Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-07-31T17:39:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Daniela Huller.pdf: 7341256 bytes, checksum: bc3fb4b0384732e16979ef2cc0bd4ae3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:39:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Daniela Huller.pdf: 7341256 bytes, checksum: bc3fb4b0384732e16979ef2cc0bd4ae3 (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A utilização do ouro na forma nanoparticulada vem sendo uma forma promissora alternativa para o tratamento de condições inflamatórias. Devido as suas propriedades anti-inflamatórias se justifica a possibilidade do emprego das nanopartículas de ouro (AuNPs) no tratamento de inflamações pulpares. Entretanto, para utilização na Odontologia, pouco se sabe sobre o efeito real das AuNPs sobre a polpa dental e seus componentes celulares. Os objetivos deste trabalho foram: caracterizar as nanopartículas de ouro sintetizadas, avaliar seu potencial citotóxico, atividade antimicrobiana e anti-inflamatória. Para a caracterização, foram realizados testes de espectroscopia de absorção no ultravioleta-visível (UV–VIS), microscopia eletrônica de varredura (FEG–SEM) e potencial Zeta. O potencial citotóxico foi avaliado em cultura de células indiferenciadas da polpa dental humana. Os grupos experimentais avaliados foram: nanopartículas de ouro reduzidas com citrato de sódio (Au@CS); nanopartículas de ouro revestidas com polivinilpirrolidona (Au@CS+PVP), ambas em diferentes concentrações (100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,12 μg/mL); citrato de sódio (agente redutor e surfactante) e PVP (agente estabilizante). Para avaliar o potencial citotóxico, foram analisados parâmetros de viabilidade, morfologia e potencial de reparo celular. A capacidade antimicrobiana foi analisada através dos testes de difusão em ágar e microdiluição. O potencial anti-inflamatório foi avaliado através do efeito das AuNPs na liberação de mediadores inflamatórios (TNF-α) em macrófagos. Os dados para as variáveis quantitativas paramétricas foram analisados usando a análise de variância de uma via (ANOVA), e aplicado pós-teste de Tukey. Os dados quantitativos não paramétricos e qualitativos ordinais foram analisados usando a análise de Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn. Significância estatística foi estabelecida em p<0,05. Os resultados mostraram que as dispersões coloidais de nanopartículas sintetizadas possuem formato esférico, diâmetro médio aproximado de 20 nm e são altamente estáveis. Os grupos Au@CS e Au@CS+PVP, nas concentrações analisadas, não apresentaram potencial citotóxico para as células indiferenciadas da polpa dental humana, sem redução da viabilidade celular e alteração morfológica para os períodos analisados. As nanopartículas não interferiram na proliferação e migração celular, mas apresentaram aumento na quantidade de proteínas para as menores concentrações de Au@CS+PVP. As nanopartículas de ouro nas concentrações testadas não apresentaram halos de inibição ou redução do crescimento microbiano de maneira expressiva. As Au@CS demonstraram potencial anti-inflamatório em sua maior concentração avaliada (100 μg/mL) e as Au@CS+PVP nas duas maiores concentrações (50 e 100 μg/mL). Os resultados obtidos sugerem que, nas condições experimentais do trabalho aqui apresentado, as Au@CS e Au@CS+PVP não foram citotóxicas e apresentam potencial anti-inflamatório discreto. As Au@CS não apresentam potencial antimicrobiano. / The use of gold in nanoparticulate form has been an promising alternative way to treat inflammatory conditions. Due to its anti-inflammatory properties, the possibility of the use of gold nanoparticles (AuNPs) in the treatment of pulpal inflammation is justified. However, for use in dentistry, little is known about the actual effect of AuNPs on dental pulp and its cellular components. The objectives of this study were: to characterize the synthesized gold nanoparticles, to evaluate their cytotoxic potential, antimicrobial and anti-inflammatory activity. For the characterization, were performed ultraviolet-visible absorption spectroscopy (UV-VIS), Scanning Electron Microscopy (FEG–SEM) and Zeta potential. The cytotoxic potential was evaluated in culture of undifferentiated cells of the human dental pulp. The experimental groups evaluated were: gold nanoparticles reduced with sodium citrate (Au@CS); gold nanoparticles coated with polyvinylpyrrolidone (Au@CS+PVP), both at different concentrations (100; 50; 25; 12,5; 6,25 and 3,12 μg/mL); sodium citrate (reducing agent and surfactant) and PVP (stabilizing agent). To evaluate the cytotoxic potential, parameters of viability, morphology and cell repair potential were analyzed. The antimicrobial capacity was analyzed through agar diffusion test and microdilution. The anti-inflammatory potential was evaluated through the effect of AuNPs on the release of inflammatory mediators (TNF-α) in macrophages. Data for the parametric quantitative variables were analyzed using one-way variance analysis (ANOVA) and Tukey's