm2, data confirmed by quantitative analysis. It was also observed a higher concentration of VEGF in the culture of the cells irradiated with the lowest energy fluence as well as an enhancement of the secretion of collagen and non-collagen proteins revealed through immunofluorescence. It was concluded that therapy with LLLT favors the expression of odontoblastic phenotype.

O objetivo do estudo foi analisar a interação entre o laser de diodo de alta potência e a superfície radicular através da análise de: variação de temperatura (Fase A), morfologia superficial das raízes dentárias (Fase B), adesão e a proliferação de fibroblastos cultivados sobre estas superfícies (Fase C). Vinte e um dentes unirradiculares foram utilizados nas 3 fases dos experimentos. Os grupos experimentais foram: Grupo controle - só recebeu o tratamento inicial de raspagem e alisamento radicular; Grupo INT - recebeu o mesmo tratamento do controle seguido de irradiação com o laser de diodo de alta potência, com comprimento de onda de 808 nm e fibra óptica de 400 µm de diâmetro, posicionada paralela à superfície radicular no parâmetro de 1,5 W (597,1 W/cm 2 na ponta da fibra) durante 30 s no modo interrompido; e Grupo CW - onde foi usado o mesmo tratamento do grupo INT, porém com o laser no modo contínuo. Na fase A utilizaram-se termopares para monitorar a temperatura intrapulpar; na Fase B, microscopia eletrônica de varredura (MEV) das superfícies tratadas dos 3 grupos experimentais, e na Fase C, fibroblastos foram plaqueados sobre as superfícies tratadas e em eletromicrografias de varredura as células foram contadas em 24 (adesão), 48 e 72 h (proliferação) após o plaqueamento. A monitoração de temperatura demonstrou que, com os parâmetros utilizados, houve aumento de temperatura dentro dos limites biocompatíveis e que esse aumento foi significantemente maior no grupo CW do que no grupo INT. Nos grupos irradiados observou-se presença de smear-layer modificada, exibindo uma superfície com áreas de aspecto mais liso correspondendo às áreas de fusão e ressolidificação, entremeadas por zonas de aspecto mais corrugado. Túbulos dentinários abertos não foram observados. Os fibroblastos plaqueados sobre as superfícies irradiadas aderiram e aumentaram em número no decorrer do tempo experimental. As curvas de crescimento celular sobre as superfícies irradiadas com os dois modos do laser apresentaram comportamento biológico similar entre si e com o controle. Pode-se concluir, nas condições deste estudo, que o uso do laser de diodo de alta potência é seguro do ponto de vista térmico, e causa alterações morfológicas superficiais similares, independentemente dos modos de irradiação. Adicionalmente, essas superfícies radiculares irradiadas são biocompatíveis, possibilitando a adesão e a proliferação celular / The aim of this study was to analyze the interaction between the high power diode laser and the dental root surface through the temperature variation analysis (Step A), root surface morphological observation (Step B), adhesion and proliferation of fibroblasts cultured on the top of the root surfaces (Step C). Twenty-one uniradicular teeth were used in the 3 steps of the experiments. The experimental groups were, as follows: Control group - root planning and scaling using Gracey curets; INT group - the root surfaces received the same treatment as control group followed by laser irradiation (high power diode laser, wavelength 808 nm, 400 µm optical fiber used parallel to the root surface, 1,5 W for 30 s, 597,1 W/cm 2 ), and CW - treated as the INT group however in a continuous wave. For the step A thermocouples were used; for step B, scanning electron microscopy (SEM) of the treated root surfaces of the 3 experimental groups, and at the Step C, fibroblasts were plated on the top of the root surfaces, and in scanning electronmicrographs the attached cells were counted 24 (adhesion), 48 e 72 h (proliferation) after plating. The temperature monitorization showed that, with the parameters used, there was an increase in temperature within the biological safety limits and, this increase was significantly higher for the CW group. At the root surfaces of irradiated groups a modified smear-layer was observed exhibiting rough areas intermingled to smooth areas corresponding to areas of fusion and resolidification of dental hard tissues. Open dentinal tubules were not observed. The fibroblasts plated on the top of the irradiated surfaces adhered and proliferated throughout the experimental time (0 to 3 days). The growth curves of the irradiated groups, independently of the irradiation mode, showed biological behavior similar between them and with the control group. At the conditions of this study, we concluded that the use of high power diode laser for root surface conditioning is thermically safe and causes similar superficial morphological changes independently of the irradiation mode used. Additionally, these root surfaces are biocompatible because did not impair the cell adhesion and growth

