Muitas doenças genéticas permanecem ainda sem sua causa definida. A dificuldade de estudar algumas dessas doenças remontam a problemática da obtenção de material clinico, sugerindo situações extremas para a coleta, dependendo da patologia. Além disso, é necessário que se obtenha material genético em quantidade adequada para os ensaios e que, de preferência, venha de uma fonte celular que não esteja diretamente exposta a mutações. Nesse trabalho estabelecemos o cultivo inédito das células epiteliais de mucosa oral como modelo celular para o estudo de doenças genéticas. As amostras foram coletadas através da raspagem da mucosa oral de voluntários saudáveis. Após estabelecimento do cultivo, as células foram caracterizadas em relação à sua morfologia através de técnica de colorações, ensaios para analisar a viabilidade celular, microscopia eletrônica de transmissão e varredura, analise da expressão de marcadores por imunocitoquímica e por RT-PCR. Os resultados revelaram a expressão de marcadores como citoquetaratinas 4, 13 e 18, conexinas e marcadores de ciclo celular, como PCNA3 e GAPDH. A expressão de marcadores de pluripotência foi negativa, já que essas células são adultas e totalmente diferenciadas. Com a realização deste trabalho, concluímos que essas células são um bom modelo para o estudo de doenças genéticas e futuras terapias gênicas. / Many genetic diseases are still without their cause defined. The difficulty in studying these diseases back to the problem of obtaining clinical material, suggesting extreme situations for the collection, depending on the pathology. Moreover, it is necessary to obtain genetic material in sufficient quantities for testing and preferably come from a cellular source that is not directly exposed to mutations. This work established for the first time, a protocol for culturing of epithelial cells from oral mucosa as a cellular model for studying genetic diseases. The samples were collected by scraping the oral mucosa of healthy volunteers. After the establishment of cultivation, cells were characterized for their morphology by staining technique, tests to analyze cell viability, transmission electron microscopy and scanning, analysis of expression of markers by immunocytochemistry and RT-PCR. The results revealed the expression of markers such as citoquetaratinas 4, 13 and 18, connexins and cell cycle markers, as PCNA3 and GAPDH. The expression of pluripotency markers were negative, as these cells are adult and fully differentiated. With this work, we conclude that these cells are a good model for studying genetic diseases and future gene therapies.

Orientadores: Albina Messias De Almeida Milani Altemani, Elizabeth Ferreira Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:06:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montalli_VictorAngeloMartins_D.pdf: 4723030 bytes, checksum: 1764455ec3666d02c7e74ee7c326caed (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As lesões salivares tumorais compostas por dupla população celular (epitelial e mioepitelial) são consideradas originárias do ducto intercalado e estas lesões são subdivididas em diversas entidades que apresentam sobreposição morfológica, com delimitações entre elas nem sempre nítidas. Entre as neoplasias benignas estão o adenoma pleomórfico (AP) e o adenoma de células basais (ACB). Recentemente foi descrita uma nova entidade tumoral benigna, com composição epitelial e mioepitelial, denominada de lesão do ducto intercalado (LDI). Diante disso, o nosso primeiro objetivo foi analisar os perfis morfológicos e imuno-histoquímicos de LDIs e ACBs classificados em tubulares (ACB-T) e não tubulares (ACB-NT) para verificar se as LDIs e ACB-Ts representam entidades distintas. Ainda, dado o papel crítico da célula mioepitelial na morfogênese das lesões tumorais salivares histogeneticamente relacionadas ao ducto intercalado, nosso segundo objetivo foi avaliar in vitro a influência de fatores do microambiente tumoral (proteínas da matriz extracelular e fatores de crescimento) sobre a morfologia, viabilidade e proliferação de células mioepiteliais advindas de