post-test. Non-parametric quantitative data and ordinal qualitative data were analyzed using Kruskal-Wallis analysis with Dunn's post-test. Statistical significance was set at p<0,05. The results showed that the colloidal dispersions of synthesized nanoparticles have a spherical shape, average diameter of approximately 20 nm and are highly stable. The groups Au@CS and Au@CS+PVP, in the evaluated concentrations, showed no cytotoxic potential for the undifferentiated cells of the human dental pulp, with no reduction of cell viability and morphological alteration for the analyzed periods. The nanoparticles did not interfere in cell proliferation and migration, but showed an increase in the amount of proteins for the lowest concentrations of Au@CS+PVP. Nanoparticles of gold at the concentrations evaluated did not present halos of inhibition or reduction of microbial growth in an expressive way. Au@CS showed anti-inflammatory potential at its highest concentration (100 μg/mL) and Au@CS+PVP at the two highest concentrations (50 and 100 μg/mL). The results suggest that, in the experimental conditions of the study presented here, Au@CS and Au@CS+PVP were not cytotoxic and have a discrete anti-inflammatory potential. Au@CS did not present antimicrobial potential.

O estabelecimento e perfeito funcionamento da placenta são fatores dependentes da intensa vascularização ocorrida no órgão. Os processos de vasculogênese e angiogênese placentária são modulados por diversos fatores, incluindo o VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico). Apesar da importância do VEGF e bFGF durante a vascularização estar estabelecida, vários estudos indicam a participação desses fatores de crescimento como moduladores locais em outras funções fisiológicas, como por exemplo o controle da produção hormonal em tecidos esteroidogênicos. Animais clonados podem apresentar alterações na expressão de determinados genes durante seu desenvolvimento, o que pode alterar a função placentária. Os objetivos deste estudo são determinar a localização tecidual do VEGF, bFGF e seus receptores na placenta bovina e avaliar a influência destes fatores de crescimento sobre a produção de progesterona placentária em bovinos não clonados e clonados. Placentomas de 90, 150 e 210 dias de gestação foram obtidos em abatedouro e placentônios de gestações aos 270 dias provenientes de bovinos clonados e não clonados foram coletados após cesarianas. As amostras foram fixadas em formol tamponado 4%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes foram submetidos a imuno-histoquímica para posterior localização das proteínas do VEGF, bFGF e seus receptores. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 cavidades. Os fatores foram adicionados em concentrações de 10 e 50 &#951;g/ml de bFGF e VEGF, respectivamente. Amostras de meio de cultura e as células dos grupos controle, bFGF, VEGF e VEGF mais bFGF foram coletadas 24, 48 e 96 horas após a adição dos fatores. A progesterona foi dosada por radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os dados foram analisados utilizando-se o programa estatístico SAS (Statistical Analysis System), as diferenças estatísticas encontradas foram comparadas pelo teste de variação múltipla de Duncan. O VEGF, bFGF e seus receptores foram localizados em células do epitélio e estroma maternos e fetais e células endoteliais vasculares em bovinos não clonados e clonados. As células placentárias apresentaram diferentes capacidades de síntese de progesterona ao longo da gestação. Aos 90 e 210 dias de gestação o VEGF estimulou a produção de progesterona, enquanto aos 270 dias de gestação o fator inibiu a produção deste hormônio. O bFGF estimulou a produção de progesterona pelas células placentárias aos 90 dias de gestação. A adição dos dois fatores de crescimento conjuntamente determinou um estímulo na produção de progesterona aos 210 dias de gestação. A produção de progesterona pelas células de bovinos clonados foi semelhante àquela observada em células de bovinos não clonados na mesma idade gestacional e os fatores de crescimento não influenciaram essa produção. Conclui-se que o VEGF e bFGF, atuando localmente no tecido placentário, funcionam como moduladores do processo de esteroidogênese, influenciando de maneira tempo-dependente a produção de progesterona deste órgão. / Placental establishment and function are dependent on intense vascularization. Placental vasculogenesis and angiogenesis are modulated by several factors, including VEGF (vascular endothelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor). Although the role of VEGF and bFGF during vascularization is already well established, some studies have indicated the participation of these growth factors as local modulators in other physiological functions, such as control of hormonal production in steroidogenic tissues. Cloned animals may exhibit alterations in gene expression during development modifying placental function. The aims of this study are to determine the tissue localization of VEGF, bFGF and their receptors in the bovine placenta and to evaluate the influence of bFGF and VEGF on placental progesterone production in non-cloned and cloned bovines. Placentomes from days 90, 150 and 210 of pregnancy were obtained at local slaughterhouse and placentomes from cloned and non-cloned gestations at 270 days were obtained after cesarean sections. Samples were fixed in 4% buffered formol solution, dehydrated and included in paraffin. Sections were subimitted to immunohistochemistry for subsequent localization of VEGF, bFGF and their receptors proteins. Under aseptic conditions, cells were mechanically dispersed and then cultivated in a 96-well plate. Growth factors were added at concentrations of 10 and 50 &#951;g/ml for bFGF and VEGF, respectively. Samples of culture medium and cells from control, bFGF, VEGF and bFGF plus VEGF groups were collected 24, 48 and 96 hours after growth factor addition. Progesterone concentrations were assessed by radioimmunoassay and protein content was measured by Lowry?s method. Data were analyzed by SAS (Statistical Analysis System) program, significant differences were compared by Duncan?s range multiple test. VEGF, bFGF and their receptors were localized in maternal and fetal epithelial and stromal cells and vascular endothelial cells during pregnancy in non-cloned animals and in cloned bovine placenta at 270 days of pregnancy. Bovine placental cells were able to produce different amounts of progesterone during pregnancy. Growth factors were able to influence progesterone production in placental cells only after 24 hours in culture. At 90 and 210 days of pregnancy VEGF stimulated progesterone production, while at 270 days of pregnancy the growth factor inhibited production of this hormone. bFGF stimulated progesterone production in placental cells from 90 days of pregnancy. Both growth factors together determined an increase in progesterone production in placental cells from 210 days of pregnancy. Progesterone production in placental cells from cloned cattle is similar when compared with non-cloned placental cells at the same gestational age and growth factors did not influence progesterone production in these cells. VEGF and bFGF, acting locally in the placental tissue, are modulators of the steroidogenic process, influencing in a time-dependent manner the progesterone production in this organ.

Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma. / The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.

Muitas doenças genéticas permanecem ainda sem sua causa definida. A dificuldade de estudar algumas dessas doenças remontam a problemática da obtenção de material clinico, sugerindo situações extremas para a coleta, dependendo da patologia. Além disso, é necessário que se obtenha material genético em quantidade adequada para os ensaios e que, de preferência, venha de uma fonte celular que não esteja diretamente exposta a mutações. Nesse trabalho estabelecemos o cultivo inédito das células epiteliais de mucosa oral como modelo celular para o estudo de doenças genéticas. As amostras foram coletadas através da raspagem da mucosa oral de voluntários saudáveis. Após estabelecimento do cultivo, as células foram caracterizadas em relação à sua morfologia através de técnica de colorações, ensaios para analisar a viabilidade celular, microscopia eletrônica de transmissão e varredura, analise da expressão de marcadores por imunocitoquímica e por RT-PCR. Os resultados revelaram a expressão de marcadores como citoquetaratinas 4, 13 e 18, conexinas e marcadores de ciclo celular, como PCNA3 e GAPDH. A expressão de marcadores de pluripotência foi negativa, já que essas células são adultas e totalmente diferenciadas. Com a realização deste trabalho, concluímos que essas células são um bom modelo para o estudo de doenças genéticas e futuras terapias gênicas. / Many genetic diseases are still without their cause defined. The difficulty in studying these diseases back to the problem of obtaining clinical material, suggesting extreme situations for the collection, depending on the pathology. Moreover, it is necessary to obtain genetic material in sufficient quantities for testing and preferably come from a cellular source that is not directly exposed to mutations. This work established for the first time, a protocol for culturing of epithelial cells from oral mucosa as a cellular model for studying genetic diseases. The samples were collected by scraping the oral mucosa of healthy volunteers. After the establishment of cultivation, cells were characterized for their morphology by staining technique, tests to analyze cell viability, transmission electron microscopy and scanning, analysis of expression of markers by immunocytochemistry and RT-PCR. The results revealed the expression of markers such as citoquetaratinas 4, 13 and 18, connexins and cell cycle markers, as PCNA3 and GAPDH. The expression of pluripotency markers were negative, as these cells are adult and fully differentiated. With this work, we conclude that these cells are a good model for studying genetic diseases and future gene therapies.

Resumo: Este estudo teve como objetivo geral utilizar células da linhagem MDPC-23 em testes de citotoxicidade de materiais e na investigação dos efeitos de proteínas bioativas no estímulo da síntese de componentes da matriz dentinária. Os objetivos específicos foram avaliar o efeito citotóxico de soluções utilizadas na lavagem de paredes cavitárias e de materiais dentários recomendados para aplicação em dentina sobre células de linhagem odontoblástica MDPC-23. Também foi intuito avaliar o efeito do concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelho sobre a expressão de genes específicos. Este trabalho, apresentado na forma de três artigos científicos, utilizou a técnica de MTT para avaliar o efeito citotóxico de soluções de CLX em variadas concentrações sobre as células MDPC-23. Esta técnica foi utilizada também para a investigação do efeito citotóxico de três diferentes cimentos de ionômero de vidro modificados por resina: Vitrebond (VB); Vitremer (VM); e RelyX Luting Cement (RX), associada ao teste de implantação destes materiais resinosos no tecido conjuntivo subcutâneo de ratos. A expressão dos genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina nas células expostas ao concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelhos foi avaliada por RT-PCR. Os resultados demonstraram que a CLX é citotóxica às células da linhagem MDPC-23 de maneira dose-dependente. Também foi demonstrado que os cimentos de ionômero de vidro são biocompatíveis ao tecido conjuntivo subcutâneo de ratos, apesar de apresentarem diferentes graus de citotoxicidade sobre as células odontoblastóides. As proteínas bioativas extraídas da dentina de coelhos apresentaram efeito estimulatório na expressão de genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina. Pode-se concluir que as células MDPC-23 são um modelo que pode ser utilizado nos testes de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The general aim of this in vitro and in vivo study was to evaluate the cytotoxicity of rinsing solutions and dental materials as well as to determine the expression of genes related with the dentinogenesis. The specific objectives were to evaluate the cytotoxicity effects of rinsing solutions used to clean cavity walls and dental materials used to restore dental cavities. The effects of EDTA soluble dentin proteins (members of TGF-â superfamily) on specific gene espression was also evaluated. For this porpose three scientific papers were prepared: 1) MTT assay was employed to investigate the cytotoxic effects of different concentrations of chlorhexidine to MDPC-23 cells as well as to; 2) to determine the cytotoxicity of three different resin-modified glass-ionomer cements (RMGIC): Vitrebond (VB); Vitremer (VM); and RelyX Luting Cement (VM). The results of this in vitro study was compared to the in vivo study in which RMGICs were implanted into the connective tissue of rats; 3) Type-1 collagen and fibronectin gene expression on cells exposed to EDTAsoluble dentin proteins was assessed by means of semi-quantitative RT-PCR. The results demonstrated that chlorhexidine is cytotoxic to MDPC-23 cells in a dose-dependent way. It was also demonstrated that RMGICs are biocompatible following implantation into surgical pockets prepared in the dorsal connective tissue of rats in spite of the different degrees of in vitro cytotoxicity presented by these materials to MDPC-23 cells. The stimulatory effects of the bioactive molecules on the expression of the genes that encodes to type-1 collagen and fibronectin was clearly demonstrated. Based on the experimental conditions, it was concluded that MDPC-23 cells are suitable model to be used on cytotoxicity tests of dental materials and rinsing solutions as well as to evaluate the dentinogenesis mechanisms. / Orientador: Carlos Alberto de Souza Costa / Coorientador: Claudio Miguel da Costa Neto / Banca: Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Mestre

As raízes de Pfaffia paniculata têm sido popularmente utilizadas com vários propósitos, assim como adjuvante na terapia contra o câncer. Recentemente demonstramos que as raízes pulverizadas de Pfaffia paniculata causam uma atenuação do crescimento do tumor de Ehrlich em sua forma ascítica. Os objetivos do presente estudo foram caracterizar os efeitos do extrato etanólico, resíduos aquoso ou butanólico de Pfaffia paniculata sobre o desenvolvimento do tumor de Ehrlich, assim como investigar seus possíveis mecanismos. Em um primeiro experimento, foi demonstrado que camundongos machos Swiss, portadores do tumor de Ehrlich ascítico, tratados com resíduo aquoso ou butanólico, apresentaram uma maior sobrevida em relação aos animais controle. Nos experimentos com o tumor na forma sólida ou ascítica, os animais receberam, diariamente, o resíduo butanólico por 16 dias (experimento com o tumor sólido) ou 15 dias (experimento com o tumor ascítico). No 8º dia de tratamento, foram inoculados com 2,5 x 106 células tumorais, no coxim plantar esquerdo, ou com 5,0 x 106 células tumorais, Intraperitonealmente. O tumor ascítico foi avaliado, 7 dias após a inoculação do tumor, pela quantificação do volume de fluído ascítico, concentração de células tumorais e número total de células tumorais. O tumor sólido foi avaliado pela mensuração diária das patas e pela morfometria da área de necrose em meio à massa tumoral em cortes corados por HE, e proliferação celular, por imunoistoquímica, 8 dias após a inoculação do tumor. Nesses experimentos, nenhum destes parâmetros avaliados apresentaram alterações nos camundongos tratados com este resíduo. A fim de se avaliar a toxicidade do resíduo butanólico, os animais foram tratados com este resíduo por 14 dias. Os animais tratados com este resíduo apresentaram uma discreta diminuição de ganho de peso. Não houve evidências de toxicidade hepática e renal, pela mensuração das atividades de enzimas indicativas de necrose e pelo exame histopatológico de figado e rim, onde não se observou necrose. Em outro experimento, alguns parâmetros da atividade macrofágica, 24 após a inoculação do tumor, foram avaliados, por citometria de fluxo. Os animais receberam o resíduo butanólico por 7 dias, e foram inoculados com 5 x 106 células tumorais, intraperitonealmente. O burst oxidativo ativado por Staphylococcus aureus foi menor em animais tratados com o resíduo, porém não foram observadas diferenças ma fagocitose e burst oxidativo espontâneo ou ativado por PMA. Por fim, estudos in vitro foram realizados. Os efeitos deste resíduo sobre a viabilidade, medido pelo ensaio do MTT, e sobre o ciclo celular, utilizando citometria de fluxo, de células do tumor de Ehrlich foram avaliados. As maiores concentrações do resíduo levaram a uma diminuição da viabilidade e um aumento de morte celular. Assim, o tratamento com este resíduo, in vivo, causou uma atenuação do desenvolvimento tumoral, provavelmente devido a uma diminuição na formação do fluído ascítico ou a morte celular. Os efeitos deste resíduo foram mais pronunciados em cultura celular. / The roots of Pfaffia paniculata have been popularly used for various purposes, as well as an adjuvant for cancer therapy. Recently we have shown that the powdered roots of Pfaffia paniculata promote an attenuation of the Ehrlich tumor growth in its ascitic form. The aims of the present study were to characterize the effects of the ethanolic extract, aqueous or butanolic residues of Pfaffia paniculata on Ehrlich tumor development in mice, as well as investigate its possible mechanisms. In a first experiment, it was shown that aqueous or butanolic residues-treated Swiss mice bearing Ehrlich ascites tumor presented a higher survival time than control animal. In the experiments with the tumor in its solid or ascitic forms, the animals were given, daily, the butanolic residue for 16 days (experiment with solid tumor) or 15 days (experiment with ascitic tumor). On the 8o day of treatment, they were inoculated with 2,5 x 106 tumor cells, on the left footpad, or with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The ascitic tumor was evaluated, 7 days after the inoculation of the tumor, by the quantification of the volume of the ascitic fluid, concentration of tumor cells and total number of tumor cells. The solid tumor was evaluated by the daily measurement of the footpads and morphometry of the necrosis within the tumor area on HE stained slices, and cell proliferation by immunohistochemistry, 8 days after the inoculation of the tumor. In these experiments, none of these parameters showed any alterations in mice treated with the residue. In order to evaluate the toxicity of butanolic residue, the animals were treated with this residue (200mg/Kg) for 14 days. The animals treated with the residue showed a discrete decrease on weight gain. There were no evidences of hepatic and renal toxicity, by measurement of enzymes activities of necrosis, and also lack of necrosis by histopathological analysis of liver and kidney. In another experiment, some parameters of macrofagic activity, 24 hours after the inoculation of tumor, were evalueted, by flow citometry. The animals received the butanolic residue for 7 days and then were inoculated with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The oxidative burst activated by Staphylococcus aureus was reduced on animals treated with the residue, but no differences on fagocytosis and spontaneous or oxidative burst esimulated by PMA were found. Finally, in vitro studies were performed. The effects of this residue on the cell viability, measured by the MTT assay, and on the cell cycle, by flow cytometry, in Ehrlich tumor cells were evaluated. The highest concentrations of the residue caused a decrease of the cell viability and an increase of death cell. Thus, the treatment with this residue, in vivo, caused an attenuation of the tumor development, likely due to a decrease in the ascitic fluid formation or cell death. The effects of this residue on cell death were more pronounced in cultured cells. These results point to a novel agent for the cancer therapy, but further studies must be performed to elucidate the mechanisms responsible for these effects.

INTRODUÇÃO: As alterações cromossômicas são a primeira suspeita etiológica em indivíduos com múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. Verifica-se que em alguns pacientes esse fenótipo está associado a alterações pigmentares como as manchas cutâneas. Porém, nem sempre o resultado do cariótipo em sangue periférico para esses pacientes revela alterações cromossômicas. Dessa forma, a análise cromossômica de outro tecido, como a cultura e cariotipagem dos fibroblastos da pele, torna-se importante para verificar a ocorrência de mosaicismo oculto que poderia explicar o fenótipo clínico. OBJETIVOS: Padronizar e implantar um protocolo para cultura de fibroblastos de pele humana, oriunda de manchas cutâneas de pacientes com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. Estabelecer o método de cariotipagem molecular de fibroblastos em tecido epitelial e realizar a correlação com o fenótipo. MÉTODOS: Os pacientes foram provenientes do ambulatório de Genética do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). Foram realizados cariótipos de fibroblastos de pele de 15 pacientes com cariótipo de sangue periférico normal, portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. A análise citogenética dos fibroblastos foi feita a partir de biópsia cutânea das manchas, seguida dos seguintes procedimentos: cultura de fibroblastos, processamento, cariotipagem por bandamento G e análise citogenética molecular. RESULTADOS: Dentre os 15 casos estudados, 8 apresentaram isocromosomo de 12p (síndrome de Pallister-Killian), 1 apresentou um mosaicismo sexual atípico e os outros 6 apresentaram resultado normal. CONCLUSÃO: A análise cromossômica de fibroblastos foi imprescindível para o diagnóstico de pacientes com manchas cutâneas associadas à múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. A abordagem diagnóstica adequada é fundamental para conduzir o tratamento de forma apropriada e para definir o prognóstico desses pacientes, sendo também imprescindível para a realização do aconselhamento genético / INTRODUCTION: Chromosomal aberrations are the first suspected etiology in individuals with multiple congenital anomalies, developmental delay and/or intellectual disability. This phenotype is sometimes associated with pigmentary skin anomalies. However, in some cases the peripheral blood cells karyotype is normal. Therefore, the cytogenetic analysis of other tissues such as culture and karyotyping of skin fibroblasts is important to verify the occurrence of cryptic mosaicism that may explain the clinical phenotype. OBJECTIVES: To standardize and set a protocol for culture of human skin fibroblasts. To perform molecular karyotyping of fibroblasts and establish the correlation with phenotype. METHODS: Patients were recruited from the outpatient clinic of the Genetics Unit of Instituto da Criança do Hospital das Clínicas d Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). The karyotypes of skin fibroblasts were performed in 15 patients with normal blood karyotype, presenting with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The cytogenetic analysis of fibroblasts was made from skin biopsy of the spots, followed by fibroblast culture, processing, karyotyping by G-banding analysis and molecular cytogenetics. RESULTS: Among the 15 cases studied, 8 showed isochromosome 12p (Pallister-Killian syndrome), 1 had atypical sexual mosaicism and the other 6 had normal results. CONCLUSION: The cytogenetic analysis of skin fibroblasts is crucial for the diagnosis of patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The proper diagnosis is fundamental for the appropriate treatment, to define prognosis for these patients and essential for the genetic counselling

Lodos de esgoto são resíduos do tratamento do esgoto doméstico, considerados ricos em macronutrientes e matéria orgânica, podendo também apresentar contaminação por substâncias químicas e patógenos. Sua utilização na agricultura é uma das alternativas interessantes para sua disposição final. Entretanto, a presença de contaminantes, dentre eles microrganismos patogênicos podem limitar e orientar sua aplicação. Os vírus entéricos, dentre os quais se inclui o gênero Enterovirus, são potenciais contaminantes microbianos presentes no lodo de esgoto. Esses organismos são capazes de sobreviver por meses em águas e solos e sua presença no ambiente pode trazer prejuízos à saúde da população exposta aos mesmos. O objetivo do presente estudo foi de analisar a ocorrência de Enterovirus em amostras de lodo de esgoto de seis diferentes ETEs do Estado de São Paulo, avaliar o desempenho do método analítico para a detecção desses organismos e verificar se as concentrações médias obtidas atendem à legislação. Foram coletadas um total de 35 amostras no período de fevereiro de 2009 a dezembro de 2009. As análises dos Enterovirus foram realizadas pelo ensaio de plaqueamento em cultura de células RD segundo método EPA /625/R-092/013. Os resultados obtidos foram que Enterovirus estiveram presentes em 83 por cento das amostras analisadas, com concentrações que variaram de não detectado (ND) a 12,50 UFP/gST. As taxas de recuperação obtidas variaram de 0,20 por cento a 68,50 por