INTRODUÇÃO: As alterações cromossômicas são a primeira suspeita etiológica em indivíduos com múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. Verifica-se que em alguns pacientes esse fenótipo está associado a alterações pigmentares como as manchas cutâneas. Porém, nem sempre o resultado do cariótipo em sangue periférico para esses pacientes revela alterações cromossômicas. Dessa forma, a análise cromossômica de outro tecido, como a cultura e cariotipagem dos fibroblastos da pele, torna-se importante para verificar a ocorrência de mosaicismo oculto que poderia explicar o fenótipo clínico. OBJETIVOS: Padronizar e implantar um protocolo para cultura de fibroblastos de pele humana, oriunda de manchas cutâneas de pacientes com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. Estabelecer o método de cariotipagem molecular de fibroblastos em tecido epitelial e realizar a correlação com o fenótipo. MÉTODOS: Os pacientes foram provenientes do ambulatório de Genética do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). Foram realizados cariótipos de fibroblastos de pele de 15 pacientes com cariótipo de sangue periférico normal, portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. A análise citogenética dos fibroblastos foi feita a partir de biópsia cutânea das manchas, seguida dos seguintes procedimentos: cultura de fibroblastos, processamento, cariotipagem por bandamento G e análise citogenética molecular. RESULTADOS: Dentre os 15 casos estudados, 8 apresentaram isocromosomo de 12p (síndrome de Pallister-Killian), 1 apresentou um mosaicismo sexual atípico e os outros 6 apresentaram resultado normal. CONCLUSÃO: A análise cromossômica de fibroblastos foi imprescindível para o diagnóstico de pacientes com manchas cutâneas associadas à múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. A abordagem diagnóstica adequada é fundamental para conduzir o tratamento de forma apropriada e para definir o prognóstico desses pacientes, sendo também imprescindível para a realização do aconselhamento genético / INTRODUCTION: Chromosomal aberrations are the first suspected etiology in individuals with multiple congenital anomalies, developmental delay and/or intellectual disability. This phenotype is sometimes associated with pigmentary skin anomalies. However, in some cases the peripheral blood cells karyotype is normal. Therefore, the cytogenetic analysis of other tissues such as culture and karyotyping of skin fibroblasts is important to verify the occurrence of cryptic mosaicism that may explain the clinical phenotype. OBJECTIVES: To standardize and set a protocol for culture of human skin fibroblasts. To perform molecular karyotyping of fibroblasts and establish the correlation with phenotype. METHODS: Patients were recruited from the outpatient clinic of the Genetics Unit of Instituto da Criança do Hospital das Clínicas d Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). The karyotypes of skin fibroblasts were performed in 15 patients with normal blood karyotype, presenting with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The cytogenetic analysis of fibroblasts was made from skin biopsy of the spots, followed by fibroblast culture, processing, karyotyping by G-banding analysis and molecular cytogenetics. RESULTS: Among the 15 cases studied, 8 showed isochromosome 12p (Pallister-Killian syndrome), 1 had atypical sexual mosaicism and the other 6 had normal results. CONCLUSION: The cytogenetic analysis of skin fibroblasts is crucial for the diagnosis of patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The proper diagnosis is fundamental for the appropriate treatment, to define prognosis for these patients and essential for the genetic counselling

O laser de baixa potência é utilizado no tratamento odontológico visando diminuir o tempo do reparo ósseo. O osteoblasto quando diferenciado pouco prolifera, são as células precursoras que o fazem. Células precursoras de osteoblastos exercem um papel essencial nesse processo e o sucesso da formação óssea depende da sua adesão, proliferação celular e diferenciação osteoblástica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a capacidade de adesão, proliferação e síntese de proteínas (proteína total e fosfatase alcalina), expressão do fenótipo osteoblástico (BSP, COL, OC e RUNX2) e formação de matriz mineralizada em células osteoblásticas derivadas da sutura palatina mediana de ratos e submetidos à disjunção ortopédica maxilar e aplicação de laser de baixa intensidade As-Ga-Al (DMC®-Laser de aplicação pontual, com λ = 830 ηm, 56 J/cm2). Após 24 horas, 48 horas e 7 dias da disjunção palatina e aplicação do laser de baixa potência, fragmentos ósseos da sutura palatina mediana foram submetidos à digestão enzimática para extração das células. As células foram cultivadas em garrafas T75 na presença de meio essencial mínimo suplementado com soro fetal bovino e substâncias que favorecem a diferenciação em osteoblastos: dexametasona, ácido ascórbico e β-glicerol fosfato (MTS 10%). Após confluência na superfície da garrafa, um número estimado de células (2 x 104/poço) foi transportado para as placas de cultura, com 24 poços. Os grupos não irradiados serviram como controles. A avaliação da proliferação celular dos animais sacrificados após expansão rápida da maxila e aplicação do laser de baixa potência indicou que o grupo tratado com laser teve um aumento no número de células assim como na