Biopeptides are synthesised as large pro-protein precursors that have to undergo proteolytic cleavage at positively charged amino acids (Lys and Arg) in order to become active. This cleavage is mediated by a family of subtilin/kexin related calcium dependent serine endoproteinases named prohormone convertases. The present thesis focuses on the endocrine member of the family named PC1/3. PC1/3 is expressed in the regulated secretory pathway of endocrine and neuroendocrine cells, where it was shown to activate various peptide hormones such as proopiomelanocortin (POMC), pro-insulin and pro-glucagon. PC1/3 is synthesized as a large precursor containing a signal peptide, a propeptide, a catalytic domain, a P domain and a C-terminal domain. The activation of the enzyme requires the sequential removal of the signal peptide, the propeptide and ultimately the C-terminal domain. / The structural characterisation of the enzyme is compromised by the difficulty in producing a sufficient amount of recombinant PC1/3. In this thesis it is clearly demonstrated that the production of PC1/3 using Baculovirus technology can be greatly improved by modifying the expression vector in insect cells (Spodoptera frugiperda). In addition, the intracoelemic injection of insect larvae (Tricoplusia ni) with the Baculovirus encoding the recombinant PC1/3 is shown to be a very efficient method for the production of a large amount of prohormone convertases. / It was previously demonstrated that the propeptide is essential for the folding of the enzyme and act as a tight binding inhibitor of the enzyme until the latter reaches the appropriate compartment for substrate cleavage. To assess the role of certain residues within the propeptide in the inhibition of the cognate enzyme, a mutational analysis by alanine scan was conducted. The results demonstrate that the substitution of a single amino acid can affect markedly the inhibition behavior, potency and selectivity of the propeptide towards the enzyme. Moreover, this mutational analysis allowed the first experimental mapping of the sequence involved in propeptide degradation once its function is achieved. / However, PC1/3 also possesses a C-terminal domain which must also be cleaved to allow the full activation of the enzyme. Previous studies showed that this domain is implicated in the sorting of the enzyme to secretory granules. In addition, over expression experiments showed that the C-terminal domain can inhibit the cleavage of certain substrates by PC1/3. The results, presented here, suggest that the CT-peptide acts as a non-essential activator of PC1/3, in vitro, which adds a supplementary level of complexity to the activation process of the enzyme. / Finally, based upon our results, it can be proposed that PC1/3 is a very complex enzyme capable of controlling its enzymatic activity through the coordinate action of its various domains. This exceptional mode of self-regulation is unique among all protease families.

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Les ADAMTS (a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeat) sont des métallopeptidases sécrétées dans le milieu extracellulaire ayant comme fonction le clivage de différents substrats de la matrice extracellulaire tel le propeptide en N-terminal du collagène, l'aggrécan, ainsi que le von Willebrand factor retrouvé dans le plasma. Une mutation ou un dérèglement d'ADAMTS2, 5 et 13 sont directement responsable du syndrome de Ehlers-Danlos de type VII C, l'arthrose et la purpura thrombotique thrombocytopénique respectivement. De plus, ADAMTS1 et 8 sont reconnues pour avoir des propriétés anti-angiogéniques qui s'avèrent d'un potentiel thérapeutique contre la progression des tumeurs. La biosynthèse et les mécanismes menant à la pleine activité biologique de ces peptidases sont peu connus et ont été étudiés dans cet ouvrage. Nous avons démontré que les ADAMTS sont initialement synthétisées sous forme de zymogènes qui subissent un clivage protéolytique à la jonction de leur prodomaine et de leur domaine catalytique par différentes sérines peptidases de la famille des pro-protéines convertases de type subtilisine. Des études de marquages métaboliques des différents ADAMTS transfectées dans la lignée cellulaire CHO RPE.40 déficiente en furine ont dévoilé que ADAMTS1, 5, 7 et 9 sont toutes clivées par la furine. D'autres convertases clivent de façon moins efficace que la furine les prodomaines des ADAMTS (PACE4 et PC6B clivent ADAMTS1, PC6B et PC7 clivent ADAMTS7, PC5A Clive ADAMTS9 et PC7 Clive ADAMTS5). Malgré la présence de plusieurs sites consensus de clivage par la furine dans les prodomaines des ADAMTS, des études de mutagenèse dirigée abolissant les différents sites ont démontré que le site plus près du domaine catalytique est préférentiellement clivé par la furine. Le clivage du prodomaine d'ADAMTS1 et 7 s'effectue au réseau du trans -Golgi. Toutefois, des études de marquage à la biotine des protéines de la surface cellulaire démontrent que ADAMTS7 semble aussi être clivée à la surface de la cellule. ADAMTS5 est strictement maturée dans l'espace extracellulaire, soit à la surface cellulaire ou dans le milieu extracellulaire, ce qui révèle un nouveau mécanisme d'activation par la furine pour des substrats endogènes. En outre, ADAMTS9 est clivée à la surface de la cellule par la furine, mais contrairement à la presque totalité des substrats de la furine, celle-ci inactive ADAMTS9. En somme, il existe plusieurs mécanismes d'activation des ADAMTS : activation intracellulaire ou extracellulaire et inactivation extracellulaire par les convertases. La présence, dans les prodomaines des ADAMTS, d'acides aminés conservés à travers les membres de cette famille d'enzyme nous amène à penser qu'ils pourraient jouer un rôle important dans leur maturation. La mutation des acides aminés conservés des motifs CXYXG et YFIXPL d'ADAMTS1 et 9 ainsi que des sites de N-glycosylation d'ADAMTS9 ont grandement affecté la sécrétion de l'enzyme mature. Cette observation permet de conclure qu'outre le site consensus de clivage par la furine, des motifs conservés ainsi que la glycosylation des prodomaines sont impliqués dans la biosynthése des ADAMTS. La découverte de nouveaux mécanismes d'activation par la furine a une signification importante dans le domaine d'activation de précurseurs. L'activation extracellulaire d'ADAMTS5, l'enzyme responsable de la dégradation du cartilage, génère une cible thérapeutique potentielle pour un traitement futur de l'arthrose.

Dans cette étude on décrit une méthode reproductible et efficace pour isoler des cellules microgliales et leurs exosomes. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de différences morphologiques entre les cellules microgliales issues d'origines tissulaires différentes e.g. cortex et moelle épinière. D'autre part, en utilisant une plateforme de protéomique à grande échelle, nous démontrons que les microglies dérivées du cortex et de la moelle épinière des rats expriment des phénotypes différents tant dans les conditions physiologiques normales ou inflammatoires. Cette différence a été confirmée également au niveau des exosomes qu’elles sécrètent.Des essais biologiques in vitro démontrent que les exosomes dérivées de microglies testées sur des sphéroïdes 3D de gliomes de rat étaient capables d'inhiber l'invasion tumorale. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que des exosomes dérivées de la microglie pouvaient être utilisés comme agents nano thérapeutiques vis-à-vis des gliomes. Sur la base des études précédentes conduites au laboratoire, nous avons montré que les EVs isolées à partir de macrophage KD PC1/3 traitées avec Paclitaxel inhibaient la croissance de la lignée C6 de gliome de rat. Nous avons isolé les exosomes et nos résultats mettent en valeur le potentiel d'une stratégie thérapeutique combinant Paclitaxel et inhibition de PC1/3 et utilisation des exosomes produits par ces cellules comme agents thérapeutiques. / In present study, we present a reproducible and an efficient method for isolating microglial cells and their exosomes. The results show that there are no morphological differences between microglial cells from different tissue origins e.g. cortex and spinal cord. On the other hand, using a large-scale proteomic platform, we demonstrate that microglia derived from the cortex and spinal cord of rats express different phenotypes under both normal and inflammatory physiological conditions. This difference has also been confirmed at the level of the exosomes they secrete.In vitro bioassays demonstrate that microglia-derived exosomes tested on 3D spheroids of rat gliomas were able to inhibit tumor invasion. These results made it possible to demonstrate that exosomes derived from microglia could be used as nano-therapeutic agents vis-à-vis gliomas.Based on previous studies conducted in the laboratory, we have shown that EVs isolated from KD PC1/3 macrophage treated with Paclitaxel inhibited the growth of the rat glioma C6 line. We isolated the exosomes and our results highlight the potential of a therapeutic strategy combining Paclitaxel and PC1/3 inhibition and use of the exosomes produced by these cells as therapeutic agents.

Thesis (Ph.D.). / Title from title page of PDF (viewed 2008/01/30). Written for the Dept. of Medicine, Division of Experimental Medicine. Includes bibliographical references.

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Mondialement, le cancer du sein est celui le plus fréquent et mortel chez les femmes. Malgré un programme de dépistage national et de nouveaux traitements, le taux de rechute demeure haut. Ceci illustre le besoin de nouvelles thérapies. Même dans un pays industrialisé comme le Canada, ce cancer est toujours le deuxième plus mortel chez les femmes. Nos travaux précédents ont identifié PACE4, un membre de la famille des proprotéines convertases (PCs), comme étant une nouvelle cible thérapeutique dans le cancer de la prostate. Dans cette étude, nous avons vérifié si PACE4 pourrait aussi être une cible dans le cancer du sein. À l’aide d’échantillons clinique de cancer du sein, nous avons premièrement démontré que PACE4 est spécifiquement surexprimé dans le sous-type moléculaire positif aux récepteurs hormonaux. Par la suite, nous avons sélectionné une lignée cellulaire pour poursuivre nos expériences. Nous avons choisi la lignée de cancer du sein ZR-75-1 parce qu’elle provient du sous-type positif aux récepteurs hormonaux et qu’elle exprime PACE4. En culture cellulaire, nous avons comparé la croissance de cellules ZR-75-1 modifiées qui sous-exprimaient furine, PACE4 ou PC7. Lors de ces expériences, PACE4 était la seule PC importante pour la prolifération cellulaire. L’importance de PACE4 pour la croissance tumorale a aussi été confirmée in vivo à l’aide d’un modèle de xénogreffes de cellules ZR-75-1 chez des souris immunosupprimées. Les inhibiteurs peptidiques spécifiques à PACE4 C23 et Multi-Leu (ML) ont aussi été testés en culture cellulaire où ils étaient en mesure de diminuer la prolifération des cellules ZR-75-1 et MCF-7. Nous avons aussi démontré, à l’aide d’un peptide ML radiomarqué, que l’expression de PACE4 est nécessaire pour que les peptides inhibiteurs pénètrent dans la cellule. De plus, le peptide C23, lorsqu’administré systémiquement à des souris immunosupprimées portant des tumeurs de cancer du sein, était en mesure de diminuer la croissance tumorale. De manière intéressante, les tumeurs sous-exprimant PACE4 et celles traitées avec le peptide C23 démontraient un ralentissement de la croissance tumorale similaire. De plus, lorsque ces tumeurs ont été analysées en immunohistochimie, elles possédaient une diminution du marqueur de prolifération Ki67 et une augmentation de cellules positives aux marqueurs d’arrêt du cycle cellulaire p27KIP1 et p21Waf1/Cip1 comparativement aux tumeurs contrôles. Pour conclure, la sous-expression de PACE4 et l’administration systémique d’un inhibiteur de PACE4 en culture cellulaire ainsi que dans un modèle de xénogreffe résultent en une diminution de la prolifération néoplasique. Nos résultats suggèrent que PACE4 est une cible intéressante dans le cancer du sein positif aux récepteurs hormonaux. / Abstract: Breast cancer is the most frequent and deadly malignancy in women worldwide. Despite national screening prog rams combined with new treatments relapse rate remain high and new therapies are needed. Even in industrialized country like Canada, it is still the second most deadly cancer in women. From previous work, we identified PACE4, a member of the proprotein convertases (PCs) family of endoproteases, as a novel therapeutic target in prostate cancer. In the present study, we examined whether PACE4 could also be a potential target in breast cancer. In clinical samples of breast adenocarcinoma, we observed a specific overexpression of PACE4 in the estrogen-receptor-positive (ER+) subtype. We therefore looked for a breast cancer cell line model which would be representative and thus focused on ZR-75-1 since it both expresses PACE4 and is estrogen-receptor-positive. We compared stable knockdowns of furin, PACE4 and PC7 in the estrogen-receptor-positive cell line ZR-75-1 to evaluate their respective contribution to cell growth and tumor progression. PACE4 was found to be the only PC displaying a decrease in cell growth. The impact of PACE4 on tumor growth was also confirmed in vivo with xenograft of the ZR-75-1 cell line in athymic nude mice. PACE4 specific peptide-based inhibitors (C23 and Multi-Leu) were tested and shown to decrease prolife ration of ZR-75-1 cells in cell-based assays. We also confirmed that PACE4 expression was necessary for its specific peptide-based inhibitors to penetrates in the cell using a radiolabeled Multi-Leu peptide. Moreover, the systemic administration of C23 had a potent effect on tumor growth on xenografts of the ZR-75-1 cell line. Interestingly, PACE4-silencing and systemic administration of the PACE4 inhibitor C23 resulted in similar slowed tumor growth in vivo. Furthermore, these tumors demonstrated lower Ki67 proliferative indices with increased cell quiescence assessed with p27 KIP1 and p21 Waf1/Cip1 biomarkers. To conclude, PACE4-silencing and systemic administration of a PACE4 inhibitor result in hindered tumor progression and slower cellular proliferation. Our results suggest that PACE4 is a promising target for estrogen-receptor-positive breast cancer.

Group X secretory phospholipase A2 (GX sPLA2) hydrolyzes membrane phospholipids producing free fatty acids and lysophospholipids. Previous studies from our lab suggest that mice with targeted deletion of GX sPLA2 (GX KO) have increased age-related weight gain due to an increase in overall adiposity. Paradoxically, this increased adiposity is associated with improved age-related glucose intolerance. GX KO mice also demonstrate a reduced inflammatory response to lipopolysaccharide injection. In vitro studies indicate this phenotype may be attributable to blunted macrophage mediated inflammatory responses. Given the role of macrophages in promoting adipose tissue (AT) inflammation and metabolic dysfunction in response to diet-induced obesity, we hypothesized that GX KO mice would be protected from the obesity related metabolic derangements associated with overfeeding. Unexpectedly, GX KO mice were only partially protected from high fat (HFD) diet-induced glucose intolerance and showed no improvement in HFD-induced insulin resistance. Moreover, GX KO mice were not protected against HFD-induced AT inflammation. GX sPLA2 is produced as a proenzyme (pro-GX sPLA2), and propeptide cleavage is required for enzymatic activity. Furin-like proprotein convertases (PCs) have recently been implicated in the proteolytic activation of pro-GX sPLA2; however the identity of individual PCs involved is unclear. Previous findings from our lab have shown that GX sPLA2 is expressed in the adrenals where it regulates glucocorticoid production. GX KO mice have increased plasma corticosterone levels under both basal and ACTH-induced stress conditions. However, how GX sPLA2 is regulated in the adrenals is still uncertain. We hypothesized that PCs may be involved in the proteolytic activation of pro-GX sPLA2 in the adrenals. Here we report the novel findings that the PCs, furin and PCSK6, proteolytically activate pro-GX sPLA2 in Y1 adrenal cells. Furthermore, we demonstrate that PC dependent processing of pro-GX sPLA2 is necessary for GX sPLA2 dependent suppression of steroidogenesis. Finally, we provide evidence that pro-GX sPLA2 processing by PCs is enhanced in response to adrenocorticotropic hormone (ACTH), suggesting a novel mechanism for negatively regulating adrenal steroidogenesis. Cumulatively, these studies provide valuable insight into the function and regulation of GX sPLA2.

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Résumé confidentiel / Confidential abstract