AP. Para a análise morfológica e imuno-histoquímica, foram estudados oito casos de LDIs, nove ACBs-T e 19 ACBs-NT. Todos os ACB-T continham áreas LDI-like, enquanto nos ACB-NT estas eram raras e escassas. As células luminais das LDIs e ACBs-T exibiram positividade para CK7, lisozima, S100 e DOG1. No grupo ACB-NT, poucas células luminais mostraram tal expressão, sendo principalmente positivas para CK14. As células mioepiteliais das LDIs, ACB-T e ACB-NT foram positivas para CK14, calponina, AML e p63, mas essas eram mais numerosas nos ACBs. No estudo in vitro, a morfologia e diferenciação das células mioepiteliais foram avaliadas qualitativamente por imunofluorescência indireta (expressão da vimentina e AML, respectivamente). As células mioepiteliais exibiram morfologia poliédrica em todas as matrizes, independentemente da suplementação do fator de crescimento. AML foi imunoexpressa de forma heterogênea nas células mioepiteliais, porém houve aumento da expressão desta proteína quando acrescentado o TGF- ?1, independentemente do tipo de matriz usada. TGF- ?1 também aumentou significantemente a viabilidade das células mioepiteliais cultivadas na matriz fibronectina. Conclusões: as LDI, ACB-T e ACB-NT formam um continuum de lesões onde as LDIs estão estreitamente relacionadas com o ACB-T, visto que em ambos o imunofenótipo das células luminais e mioepiteliais é semelhante àquele observado nos ductos intercalados. A principal diferença entre LDI e ACB-T é a quantidade de células mioepiteliais, que é maior no último. Além disso, nossos resultados indicam que pelo menos alguns ACBs podem surgir via LDI. Os estudos em cultura de células sugerem que as diferentes matrizes celulares não influenciam a morfologia e diferenciação da célula mioepitelial. Dentre os fatores de crescimento estudados apenas TGF- ?1 associou-se com aumento da expressão de AML (diferenciação celular) e aumentou significantemente a viabilidade celular associado à matriz fibronectina / Abstract: Salivary tumor lesions composed of dual cell population (epithelial and myoepithelial) are considered to originate from the intercalated duct. These lesions are subdivided into several entities that share morphological features. Among the benign tumors are pleomorphic adenomas (PA) and basal cell adenoma (BCA). Recently, a new entity was described that is a benign tumor with epithelial and myoepithelial composition, called intercalated duct lesion (IDL). Our first objective was to analyze the morphological and immunohistochemical profiles of IDLs and BCAs classified into tubular (T-BCA) and non-tubular subtypes (NT-BCA), to determine whether or not IDL and tubular BCA represent distinct entities. Also, given the critical role of myoepithelial cells in the morphogenesis of the salivary tumor lesions histogenetically related to the intercalated duct, our second objective was to evaluate in vitro the influence of tumor microenvironment factors (extracellular matrix proteins and growth factors) on the morphology, viability and proliferation of myoepithelial cells arisen from PA . Eight IDLs, nine tubular BCAs and 19 non-tubular BCAs were studied by immunohistochemical technique. All tubular BCAs contained IDL-like areas, which represented 20-70% of the tumor. In non-tubular BCA, IDL-like areas were occasional and small (<5%). One patient presented IDLs, tubular BCAs and IDL/tubular BCA combined lesions. Luminal ductal cells of IDLs and tubular BCAs exhibited positivity for CK7, lysozyme, S100 and DOG1. In the non-tubular BCA group, few luminal cells exhibited such immunoprofile; they were mainly CK14-positive. Basal/myoepithelial cells of IDLs, tubular BCAs and non-tubular BCAs were positive for CK14, calponin, ?