atividade de fosfatase alcalina, na expressão gênica e na mineralização em todos os períodos estudados. Portanto os resultados obtidos indicam que o laser de diodo As-Ga-Al estimulou a formação de células osteoblásticas. Podemos concluir com esses resultados que a radiação do laser diodo de As-Ga-Al estimula a expressão do fenótipo osteoblástico em células derivadas do osso alveolar de ratos após expansão rápida da maxila. / The low-power laser is used in dental treatment to reduce the time of bone healing. Differentiated osteoblasts have poor proliferation. It is rather done by osteoblast cell precursors. Precursor cells of osteoblasts exert a key role in the process of bone formation and its success depends on its adhesion, proliferation and differentiation. The objectives of this study were to evaluate the ability of adhesion, proliferation and synthesis of proteins (total protein and alkaline phosphatase) of osteoblastic cells derived from palatine suture median of rats that underwent orthopedic maxillary disjunction and application of low-intensity laser As- Ga-Al (DMC® Laser-off of application, with λ = 830 ηm, 56 J/cm2), as well as the expression of the osteoblast phenotype (BSP, COL, OC and RUNX2) and the formation of mineralized matrix..After 24 hours, 48 hours and 7 days of the palate disjunction and application of the low-energy laser, bone fragments of the median palatine suture were submitted to enzyme digestion in order to extract the cells. The cells were grown in T75 bottles in the presence of minimum essential medium supplemented with fetal bovine serum and substances which favour the differentiation into osteoblasts: dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerol phosphate (10% MTS). After confluence on the surface of the cylinder, an estimated number of cells (2 x 104/poço) were transported to the culture plates with 24 wells. The non-irradiated groups served as controls. The assessment of cell proliferation in animals sacrificed after the rapid expansion of maxilla application of low-energy laser indicated that the group treated with laser had an increase in the number of cells as well as of the activity of alkaline phosphatase, gene expression and mineralization in all periods studied. Therefore, the results indicate that the laser diode of the As-Ga-Al stimulated formation of osteoblastic cells. We conclude that the radiation of the laser diode As-Ga-Al stimulates expression of osteoblast phenotype in cells derived from alveolar bone of rats after rapid expansion of the maxilla.

Os tecidos dentais apresentam-se como fontes abundantes e de fácil obtenção de células-tronco de diferentes tipos, como é o caso das células-tronco derivadas do epitélio dental, papila dental, ligamento periodontal e folículo dental que possuem origem ectomesenquimal oriundas da crista neural, com a exceção do epitélio dental que é oriundo do ectoderma. As células-tronco de polpa dentária humana (CTPD) expressam estavelmente marcadores de células-tronco adultas (CTA), CD105 e CD73 durante as passagens contínuas, e um grupo de antígenos estágios-específicos de superfície celular, SSEA-3, SSEA-4 e fatores de transcrição de células-tronco embrionárias (CTE) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 e Nanog. Além disso, estas células são capazes de se diferenciar in vitro em vários tipos de células e tecidos: cartilagem, osso, tecido neural, músculo liso e esquelético. Em suínos, modelo animal amplamente utilizado para o estudo de várias doenças encontradas em humanos, os dentes caninos possuem crescimento contínuo que pode ser uma característica bastante interessante quando pensamos em células-tronco. Dessa forma, o estudo das células de polpa dentária desse animal merece destaque. Neste trabalho visamos estabelecer o cultivo e a caracterização de células-tronco derivadas da polpa dentária dos dentes caninos dos suínos com crescimento contínuo (PDS) e dos dentes molares visando um estudo comparativo. O cultivo das células-tronco de polpa dentária de canino e molar foi estabelecido e de acordo com os nossos resultados podemos dizer que as células-tronco de polpa dentária de suíno são de fácil obtenção, já que o dente é descartado após o abate do animal e não tem nenhum valor comercial. Até o momento não observamos diferenças relacionados ao crescimento contínuo dos dentes caninos e as células-troncos isoladas possuem características mesenquimais como era esperado. E ainda, os resultados obtidos neste trabalho poderão contribuir para aquisição de uma nova fonte de células-tronco, cuja obtenção em abatedouros poderá ser contínua, aumento assim a quantidade podendo ser utilizada na Terapia Celular. / The dental tissue presents itself as an easy and abundant source to obtain stem cells of different types, such as stem cells derived from dental epithelium, dental papilla, periodontal ligament and dental follicle origin that have originated from ectomesenquimal neural crest, with the exception of dental epithelium that arises from the ectoderm. Stem cells from human dental pulp (TCDC) stably express markers of adult stem cells (CTA), CD105 and CD73 during continuous passages, and a group of stage-specific antigens of cell surface SSEA-3, SSEA-4 