cento . Conclui-se que das amostras analisadas 31 por cento atendem o estabelecido pela Resolução CONAMA 375/2006 / Sewage Sludge is a waste generated from wastewater treatment and is considered besides rich in macronutrients and organic matter, contaminated with pathogen and chemical substances. The usage of sludge in agriculture has been considered an interesting option. Nevertheless, the presence of contaminates such as pathogenic organisms can lead to usage limitations. Enteric viruses in wich are included enterovirus genera, a potential sludge contaminants. These organisms are able to survive for months in water and soil and their presence can bring public health concerns. The aim of this study was to analyse the occurrence of Enterovirus in samples of sewage sludge from six sewage plant treatment located in São Paulo State, to assess the method performance (recovery rate) in detecting these organisms and to verify the results obtained meet the standard established by the law. A total of 35 samples were collected spanning February to December 2009. The analyses were carried out according to method EPA/625/R-092/013. Enterovirus were present in 83 per cent of samples examined with concentration varied from not detected (ND) to 12.5 PFU/gTS. The recovery rate varied from 0,2 per cent to 68,50¨ per cent . This study showed that 31 per cent of analyzed samples met the standard established by Resolução CONAMA 375/2006

Estas células, cultivadas em meio de cultura MEMα suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, entre a 10ª e 15ª passagem, foram submetidas a déficit nutricional com SFB 1% a 1 hora ou 24 horas antes da irradiação (protocolos A ou B, respectivamente). O meio foi mantido com suplementação de SFB 1% durante a irradiação e ao longo do tempo experimental nos grupos de I a IV, enquanto que para os grupos de V a VIII, o meio foi trocado para MEMα suplementado com SFB 10%. As células foram irradiadas com laser vermelho (660 nm) nas seguintes dosimetrias: 2,5 J/cm2 (grupos I e V), 5,0 J/cm2 (grupos II e VI) e 7,5 J/cm2 (grupos III e VII). As células não irradiadas constituíram os controles negativo (grupo IV) e positivo (grupo VIII). A avaliação da citotoxicidade/integridada da membrana celular foi realizada pela quantificação da desidrogenase lática (LDH) no meio de cultura após a irradiação. A viabilidade celular foi avaliada pelo método MTT 24, 48 e 72 horas após a irradiação. Os dados foram submetidos ao teste ANOVA a 2 critérios seguido pelo teste de Tukey (P<0,05). Os níveis de LDH no meio de cultura em que as SHED eram mantidas foram semelhantes quando comparados os protocolos A e B para a mesma densidade de energia e mesma concentração de SFB no momento da irradiação. No protocolo A, as células estavam mais viáveis 24 horas após a irradiação independente da densidade de energia, já no protocolo B, não houve alteração na viabilidade celular nos grupos IV (controle negativo), V, VI, VII e VIII (controle positivo) ao longo do tempo. Portanto, a indução de estresse celular por meio da suplementação do meio de cultura com SFB 1%, uma hora antes da irradiação, foi mais favorável para a manutenção da viabilidade de SHED após a irradiação, sem alterar os níveis de LDH extracelular, em comparação com os resultados após déficit nutricional por 24 horas. / The purpose of the present study was to analyze in vitro the effects of different nutritional deficit conditions to induce the state of cellular stress, prior to irradiation with different dosimetries of Low Level Laser Therapy (LLLT), on the biomodulation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells, cultured in MEMα culture medium supplemented with 10% FBS, between the 10th and 15th passage, were subjected to nutritional deficit with 1% FBS one hour or 24 hours prior to irradiation (protocols A or B, respectively). In both protocols, cells were irradiated with red laser (660 nm) in the following dosimetries: 2.5 J/cm2 (groups I and V), 5.0 J/cm2 (groups II and VI) and 7.5 J/cm2 (groups III and VII). Non-irradiated cells constituted the negative (group IV) and positive (group VIII) controls. Evaluation of citotoxicity/integrity of cellular membrane was performed by the quantification of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium after irradiation. Cell viability was assessed by MTT method 24, 48 and 72 hours after irradiation. Data were submitted to two-way ANOVA followed by Tukey test (P<0.05). The levels of LDH at the culture medium where SHED were grown were similar when compared protocols A and B for the same energy density and same concentration of FBS during irradiation. In protocol A, cells were more viable 24 hours after irradiation, irrespective of the energy density, while in protocol B, there was no alteration in cell viability in groups IV (negative control), V, VI, VII and VIII (positive control) over time. Therefore, the induction of cellular stress by culture medium supplementation with 1% FBS, one hour prior to irradiation, was more favorable for maintaining SHED viability after irradiation, with no alteration in the levels of extracellular LDH, in comparison with the results after 24-hour nutritional deficit.

O sucesso do tratamento com implantes osseointegráveis dependente do processo de reparo da ferida e do potencial osteogênico das células. Com o objetivo de aumentar a formação óssea na superfície dos implantes, vários tratamentos têm sido propostos, entre eles, a terapia com laser de baixa intensidade. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito do laser diodo de Arseneto-Gálio-Alumínio (AsGaAl) em culturas osteogênicas humanas crescidas sobre titânio. Após exposição das culturas, aos 3 e 7 dias, a uma dose de 3 J/cm2, foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) proliferação celular aos 10 e 14 dias; 2) atividade de fosfatase alcalina (ALP) em 10, 14 e 17 dias; 3) formação de matriz mineralizada em 17 dias; 4) imunolocalização de proteínas não-colágenas e do antígeno nuclear Ki-67 por fluorescência indireta em 8, 10, 14 e 17 dias; 5) expressão de genes relacionados ao desenvolvimento do fenótipo osteoblástico aos 14 dias. Os resultados dos ensaios de proliferação celular mostraram que a radiação laser aumentou a proliferação de 10 para 14 dias, mas tanto a atividade de ALP como a formação de matriz mineralizada aparentemente não foram afetadas. A análise das culturas por epifluorescência mostrou que as culturas controle e irradiadas apresentaram comportamento distintos. Aos 14 dias, foi demonstrado que a exposição à radiação laser, na dose utilizada, promoveu aumento na expressão relativa dos genes ALP, OC, BSP, BMP-7 e OPG e redução dos níveis de expressão de Runx2 e osteopontina, mas não afetou a expressão gênica de COL I, RANK-L e ICAM. As culturas irradiadas apresentaram áreas sem células após 24 h da última irradiação, que posteriormente foram repovoadas por células mais proliferativas e menos diferenciadas. Em conclusão, os resultados indicam que a radiação do laser diodo de AsGaAl estimula a expressão do fenótipo osteoblástico de culturas osteogênicas humanas crescidas sobre titânio. / The success of treatment with osseointegrated implants depends on wound healing and the osteogenic potential of cells. Aimed at increasing bone formation onto implant surfaces, several treatments have been proposed and low-intensity laser therapy is one of them. Thus, the purpose of this study was to investigate the effect of the Gallium-Aluminum-Arsenic (GaAlAr) diode laser on human osteogenic cultures grown on titanium. After irradiation of osteogenic cultures with 3 J/cm2 of GaAlAr laser at the days 3 and 7, the following parameters were evaluated: 1) cell proliferation at 10 and 14 days; 2) alkaline phosphatase activity (ALP) at 10 days; 3) mineralized matrix formation at day 17, 4) non-collagenous bone proteins and nuclear antigen Ki-67 immunolocalization by indirect fluorescence at 8, 10, 14 and 17 days; and 5) Expressions of a panel of genes related to osteoblastic phenotype at day 14. Apparently cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation were not significantly different between irradiated and control cultures in any period. Epifluorescence revealed that control and irradiated cultures had presented different behaviors. At 24 h after irradiation procedures, irradiated cultures displayed areas with no cells, which were repopulated later on by proliferative and apparently less-differentiated cells. Laser radiation increased relative gene expression of ALP, OC, BSP, BMP-7, and OPG; reduced the gene expression of Runx2 and OPN; and did not affect the expression of COL-1, RANK-L and ICAM. Altogether these results indicated that the GaAlAr laser stimulates the expression of osteoblastic phenotype of human osteogenic culture cells grown on titanium.