-SMA and p63; they were more numerous in BCA lesions. The in vitro study analyzed morphology and differentiation of myoepithelial cells by vimentin and SMA expressions, respectively, which were qualitatively assessed using indirect immunofluorescence. Myoepithelial cells showed polyhedral morphology in all extra cellular matrixes regardless of the supplementation of growth factors. These cells expressed SMA heterogeneously but when TGF- ?1 was added such expression increased. This modification did not show relationship with the type of extracellular matix. The viability of myoepithelial cells cultured on fibronectin matrix increased significantly with addition of TGF - ?1. Conclusions: IDL, tubular BCA and non-tubular BCA form a continuum of lesions in which IDLs are related closely to tubular BCA. In both, the immunoprofile of luminal and myoepithelial cells recapitulates the normal intercalated duct. The difference between the adenoma-like subset of IDLs and tubular BCA rests mainly on the larger numbers of myoepithelial cells in the latter. Our findings indicate that at least some BCAs can arise via IDLs. The cell culture studies suggest that the different matrixes do not influence the morphology and differentiation of myoepithelial cells. Among the growth factors studied, only TGF - ?1 was associated with an increased expression of SMA (cell differentiation) and a significant increase of the cellular viability associated with the fibronectin matrix / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreoliRisso_MarilisaFerruda_M.pdf: 14754073 bytes, checksum: 6e3b6aa9d09a03a1f2873ad414c83bdf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas / Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p<0, 0001) in fresh samples. The thawed group showed more entropy (p=ns) and contrast (p=0, 0167) demonstrating that a directional trend in the collagen fibers was only observed in the fresh group. Gene expression results suggested that cryopreservation could interfere in a positive manner with osteogenic differentiation, and negatively on adipogenic and chondrogenic lineages. Collagen network tridimensional architecture was negatively modulated by cryopreservation, confirmed by SHG analysis, which could interfere with the desirable collagen mechanical properties, important for the maintenance of articular cartilage in cell based therapy. SHG analysis has become an important tool for better evaluate collagen fibers / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

O estabelecimento e perfeito funcionamento da placenta são fatores dependentes da intensa vascularização ocorrida no órgão. Os processos de vasculogênese e angiogênese placentária são modulados por diversos fatores, incluindo o VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico). Apesar da importância do VEGF e bFGF durante a vascularização estar estabelecida, vários estudos indicam a participação desses fatores de crescimento como moduladores locais em outras funções fisiológicas, como por exemplo o controle da produção hormonal em tecidos esteroidogênicos. Animais clonados podem apresentar alterações na expressão de determinados genes durante seu desenvolvimento, o que pode alterar a função placentária. Os objetivos deste estudo são determinar a localização tecidual do VEGF, bFGF e seus receptores na placenta bovina e avaliar a influência destes fatores de crescimento sobre a produção de progesterona placentária em bovinos não clonados e clonados. Placentomas de 90, 150 e 210 dias de gestação foram obtidos em abatedouro e placentônios de gestações aos 270 dias provenientes de bovinos clonados e não clonados foram coletados após cesarianas. As amostras foram fixadas em formol tamponado 4%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes foram submetidos a imuno-histoquímica para posterior localização das proteínas do VEGF, bFGF e seus receptores. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 cavidades. Os fatores foram adicionados em concentrações de 10 e 50 &#951;g/ml de bFGF e VEGF, respectivamente. Amostras de meio de cultura e as células dos grupos controle, bFGF, VEGF e VEGF mais bFGF foram coletadas 24, 48 e 96 horas após a adição dos fatores. A progesterona foi dosada por radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os dados foram analisados utilizando-se o programa estatístico SAS (Statistical Analysis System), as diferenças estatísticas encontradas foram comparadas pelo teste de variação múltipla de Duncan. O VEGF, bFGF e seus receptores foram localizados em células do epitélio e estroma maternos e fetais e células endoteliais vasculares em bovinos não clonados e clonados. As células placentárias apresentaram diferentes capacidades de síntese de progesterona ao longo da gestação. Aos 90 e 210 dias de gestação o VEGF estimulou a produção de progesterona, enquanto aos 270 dias de gestação o fator inibiu a produção deste hormônio. O bFGF estimulou a produção de progesterona pelas células placentárias aos 90 dias de gestação. A adição dos dois fatores de crescimento conjuntamente determinou um estímulo na produção de progesterona aos 210 dias de gestação. A produção de progesterona pelas células de bovinos clonados foi semelhante àquela observada em células de bovinos não clonados na mesma idade gestacional e os fatores de crescimento não influenciaram essa produção. Conclui-se que o VEGF e bFGF, atuando localmente no tecido placentário, funcionam como moduladores do processo de esteroidogênese, influenciando de maneira tempo-dependente a produção de progesterona deste órgão. / Placental establishment and function are dependent on intense vascularization. Placental vasculogenesis and angiogenesis are modulated by several factors, including VEGF (vascular endothelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor). Although the role of VEGF and bFGF during vascularization is already well established, some studies have indicated the participation of these growth factors as local modulators in other physiological functions, such as control of hormonal production in steroidogenic tissues. Cloned animals may exhibit alterations in gene expression during development modifying placental function. The aims of this study are to determine the tissue localization of VEGF, bFGF and their receptors in the bovine placenta and to evaluate the influence of bFGF and VEGF on placental progesterone production in non-cloned and cloned bovines. Placentomes from days 90, 150 and 210 of pregnancy were obtained at local slaughterhouse and placentomes from cloned and non-cloned gestations at 270 days were obtained after cesarean sections. Samples were fixed in 4% buffered formol solution, dehydrated and included in paraffin. Sections were subimitted to immunohistochemistry for subsequent localization of VEGF, bFGF and their receptors proteins. Under aseptic conditions, cells were mechanically dispersed and then cultivated in a 96-well plate. Growth factors were added at concentrations of 10 and 50 &#951;g/ml for bFGF and VEGF, respectively. Samples of culture medium and cells from control, bFGF, VEGF and bFGF plus VEGF groups were collected 24, 48 and 96 hours after growth factor addition. Progesterone concentrations were assessed by radioimmunoassay and protein content was measured by Lowry?s method. Data were analyzed by SAS (Statistical Analysis System) program, significant differences were compared by Duncan?s range multiple test. VEGF, bFGF and their receptors were localized in maternal and fetal epithelial and stromal cells and vascular endothelial cells during pregnancy in non-cloned animals and in cloned bovine placenta at 270 days of pregnancy. Bovine placental cells were able to produce different amounts of progesterone during pregnancy. Growth factors were able to influence progesterone production in placental cells only after 24 hours in culture. At 90 and 210 days of pregnancy VEGF stimulated progesterone production, while at 270 days of pregnancy the growth factor inhibited production of this hormone. bFGF stimulated progesterone production in placental cells from 90 days of pregnancy. Both growth factors together determined an increase in progesterone production in placental cells from 210 days of pregnancy. Progesterone production in placental cells from cloned cattle is similar when compared with non-cloned placental cells at the same gestational age and growth factors did not influence progesterone production in these cells. VEGF and bFGF, acting locally in the placental tissue, are modulators of the steroidogenic process, influencing in a time-dependent manner the progesterone production in this organ.

Os tecidos dentais apresentam-se como fontes abundantes e de fácil obtenção de células-tronco de diferentes tipos, como é o caso das células-tronco derivadas do epitélio dental, papila dental, ligamento periodontal e folículo dental que possuem origem ectomesenquimal oriundas da crista neural, com a exceção do epitélio dental que é oriundo do ectoderma. As células-tronco de polpa dentária humana (CTPD) expressam estavelmente marcadores de células-tronco adultas (CTA), CD105 e CD73 durante as passagens contínuas, e um grupo de antígenos estágios-específicos de superfície celular, SSEA-3, SSEA-4 e fatores de transcrição de células-tronco embrionárias (CTE) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 e Nanog. Além disso, estas células são capazes de se diferenciar in vitro em vários tipos de células e tecidos: cartilagem, osso, tecido neural, músculo liso e esquelético. Em suínos, modelo animal amplamente utilizado para o estudo de várias doenças encontradas em humanos, os dentes caninos possuem crescimento contínuo que pode ser uma característica bastante interessante quando pensamos em células-tronco. Dessa forma, o estudo das células de polpa dentária desse animal merece destaque. Neste trabalho visamos estabelecer o cultivo e a caracterização de células-tronco derivadas da polpa dentária dos dentes caninos dos suínos com crescimento contínuo (PDS) e dos dentes molares visando um estudo comparativo. O cultivo das células-tronco de polpa dentária de canino e molar foi estabelecido e de acordo com os nossos resultados podemos dizer que as células-tronco de polpa dentária de suíno são de fácil obtenção, já que o dente é descartado após o abate do animal e não tem nenhum valor comercial. Até o momento não observamos diferenças relacionados ao crescimento contínuo dos dentes caninos e as células-troncos isoladas possuem características mesenquimais como era esperado. E ainda, os resultados obtidos neste trabalho poderão contribuir para aquisição de uma nova fonte de células-tronco, cuja obtenção em abatedouros poderá ser contínua, aumento assim a quantidade podendo ser utilizada na Terapia Celular. / The dental tissue presents itself as an easy and abundant source to obtain stem cells of different types, such as stem cells derived from dental epithelium, dental papilla, periodontal ligament and dental follicle origin that have originated from ectomesenquimal neural crest, with the exception of dental epithelium that arises from the ectoderm. Stem cells from human dental pulp (TCDC) stably express markers of adult stem cells (CTA), CD105 and CD73 during continuous passages, and a group of stage-specific antigens of cell surface SSEA-3, SSEA-4 and transcription factors of embryonic stem cells (ESC) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 and Nanog. Furthermore, these cells are able to differentiate in vitro into cartilage, bone, neural tissue, skeletal and smooth muscle. In pigs, an animal model widely used for the study of several human diseases, the canine teeth continues to grow and can be a very interesting feature regarding stem cells. Thus, the study of dental pulp cells in this species is worthy consideration. The aim of this work was to establish the cultivation and characterization of stem cells derived from dental pulp from pigs canine teeth with continuous growth (PDS) and the molar teeth, seeking a comparative study. The cultivation of stem cells from canine dental pulp and molar teeth have been established and, according to our results, we can say that stem cells from porcine dental pulp are easy to obtain, since the tooth is discarded when the animal is slaughtered and has no commercial value. So far no differences related to the continued growth of the canine teeth were observed and the isolated stem cells presented mesenchymal characteristics as expected. The results obtained in this study may contribute to the acquisition of a new source of stem cells, which can be obtained continuously in slaughterhouses, thus increasing the amount of samples to be used in cell therapy.

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T19:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AnaPauladeLima_D.pdf: 1915868 bytes, checksum: d146b07dfcd99b2676c519233cddf2f2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Diabetes Mellitus tipo II (DMT2) é uma doença caracterizada pela diminuição da sensibilidade à insulina e consequente prejuízo na homeostasia glicêmica. Estudos recentes mostraram que a melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, melhora a tolerância à glicose e a resistência à insulina, diminui a expressão de proteínas ligadas à gliconeogênese hepática (G6Pase e PEPCK) e reduz a apoptose de células beta pancreáticas in vivo. Entretanto, ainda não estava claro se a melatonina conseguia, de fato, reverter in situ as ações lipotóxicas dos ácidos graxos saturados em células beta pancreáticas e na musculatura esquelética, e se podia diminuir a expressão dos genes reguladores da gliconeogênese hepática. Para responder a esse questionamento, utilizamos culturas celulares de insulinoma (MIN6), de músculo esquelético (miotubos de L6) e de hepatoma (HepG2). Os resultados mostraram que a melatonina reverte a resistência à insulina gerada por palmitato em miotubos de L6, mas somente em passagens baixas, não diminui a apoptose em MIN6 e não altera a expressão do G6pc, o gene que codifica a G6Pase, em HepG2 / Abstract: Type II Diabetes Mellitus (T2DM) is characterized by decrease of insulin sensitivity, resulting impairment glucose homeostasis. Recent studies have shown that melatonin, a hormone produced by the pineal gland, improves glucose tolerance and insulin resistance, reduce the expression of hepatic gluconeogenesis proteins (G6Pase and PEPCK) and diminish pancreatic beta cell apoptosis in vivo. However, it was unclear if melatonin could reverse the lipotoxic actions of saturated fatty acid in pancreatic beta cells and skeletal muscle, and if melatonin could decrease the expression of regulatory genes of hepatic gluconeogenesis in situ. To answer this question, we used cell cultures of insulinoma (MIN6), skeletal muscle (L6 myotubes) and hepatoma (HepG2). The results showed that melatonin reverses palmitate insulin resistance in L6 myotubes, but only at low passages, melatonin does not decrease apoptosis in MIN6 and does not alter the expression of G6pc, the encoding gene of G6Pase, in culture cell of HepG2 / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

S. pneumoniae é um importante patógeno humano que afeta sobretudo crianças. Vacinas são a principal estratégia de combate e o polissacarídeo (PS) da cápsula é o antígeno. Dentre os sorotipos do patógeno, o tipo 1 é prevalente em crianças e o PS1 componente obrigatório das vacinas. Neste trabalho objetivou-se: estabelecer um método de dosagem do PS1, selecionar a melhor cepa produtora de PS1, avaliar 3 peptonas, investigar 4 componentes do meio de cultura em planejamento experimental (PE) em reator e propor um novo meio e estratégia de cultivo. A cepa ST595/01 foi selecionada e o Phytone (Phy) foi a peptona com maior produção de PS1, 298mg/L, medido por m-hidroxidifenil com sulfamato. O PE 24-1 com extrato de levedura (EL), Phy, Asn e Gln mostrou os maiores efeitos positivos do Phy para produção de biomassa (Cx) e PS1. EL foi positivo para Cx, Asn não apresentou efeitos e Gln menor efeito positivo para PS1. Assim, testou-se o novo meio com Phy 15g/L e EL 2g/L sob duas estratégias: a batelada alimentada superou a batelada simples em 2x para Cx e 2,5x para PS1. / S. pneumoniae is an important human pathogen that affects mainly children. Vaccines are the main strategy to fight the disease and capsular polysaccharide (PS) is the antigen. Among pneumococcal serotypes, type 1 is prevalent in children. The aims of this work were: establish a method to measure PS1, screen strains for the best PS1 producer, evaluate 3 peptones, investigate the effects of 4 medium components by a design of experiment (DoE) and propose a new medium/strategy for cultivation. The strain ST595/01 was selected. Phytone (Phy) was the peptone with the highest PS1 production (298mg/L, measured by m-hydroxydiphenyl + sulfamate method). DoE 24-1 was carried out to assess the effects of yeast extract (YE), Phy, Asn and Gln. Phy showed the major positive effects for biomass (Cx) and PS1. YE demonstrated effects for Cx. Gln showed minor effect on PS1 production and Asn did not present effects. A new medium based on 15g/L Phy and 2g/L YE was evaluated by 2 strategies: fed-batch showed Cx production 2-fold higher and PS1 2.5-fold higher than simple batch.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Resumo: As células-tronco mesenquimais extraídas da medula óssea ou tecido adiposo são utilizadas em abordagens terapêuticas, em vista das suas propriedades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e regenerativas. Estas células são consideradas uma nova alternativa para o tratamento de enfermidades em diversas espécies, incluindo as dos equinos. Dessa forma, com o intuito de investigar a possível utilização das células estromais de mini-horses em tratamentos de cavalos, nesse estudo foi realizada a colheita, isolamento, expansão, caracterização imunofenotípica e diferenciação em duas linhagens mesenquimais: osteogênica e adipogênica de células estromais de mini-horses (Equus ferus caballus), objetivando a formação de um banco celular. Foi ainda realizada a análise transcricional comparativa dessas células, com as células estromais oriundas de cavalos (Equus caballus), produzidas e caracterizadas nas mesmas condições. Os parâmetros analisados foram o perfil de genes relacionados à angiogênese, regulação negativa da proliferação de células T, regulação negativa da ativação de células T, proliferação negativa de linfócitos reguladores, regulação negativa da proliferação de células mononucleares, regulação negativa da adesão célula-célula de leucócitos, regulação negativa da proliferação de leucócitos, regulação negativa da adesão célula-leucócito, regulação negativa da ativação de linfócitos. Também foram pesquisados os principais genes up e down regulados comparando mini-horses aos cavalo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells extracted from bone marrow or adipose tissue are used in therapeutic approaches in view of their anti-inflammatory, immunomodulatory and regenerative properties. These cells are considered a new alternative for the treatment of diseases in several species. In order to investigate the possible use of mini-horses stromal cells in horse treatments, in this study was performed the collection, isolation, expansion, immunophenotypic characterization and differentiation in two mesenchymal lines were performed: osteogenic and adipogenic stromal cell mini-horses (Equus ferus caballus), aiming the formation of a cellular bank. We also performed the comparative transcriptional analysis of these cells, with stromal cells from horses (Equus caballus), produced and characterized under the same conditions. The parameters analyzed were the profile of genes related to angiogenesis, negative regulation of T cell proliferation, negative regulation of T cell activation, negative proliferation of regulatory lymphocytes, negative regulation of mononuclear cell proliferation, negative regulation of cell-cell adhesion leukocytes, negative regulation of leukocyte proliferation, negative regulation of cell-leukocyte adhesion, negative regulation of lymphocyte activation. We also searched the top 10 genes up and down regulated comparing mini-horses to horses. For cell bank formation tests were performed that demonstrated the characteristics of stromal cells in the cells obtained ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) representa mais de 95% de todas as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral e muitas vezes estes tumores são precedidos por alterações clínicas que apresentam um evidente potencial de transformação maligna, as quais são chamadas de desordens potencialmente malignas orais (DPMOs). Dentre estas, a leucoplasia oral (LO) possui taxa de transformação maligna que varia de 0,2% até 17,5%; contudo, uma outra DPMO conhecida como leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) apresenta um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna maior que 70%. Diferente da LO, fator de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP frequentemente apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Estudos recentes sugerem que o infiltrado inflamatório associado às lesões leucoplásicas de paciente com LVP pode estar relacionado a etiologia e/ou comportamento clínico agressivo desta DPMO. Assim, foi realizada uma análise comparativa entre amostras de LO e LVP que consistiu em: (1) avaliar a porcentagem e identificar os subtipos de linfócitos T auxiliares e estado de ativação de linfócitos T citotóxicos, (2) avaliar a densidade e estado de ativação das células dendríticas, e (3) determinar o efeito de produtos solúveis de células displásicas na modul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T11:45:26Z No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T11:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Desde o trabalho de Köhler e Milstein (1975), hibridomas tem sido cultivados para obtenção de anticorpos monoclonais com finalidade de uso em pesquisa, diagnóstico e terapia. O método tradicional de obtenção de anticorpos monoclonais em altas concentrações é através de indução de ascite em camundongos. Estatécnica vem sendo substituída por cultivos de hibridomas em altas concentrações celulares. Neste trabalho, foram cultivados hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo 2 em frascos T, garrafas rotatórias (roller) e frascos do tipo spinner, utilizando-se o meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, e o meio comercial livre de soro animal Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Ao longo dos diferentes cultivos, foram avaliadas a concentração celular, viabilidade celular e as concentrações de nutrientes (glicose eglutamina), metabólitos (lactato e amônio) e produto (IgG). A partir dos resultados obtidos, foram calculadas as grandezas representativas do metabolismo celular: concentração máxima de células (X máx), taxa específica de crescimento celular (µexp), tempo de duplicação (td) e coeficientes de rendimento de glicose em células (YX/glc), glutamina em células (Y X/gln), células em produto (YP/X), glutamina em amônio (YNH4/gln), glicose em lactato (Ylac/glc), glicose em produto (YP/glc) e glutamina em produto (YP/gln). O meio livre de soro mostrou ser capaz de fornecer melhores condições para o crescimento celular (alcançando 4 x 106 céls/mL), mantendo a viabilidade por um período maior de tempo, nos três sistemas decultivo testados. Quanto à formação de produto, no meio livre de soro, os hibridomas também secretaram altas concentrações de IgG, alcançando níveis de 3 µg/mL. Os melhores resultados de crescimento e viabilidade celular foram observados em garrafas rollera 40 rpm (após adaptação a rotações inferiores) e a produção de IgG foi maior em garrafas rollera 16 rpm (também após adaptação a rotações inferiores) e em frascos do tipo spinner a 50 rpm (após adaptação a rotações inferiores em garrafas rolleraté 40 rpm). Quando foram comparadas as concentrações de IgG entre os sobrenadantes de cultivo e três amostras de fluido ascítico do mesmo hibridoma, foi observado que o fluido ascítico continha concentrações 10 a 20 vezes maiores que as obtidas nos sobrenadantes de cultivo. Entretanto, como os volumes de sobrenadantes de cultivo são significativamente maiores do que os de fluido ascítico de camundongos, infere-se que é viável a substituição da produção in vivopela obtenção do anticorpo monoclonal estudado neste trabalho em sistemas agitados, utilizando-se meio livre de soro animal. Contudo, sugere-se a condução de experimentos adicionais para confirmação da total viabilidade da obtenção de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo2 in vitroutilizando o processo proposto no presente trabalho. / Since Köhler and Milstein’s work (1975), hybridoma cells have been cultured to obtain monoclonal antibodies for research, diagnostic and therapeutic purposes. The traditional method to obtain high concentrations (5 to 10 mg/mL) of the monoclonal antibodies is the induction of ascite in mice. This technique is being replaced by high cell density cultivations. In this work, hybridoma secreting anti-dengue type 2 monoclonal antibodies were cultivated in T flasks, roller bottles and spinner flasks, using DMEM medium supplemented with fetal bovine serum at 10%, and the commercial serum-free medium Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Cell concentration, cell viability, as well as concentration of nutrients (glucose and glutamine), metabolites (lactate and amonium) and product (IgG) were evaluated along culture time in the different media and culture systems. Based on these data, variables that reflect the cell metabolism were calculated: maximum cell concentration (Xmáx), specific cell growth rate (µexp), duplication time (td), as well as the yield coefficients of glucose to cells (YX/glc), glutamine to cells (YX/gln), cells to product (YP/X), glutamine to ammonium (Y NH4/gln), glucose to lactate (Ylac/glc), glucose to product (YP/glc) and glutamine to product (YP/gln). Among the culture media, the serum-free medium showed to provide better conditions for cell growth (reaching 4 x 106 cells/mL), keeping high cell viabilities for a longer period, in all three tested culture systems. Concerning product formation, hybridoma also released high IgG concentrations (3 µg/mL) in the serum-free medium. Among the culture systems, the best results for cell growth and viability were found inroller bottles at 40 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and IgG production was higher in roller bottles at 16 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and in spinner flasks at 50 rpm (after adaptation under lower rotation rates in roller bottles, up to 40 rpm). The IgG concentrations ascitic fluid presented concentrations 10 to 20 times higher thanthose obtained in culture supernatants. However, since the volumes of culture supernatant obtained in relatively simple, small-scale culture systems are significantly higher than thoseof mice ascitic fluids, the replacement of in vivoproduction for in vitroIgG production in stirred systems, using serum-free media, seems to be feasible. Nevertheless, additional experiments should be carried out to confirm the feasibility of switching the production of anti-dengue type 2 monoclonal antibodies for in vitrosystems, using the process proposed in this work.