and transcription factors of embryonic stem cells (ESC) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 and Nanog. Furthermore, these cells are able to differentiate in vitro into cartilage, bone, neural tissue, skeletal and smooth muscle. In pigs, an animal model widely used for the study of several human diseases, the canine teeth continues to grow and can be a very interesting feature regarding stem cells. Thus, the study of dental pulp cells in this species is worthy consideration. The aim of this work was to establish the cultivation and characterization of stem cells derived from dental pulp from pigs canine teeth with continuous growth (PDS) and the molar teeth, seeking a comparative study. The cultivation of stem cells from canine dental pulp and molar teeth have been established and, according to our results, we can say that stem cells from porcine dental pulp are easy to obtain, since the tooth is discarded when the animal is slaughtered and has no commercial value. So far no differences related to the continued growth of the canine teeth were observed and the isolated stem cells presented mesenchymal characteristics as expected. The results obtained in this study may contribute to the acquisition of a new source of stem cells, which can be obtained continuously in slaughterhouses, thus increasing the amount of samples to be used in cell therapy.

A PMAH é uma causa rara de síndrome de Cushing, cuja real prevalência parece subestimada. O processo fisiopatológico que culminaria com a PMAH ainda não foi totalmente elucidado. A produção de cortisol mediada por receptores acoplados a proteína G (ectópicos/tópicos da adrenal) geralmente hiperexpressos, bem como a regulação autócrina/parácrina do ACTH ectópico em clusters celulares dos macronódulos adrenais têm sido considerados como parte importante do processo fisiopatológico da PMAH. Além destes mecanismos, recentemente, foi demonstrado a associação de variantes patogênicas germinativas/somáticas no gene ARMC5 como uma causa frequente da PMAH. Os estudos funcionais que caracterizaram o ARMC5 como gene supressor de tumor e potencialmente envolvido na hiperplasia adrenal nodular e sua produção de cortisol foram realizados em células H295R, derivadas de carcinoma adrenocortical. Células estas que não representam em tese um modelo ideal para o estudo de uma doença absolutamente benigna. Objetivos: Obtenção e caracterização morfofuncional de culturas de células obtidas de nódulos adrenais de pacientes submetidos à adrenalectomia com diagnóstico histopatológico compatível com PMAH, como um modelo biológico para a análise funcional do gene ARMC5. Métodos: Foram utilizadas 13 culturas de células de PMAH caracterizadas do ponto de vista morfofuncional e molecular para as análises funcionais do gene ARMC5. Resultados: As culturas de PMAH apresentaram mutações germinativas no ARMC5 identificadas em 8 das 13 culturas analisadas, associadas ou não a segundos eventos moleculares. As culturas de células de PMAH apresentaram receptores eutópicos e ectópicos de uma maneira heterogênea e a presença de ACTH ectópico em clusters de células. O silenciamento do ARMC5 nas células de PMAH levou à diminuição da esteroidogênese, ao aumento de CCNE1 e ao número de células viáveis após 96h. Quando hiperexpresso, o gene ARMC5 induziu apoptose e necrose celular após 12h, diminuindo a viabilidade das células de células de PMAH. Conclusões: Legitimamos a importância do papel do ARMC5 na esteroidogênese relacionada à PMAH, bem como sua função favorecendo a apoptose celular; além disso, pela primeira vez, detectamos o envolvimento do ARMC5 na regulação do ciclo celular e proliferação, cuja importância será explorada em estudos futuros. / Background: PMAH is a rare cause of Cushings syndrome, with an apparent underestimated prevalence. The pathophysiology of PMAH is not yet fully understood, however the participation of aberrant receptors and intra-adrenal ACTH in the hyperplastic tissue are considered mechanisms that regulate hypercortisolism in PMAH. Additionally, germline ARMC5 mutations have been described as the most frequent genetic abnormality found in patients diagnosed with PMAH. Previous functional studies analyzed ARMC5 role using H295R cells, a cell line of adrenocortical carcinoma. Objectives: In this study we investigated the role of ARMC5 in cell cultures obtained from PMAH nodules. Results: We observed the presence of mutations in ARMC5 gene in 8 out of 13 PMAH cell cultures analyzed. We observed the presence of aberrant receptors and intra-adrenal ectopic ACTH, regardless the presence of mutations. ARMC5 silencing in non-mutated PMAH cell cultures decreased steroidogenesis-related genes and increased CCNE1 mRNA expression and the number of viable cells without affecting cell viability. Additionally, ARMC5 overexpression induced cell death in PMAH mutated cell cultures, thereby decreasing cell viability. Conclusions: We confirmed the role of ARMC5 as an important pro-apoptotic protein involved in PMAH-related steroidogenesis. We also report for the first time the possible involvement of ARMC5 in controlling proliferation and regulating cell cycle in PMAH cell cultures, which need to be further explored.

Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro sobre diferentes nanotopografias de titânio (Ti) funcionalizadas com o fator de crescimento GDF-5. Células osteogênicas derivadas de calvária de ratos recém-nascidos foram plaqueadas e cultivadas por até 14 dias sobre superfícies de discos de Ti: 1) Controle (usinada e polida); 2) 30′ (com nanotopografia de nanoporos menores, obtida por condicionamento em solução de H2SO4/H2O2 por 30 min); 3) 30′+GDF-5 (nanotopografia de 30′, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL); 4) 4h (com nanotopografia de nanoporos maiores, obtida por condicionamento em H2SO4/H2O2 por 4 h); 5) 4h+GDF-5 (nanotopografia de 4h, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL). A adsorção de GDF-5 foi realizada a 4 ºC por 12 h no dia anterior ao plaqueamento das células. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para a viabilidade celular em 1, 3 e 7 dias. Em 3 dias, as células estavam aderidas e espraiadas sobre todas as superfícies e acúmulos extracelulares extensos de OPN foram encontrados apenas sobre superfícies com nanotopografia de 4h e de 30′+GDF-5. A expressão de RNAm para RUNX2 e ALP foi maior em 7 dias se comparada a 10 dias, sendo os menores valores encontrados para o grupo 4h+GDF-5. A expressão de OPN aumentou de 7 para 10 dias, exceto para 30′+GDF-5, que se manteve inalterada. Enquanto que os níveis de RNAm para BSP aumentaram de 7 para 10 dias no Controle, redução significativa foi observada para os demais grupos, exceto para 30′, em que se manteve constante. Culturas crescidas sobre nanotopografias funcionalizadas com GDF-5 exibiram os maiores valores de atividade de ALP em 10 dias e de áreas de matriz mineralizada/acúmulos de cálcio em 14 dias. Em conclusão, a funcionalização de nanotopografias de Ti com GDF-5 pode acelerar e/ou aumentar a expressão do fenótipo osteogênico in vitro. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular responses at the biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the development of the osteogenic phenotype in vitro on titanium (Ti) surface nanotopographies functionalized with growth and differentiation factor-5 (GDF-5). Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn rat calvarial bone and grown for periods of up to 14 days on the following Ti disc surfaces: 1) Machined; 2) 30′ Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min; 3) 30′+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C); 4) 4h Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h; 5) 4h+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C). At 4 h, nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited a significantly lower proportion of spread cells. At days 1, 3 and 7 no major differences in terms of cell viability were detected among groups. At day 3, epifluorescence revealed large extracellular OPN accumulation only for 30′+GDF-5, 4h and 4h+GDF-5. Real time PCR analysis showed for GDF-5 groups: i) lower mRNA levels for RUNX2, ALP e BSP at day 10; ii) higher RUNX2 and ALP expression at day 7 compared with day 10, with the lowest levels for 4h+GDF-5; iii) increased OPN levels from day 7 to day 10, except for 30′+GDF-5, which remained unaltered. Cultures grown on nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited significantly higher values for ALP activity at 10 days and enhanced mineralized matrix formation at day 14. In conclusion, surface functionalization of Ti nanotopographies with GDF-5 can accelerate and/or increase the expression of the osteogenic phenotype in vitro.

