A aplicação dos métodos de biologia molecular tem acrescentado benefícios aos métodos convencionais de diagnóstico do grupo sangüíneo Rhesus (Rh). Alguns estudos evidenciaram a superioridade prática da genotipagem RhD por reação em cadeia da polimerase (PCR) em relação às técnicas de identificação do fenótipo dos antígenos do grupo Rh obtidas pela hemaglutinação. Esta análise molecular tem sido realizada utilizando-se várias seqüências cromossômicas e diferentes tipos de técnicas. O grupo Rh contém dois genes homólogos, um codificando o antígeno D e o outro os antígenos C/c e E/e. Os objetivos deste projeto foram: (1) Detectar a presença de seqüência RhD específica dos indivíduos Rh positivo; (2) Comparar a presença/ausência destas seqüências com o grupo sanguíneo detectado pela hemaglutinação e calcular a sensibilidade e a especificidade da PCR. Para cumprir estes objetivos, foram analisadas amostras de DNA extraídas de sangue periférico de 23 indivíduos (4 homens e 19 mulheres) Rh positivo (11) e negativo (12) para amplificação de seqüências dos genes RhD e RhCE utilizando a técnica de PCR convencional. Nestas amostras, a comparação dos resultados da PCR com os da hemaglutinação demonstrou total concordância entre os testes. A sensibilidade do método foi avaliada pela realização da PCR em amostras de sangue Rh positivo diluídas em água e em sangue Rh negativo, amplificando o DNA na concentração de até 4 pg/l. Estes resultados indicaram que a técnica de PCR mostrou-se efetiva no diagnóstico da genotipagem do fator Rh, vislumbrando-se a possibilidade de sua utilização em outros tecidos de origem êmbrio-fetal para orientação de diagnóstico fetal invasivo e do uso profilático da imunoglobulina anti-D apenas nos casos de incompatibilidade Rh materno-fetal. Adicionalmente, indicaram que havendo melhora da sensibilidade desta técnica será possível detectar quantidades objetivamente menores de DNA fetal na circulação materna, fundamentando um importante passo rumo ao diagnóstico do fator Rh fetal por técnica não invasiva. / Molecular biology techniques have added some advantages to conventional diagnosis of the Rhesus (Rh) blood group. Many researches have demonstrated the practical superiority of RhD genotyping using polymerase chain reaction (PCR) over phenotypic identification tests obtained by hemagglutination. The use of different kinds of molecular analysis techniques and genetic sequences has been described. The Rh blood group contains two homologous genes, one encoding the D antigen and the other one coding C/c and E/e antigens. This study objectives were: (1) Detect the RhD sequence specific for the Rh positive individuals; (2) Compare the presence/absence of these sequences with the blood group identified by hemagglutination to calculate PCRs sensitivity and specificity rates. To accomplish these objectives, DNA extracted from venous blood of 23 individuals (4 men and 19 women), Rh positive (11) and negative (12), were analyzed using conventional PCR to amplify RhD and RhCE gene sequences. The comparison of PCR with hemagglutination results has shown total agreement. The sensitivity of this PCR method was evaluated using progressive dilutions of Rh positive samples on water and also on Rh negative samples, which demonstrated successful amplification of until 4 pg/l DNA concentration. These results have indicated that PCR was effective for the RhD genotyping, foreseeing the possibility of its utilization with other embryofetal tissues for invasive diagnosis orientation and anti-D immunoglobulin use only in cases of maternal-fetal incompatibility. Also, with an increase of this techniques sensitivity, fewer DNA amounts could be detected, which will certainly be an important step towards noninvasive fetal RhD diagnosis.

A aplicação dos métodos de biologia molecular tem acrescentado benefícios aos métodos convencionais de diagnóstico do grupo sangüíneo Rhesus (Rh). Alguns estudos evidenciaram a superioridade prática da genotipagem RhD por reação em cadeia da polimerase (PCR) em relação às técnicas de identificação do fenótipo dos antígenos do grupo Rh obtidas pela hemaglutinação. Esta análise molecular tem sido realizada utilizando-se várias seqüências cromossômicas e diferentes tipos de técnicas. O grupo Rh contém dois genes homólogos, um codificando o antígeno D e o outro os antígenos C/c e E/e. Os objetivos deste projeto foram: (1) Detectar a presença de seqüência RhD específica dos indivíduos Rh positivo; (2) Comparar a presença/ausência destas seqüências com o grupo sanguíneo detectado pela hemaglutinação e calcular a sensibilidade e a especificidade da PCR. Para cumprir estes objetivos, foram analisadas amostras de DNA extraídas de sangue periférico de 23 indivíduos (4 homens e 19 mulheres) Rh positivo (11) e negativo (12) para amplificação de seqüências dos genes RhD e RhCE utilizando a técnica de PCR convencional. Nestas amostras, a comparação dos resultados da PCR com os da hemaglutinação demonstrou total concordância entre os testes. A sensibilidade do método foi avaliada pela realização da PCR em amostras de sangue Rh positivo diluídas em água e em sangue Rh negativo, amplificando o DNA na concentração de até 4 pg/l. Estes resultados indicaram que a técnica de PCR mostrou-se efetiva no diagnóstico da genotipagem do fator Rh, vislumbrando-se a possibilidade de sua utilização em outros tecidos de origem êmbrio-fetal para orientação de diagnóstico fetal invasivo e do uso profilático da imunoglobulina anti-D apenas nos casos de incompatibilidade Rh materno-fetal. Adicionalmente, indicaram que havendo melhora da sensibilidade desta técnica será possível detectar quantidades objetivamente menores de DNA fetal na circulação materna, fundamentando um importante passo rumo ao diagnóstico do fator Rh fetal por técnica não invasiva. / Molecular biology techniques have added some advantages to conventional diagnosis of the Rhesus (Rh) blood group. Many researches have demonstrated the practical superiority of RhD genotyping using polymerase chain reaction (PCR) over phenotypic identification tests obtained by hemagglutination. The use of different kinds of molecular analysis techniques and genetic sequences has been described. The Rh blood group contains two homologous genes, one encoding the D antigen and the other one coding C/c and E/e antigens. This study objectives were: (1) Detect the RhD sequence specific for the Rh positive individuals; (2) Compare the presence/absence of these sequences with the blood group identified by hemagglutination to calculate PCRs sensitivity and specificity rates. To accomplish these objectives, DNA extracted from venous blood of 23 individuals (4 men and 19 women), Rh positive (11) and negative (12), were analyzed using conventional PCR to amplify RhD and RhCE gene sequences. The comparison of PCR with hemagglutination results has shown total agreement. The sensitivity of this PCR method was evaluated using progressive dilutions of Rh positive samples on water and also on Rh negative samples, which demonstrated successful amplification of until 4 pg/l DNA concentration. These results have indicated that PCR was effective for the RhD genotyping, foreseeing the possibility of its utilization with other embryofetal tissues for invasive diagnosis orientation and anti-D immunoglobulin use only in cases of maternal-fetal incompatibility. Also, with an increase of this techniques sensitivity, fewer DNA amounts could be detected, which will certainly be an important step towards noninvasive fetal RhD diagnosis.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-14T16:38:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeka Cristine de Bastos Costa - 2015.pdf: 2127820 bytes, checksum: 8789b51096d386c4def09d0d1ee4da0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-15T09:55:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeka Cristine de Bastos Costa - 2015.pdf: 2127820 bytes, checksum: 8789b51096d386c4def09d0d1ee4da0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-15T09:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeka Cristine de Bastos Costa - 2015.pdf: 2127820 bytes, checksum: 8789b51096d386c4def09d0d1ee4da0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-08-25 / Toxoplasmosis is a zoonotic disease in which mammals and birds can join the cycle as intermediate hosts, and felids as definitive hosts. Felis catus is recognized as the main responsible for the environmental contamination by Toxoplasma gondii oocysts. Serological diagnosis reveals little about the elimination of oocysts of T. gondii into the environment, principally by F. catus, which plays an important role in Public Health. There are few data on the frequency of feline toxoplasmosis in the State of Goiás. Therefore, the aim of this research was to evaluate the frequency of toxoplasmosis infection in domestic cats and their potential role in its transmission through the oocyst elimination into the environment and the respective factors associated with the infection. For this, we collected 102 blood samples and 98 fecal samples from 102 cats from Goiânia, State of Goiás. The animals were divided into groups according to age, gender and free access to the street or not. Indirect hemagglutination test was performed to determine the level of anti-T. gondii and indirect ELISA for the detection of infection by feline immunodeficiency virus (FIV). For search and detection of T. gondii oocysts elimination in the feces of cats we performed a centrifugal-flotation with Sheather's solution, subsequently we extracted DNA and used conventional PCR. The results showed that 18.63% (19/102) of the cats were positive for T. gondii, with titers ranging from 1:32 to 1: 8.192, while none of the fecal samples were positive in the PCR. The frequency of positive animals for FIV was 55.91% (52/93), and 18.28% (17/93) presented coinfection. By multivariate logistic regression we found the associated factors were the same for both infections, but one did not interfere with another. The factors associated with infection by T. gondii and feline immunodeficiency virus were free life and age under six months, since the sex was not statistically related to any of the illnesses. / A toxoplasmose é uma zoonose na qual, mamíferos e aves podem participar do seu ciclo como hospedeiros intermediários e os felídeos como hospedeiros definitivos. O Felis catus é reconhecido como o principal responsável pela contaminação ambiental por oocistos de Toxoplasma gondii. O diagnóstico sorológico pouco revela sobre a eliminação de tal fase no ambiente, o que representa o real impacto daquela espécie na Saúde Pública frente à toxoplasmose. São escassos os dados da frequência da toxoplasmose felina no Estado de Goiás. Assim sendo, objetivou-se com esta pesquisa avaliar a frequência da infecção da toxoplasmose em gatos domésticos e o seu potencial papel na sua transmissão, através da eliminação de oocistos no ambiente e dos respectivos fatores associados à infecção. Para isto, foram coletadas 102 amostras de sangue e 98 amostras fecais, de 102 gatos provenientes de Goiânia-Goiás. Os animais foram divididos em grupos de acordo com a faixa etária, gênero e livre acesso à rua ou não. Foi realizada a hemaglutinção indireta para a determinação do nível de anticorpos anti-T. gondii e o ELISA indireto para a detecção da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV). Para a pesquisa e detecção da eliminação de oocistos de T. gondii nas fezes dos gatos foi feita a centrifugo-flutuação em solução de Sheather, posterior extração de DNA e realização da PCR convencional. Os resultados revelaram que 18,63% (19/102) dos gatos foram positivos para o T. gondii, com títulos variando entre 1:32 a 1:8.192, sendo que nenhuma das amostras fecais foi positiva na PCR. A frequência de positivos para o FIV foi de 55,91% (52/93), com coinfecção de 18,28% (17/93). Com a regressão logística multivariada verificou-se que os fatores associados foram os mesmos para as duas infecções, porém uma não interferiu diretamente na outra. Os fatores associados para a infecção pelo T. gondii e pelo vírus da imunodeficiência felina foram a vida livre e a idade igual ou superior a seis meses, já o gênero não apresentou relação estatística com nenhuma das enfermidades.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:55:46Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and delimitation. Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.