O presente trabalho teve como objetivo investigar o tipo de morte induzida nas linhagens de carcinoma mamário humano MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-), pela fração isolada do extrato de folhas de barbatimão. As folhas de Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) foram coletadas, secas e utilizadas para o preparo do extrato acetônico, que foi particionado com acetato de etila. A fração aquosa remanescente foi liofilizada e fracionada por cromatografia em Sephadex LH 20. As frações coletadas foram submetidas à cromatografia em camada delgada e a fração eluída com metanol a 100% foi utilizada nos experimentos, por apresentar o maior conteúdo de proantocianidinas. A análise por HPLC permitiu verificar que a fração isolada contem procianidina dimérica B1, epigalocatequina-3-O-galato e ácido gálico. As células de adenocarcinoma mamário MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-) foram tratadas por 24 h com diferentes concentrações da fração (5 – 160 μg/mL) e com ciclofosfamida a 550 μg/mL. O tratamento das células com a fração isolada induziu redução da viabilidade celular e alterações morfológicas nas duas linhagens, incluindo perda da morfologia celular típica, condensação da cromatina e diminuição da área das colônias e das células. A DE50 para células MCF-7 foi de 12,35 μg/mL e para as células MDA-MB-435 foi de 34,43 μg/mL, sendo as células MCF-7 mais sensíveis ao tratamento. A análise por Western blotting mostrou que tratamento o com a fração induziu aumento da expressão de Bax e diminuição de Bcl-2 nas células, indicando apoptose. Houve ainda aumento da expressão de caspase-9, caspase-3-ativa e caspase-8, além da diminuição da expressão da caspase-3 e pró-caspase-8. Estas proteínas estão envolvidas na via intrínseca de indução da apoptose. Foi observado também aumento de proteínas marcadoras da autofagia, LC-3 nas duas linhagens e beclin-1 nas células MDA-MB-435. Assim, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a fração isolada do extrato de folhas de barbatimão induziu a morte por apoptose com autofagia nas células MCF-7 e MDA-MB-435. Estes resultados são importantes, pois foram demonstradas a citotoxicidade e indução de morte das células MDA-MB-435, que são ER-, além das células MCF-7 (ER+). Tendo em vista que não há tratamento curativo para tumor mamário ER-, bem como para ER+ em estágio avançado, a fração isolada parece ser candidata promissora para o desenvolvimento de fármaco para o tratamento e prevenção do câncer de mama. / The aim of the present work was to investigate the type of cell death induced in the MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) human mammary carcinoma cell lineages by the fraction isolated from the barbatimão leaf extract. Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) leaves were collected, dried and the acetone extract was prepared. It was partitioned with ethyl acetate and the remaining aqueous solution was lyophilized and fractioned by Sephadex LH 20 chromatography. The collected fractions were analyzed by thin layer chromatography and the fraction eluted with 100 % methanol was used in the experiments, because it showed the highest proanthocyanidin content. The HPLC analysis showed that the isolated fraction is composed by procyanidin dimmer B1, epigallocatechin-3-O-gallate and gallic acid. The MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) cells were treated for 24 h with different concentrations of the fraction (5 – 160 μg/mL) and with 550 μg/mL cyclophosphamide. The cell treatment with the isolated fraction induced cell viability reduction and morphologic alterations in both cell lines, including cell typical shape loss, chromatin condensation and a decrease in the colony and cell area. The ED50 dose for MCF-7 cells was 12.35 μg/mL and the ED50 dose for MDA-MB-435 cells was 34.43 μg/mL, being the MCF-7 cells more sensitive to the fraction treatment. The Western blotting analysis showed that the fraction treatment induced an increase in the Bax and a decrease in the Bcl-2 cell expression that is indicative of apoptosis. There were also an increase in the caspase-9, caspase-3-active and caspase-8 expression and a decrease in the caspase-3 and pro-caspase-8 expression. These proteins are involved in induction of the intrinsic apoptosis pathway. It was also observed an increase in the expression of autophagy protein markers: LC-3 expression increased in both cell lines and beclin-1 expression increased only in the treated MDA-MB-435. The results of the present work allowed the conclusion that the isolated fraction from barbatimão leaf extract induced apoptotic death with autophagy in both cell lines, MCF-7 and MDA-MB-435. These results are important because it was demonstrated the cytotoxic effect and the ER- MDA-MB-435 cell death induction, besides the cytotoxicity to ER+ MCF-7 cells. As there is no a curative treatment for ER- mammary tumors as well as ER+ tumors in an advanced stage, the isolated fraction seems to be a promising candidate to a drug development for breast cancer treatment and prevention. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES