Résumé : La protéolyse par les proprotéines convertases (PC) représente une étape cruciale de maturation pour de nombreux peptides et protéines destinés aux voies de sécrétions cellulaires. Parmi ces substrats des PC, de nombreuses molécules participent aux étapes clés de progression tumorale. L’enzyme PACE4, une des PC, est d’ailleurs surexprimée dans le cancer de la prostate et des études antérieures réalisées dans notre laboratoire démontrent que cette protéase occupe un rôle essentiel et non redondant dans la progression du cancer de la prostate. Puisque PACE4 représente une cible thérapeutique potentielle pour le traitement du cancer de la prostate, l’objectif principal des travaux présentés dans cette thèse vise à développer un inhibiteur pharmacologique de PACE4 et d’évaluer son potentiel thérapeutique. Le développement d’inhibiteur spécifique à la PACE4 représente un défi de taille, puisque le site actif des PC démontre un fort niveau d’homologie. Bien que les sous-sites S1 à S4 des PC soient hautement conservés, la littérature suggère qu’il existe des déterminants moléculaires exploitables au sein des sous-sites S5 à S8. Ainsi, ces observations suggèrent qu’une sélectivité d’inhibition pourrait provenir de courts peptides. En analysant les profils d’inhibition obtenus pour divers peptides inhibiteurs des PC, la séquence Ac-LLLLRVKR-NH[indice inférieur 2], nommée Multi-Leu, a été identifiée comme inhibiteur permettant d’obtenir une préférence d’inhibition 20 fois plus importante pour PACE4 que pour Furine. Dans le but d’améliorer les propriétés pharmacocinétiques du composé et permettre son utilisation comme inhibiteur pharmacologique, des études de relation structure-activité ont été conduites. Ces études ont permis de déterminer que le peptide Multi-Leu est sujet à une dégradation par des exopeptidases, et par conséquent l’addition d’acides aminés non naturels aux extrémités N et C-terminales permet d’augmenter la stabilité du composé. Suivant cette étude, la modification amidinobenzylamide (Amba) a été introduite en position P1, permettant d’augmenter la puissance d’inhibition du composé, ainsi qu’un stéréoisomère D-Leucine en position P8. La caractérisation du potentiel inhibiteur du peptide Ac-[DLeu]LLLRVK-Amba démontre l’efficacité du peptide in vivo alors qu’une administration par voie intra veineuse du composé parvient à freiner la progression tumorale dans un modèle de xénogreffes de cancer de la prostate. Dans ce modèle, l’analogue du peptide Multi-Leu parvient à bloquer la néovascularisation tumorale en plus d’induire la quiescence et l’apoptose dans les tumeurs traitées. // Abstract : Numerous secreted peptides or proteins require a proteolytic activation by the proprotein convertases (PC) to fully gain their biologic activities. Among substrates of the PC family, there exist various cancer-related molecules. The enzyme PACE4, one of the seven kexinlike PC has been demonstrated to be overexpressed in prostate cancer and to have a nonredundant role in prostate cancer progression. Since PACE4 is a validated therapeutic target for prostate cancer, the main aim of this thesis was to develop a pharmacologic PACE4 inhibitor and to evaluate its therapeutic potential. The development of PACE4 specific inhibitors represents a challenge since PC share an important homology level within their active site. Whereas S1 to S4 subsites appear to be highly homologous within the PC family, litterature suggests that significant differences exist in subsites S5 and beyond, suggesting that peptide compound could result in specific inhibitors. In this thesis, the Multi-Leu peptide (Ac-LLLLRVKR-NH[subscript 2]) was identified as a selective PACE4 inhibitor, which displays a 20-fold inhibitory preference toward PACE4 over furin. In order to improve Multi-Leu peptide pharmacokinetic profile, structureactivities relationship studies were performed and allowed for the identification of two modifications that increase both inhibitory properties and stability of this molecule. Peptide resulting from introduction of an arginine mimetic residue amidinobenzylamide (Amba) in P1 and a stereoisomer D-Leucine in position P8 displayed an improved pharmacokinetic profile. Futhermore, intravenous administration of the compound Ac-[DLeu]LLLRVKAmba significantly inhibited prostate cancer progression in a LNCaP xenograft model of prostate cancer. This Multi-Leu peptide analog also inhibited tumor neovascularisation along with inducing cell quiescence and apoptosis in tumors of treated animals.

Mondialement, le cancer du sein est celui le plus fréquent et mortel chez les femmes. Malgré un programme de dépistage national et de nouveaux traitements, le taux de rechute demeure haut. Ceci illustre le besoin de nouvelles thérapies. Même dans un pays industrialisé comme le Canada, ce cancer est toujours le deuxième plus mortel chez les femmes. Nos travaux précédents ont identifié PACE4, un membre de la famille des proprotéines convertases (PCs), comme étant une nouvelle cible thérapeutique dans le cancer de la prostate. Dans cette étude, nous avons vérifié si PACE4 pourrait aussi être une cible dans le cancer du sein. À l’aide d’échantillons clinique de cancer du sein, nous avons premièrement démontré que PACE4 est spécifiquement surexprimé dans le sous-type moléculaire positif aux récepteurs hormonaux. Par la suite, nous avons sélectionné une lignée cellulaire pour poursuivre nos expériences. Nous avons choisi la lignée de cancer du sein ZR-75-1 parce qu’elle provient du sous-type positif aux récepteurs hormonaux et qu’elle exprime PACE4. En culture cellulaire, nous avons comparé la croissance de cellules ZR-75-1 modifiées qui sous-exprimaient furine, PACE4 ou PC7. Lors de ces expériences, PACE4 était la seule PC importante pour la prolifération cellulaire. L’importance de PACE4 pour la croissance tumorale a aussi été confirmée in vivo à l’aide d’un modèle de xénogreffes de cellules ZR-75-1 chez des souris immunosupprimées. Les inhibiteurs peptidiques spécifiques à PACE4 C23 et Multi-Leu (ML) ont aussi été testés en culture cellulaire où ils étaient en mesure de diminuer la prolifération des cellules ZR-75-1 et MCF-7. Nous avons aussi démontré, à l’aide d’un peptide ML radiomarqué, que l’expression de PACE4 est nécessaire pour que les peptides inhibiteurs pénètrent dans la cellule. De plus, le peptide C23, lorsqu’administré systémiquement à des souris immunosupprimées portant des tumeurs de cancer du sein, était en mesure de diminuer la croissance tumorale. De manière intéressante, les tumeurs sous-exprimant PACE4 et celles traitées avec le peptide C23 démontraient un ralentissement de la croissance tumorale similaire. De plus, lorsque ces tumeurs ont été analysées en immunohistochimie, elles possédaient une diminution du marqueur de prolifération Ki67 et une augmentation de cellules positives aux marqueurs d’arrêt du cycle cellulaire p27KIP1 et p21Waf1/Cip1 comparativement aux tumeurs contrôles. Pour conclure, la sous-expression de PACE4 et l’administration systémique d’un inhibiteur de PACE4 en culture cellulaire ainsi que dans un modèle de xénogreffe résultent en une diminution de la prolifération néoplasique. Nos résultats suggèrent que PACE4 est une cible intéressante dans le cancer du sein positif aux récepteurs hormonaux. / Abstract: Breast cancer is the most frequent and deadly malignancy in women worldwide. Despite national screening prog rams combined with new treatments relapse rate remain high and new therapies are needed. Even in industrialized country like Canada, it is still the second most deadly cancer in women. From previous work, we identified PACE4, a member of the proprotein convertases (PCs) family of endoproteases, as a novel therapeutic target in prostate cancer. In the present study, we examined whether PACE4 could also be a potential target in breast cancer. In clinical samples of breast adenocarcinoma, we observed a specific overexpression of PACE4 in the estrogen-receptor-positive (ER+) subtype. We therefore looked for a breast cancer cell line model which would be representative and thus focused on ZR-75-1 since it both expresses PACE4 and is estrogen-receptor-positive. We compared stable knockdowns of furin, PACE4 and PC7 in the estrogen-receptor-positive cell line ZR-75-1 to evaluate their respective contribution to cell growth and tumor progression. PACE4 was found to be the only PC displaying a decrease in cell growth. The impact of PACE4 on tumor growth was also confirmed in vivo with xenograft of the ZR-75-1 cell line in athymic nude mice. PACE4 specific peptide-based inhibitors (C23 and Multi-Leu) were tested and shown to decrease prolife ration of ZR-75-1 cells in cell-based assays. We also confirmed that PACE4 expression was necessary for its specific peptide-based inhibitors to penetrates in the cell using a radiolabeled Multi-Leu peptide. Moreover, the systemic administration of C23 had a potent effect on tumor growth on xenografts of the ZR-75-1 cell line. Interestingly, PACE4-silencing and systemic administration of the PACE4 inhibitor C23 resulted in similar slowed tumor growth in vivo. Furthermore, these tumors demonstrated lower Ki67 proliferative indices with increased cell quiescence assessed with p27 KIP1 and p21 Waf1/Cip1 biomarkers. To conclude, PACE4-silencing and systemic administration of a PACE4 inhibitor result in hindered tumor progression and slower cellular proliferation. Our results suggest that PACE4 is a promising target for estrogen-receptor-positive breast cancer.

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Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent chez les hommes et la capacité des tumeurs à développer une résistance face aux thérapies anti-androgéniques vient souvent compromettre le pronostic des patients. Le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin de circonvenir à la progression de ces tumeurs représente un besoin important la gestion de ce type de cancer. Plusieurs démonstrations récentes établissent l’implication de la famille des proprotéines convertases dans la progression tumorale. Ces enzymes ont pour fonctions biologiques de cliver une variété de précurseurs protéiques jouant des rôles importants dans la tumorigénèse. Dans le cancer de la prostate, la proprotéine convertase PACE4 est fortement surexprimée dans les cellules cancéreuses et joue un rôle dans la prolifération et la capacité à former des tumeurs, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt. En ce sens, des inhibiteurs peptidomimétiques ont été développés dans l’optique de la thérapie ciblée contre la PACE4. Toutefois, dans le but de développer une approche thérapeutique optimale, il convient néanmoins de comprendre le niveau de redondance fonctionnelle entre les différents membres de la famille des convertases, qui sont connus pour partager plusieurs de leurs substrats, ainsi que les mécanismes moléculaires régissant l’activité de la PACE4 et de ses substrats sous-jacents. L’utilisation d’une approche de répression génique stable envers les différentes convertases a permis de mettre en lumière les fonctions uniques de la PACE4 dans la progression tumorale. De plus, grâce à une approche de protéomique comparative, le premier substrat de la PACE4 dans le cancer de la prostate; le growth differenciation factor 15, a été découvert. Ce substrat permet de commencer à dresser l’implication de PACE4 dans le paysage moléculaire du cancer de la prostate. Grâce à des modalités d’imagerie moléculaire, l’emploi de versions radiomarquées des inhibiteurs peptidiques a également permis de démontrer que les composés s’accumulent dans les cellules cancéreuses en fonction des niveaux de PACE4 présents, et ce, tant in cellulo qu’in vivo. Ces données suggèrent un potentiel pour le développement d’un examen théranostique pour prédire la réponse tumorale à la pharmacothérapie anti-PACE4. Finalement, l’analyse de l’épissage alternatif de l’ARNm de PACE4 a permis l’élucidation des caractéristiques biochimiques et des fonctions spécifiques d’une nouvelle isoforme; la PACE4-altCT, qui est exprimée chez les cellules cancéreuses de la prostate, mais aussi d’autres types de cancer. Cette découverte a permis de redéfinir le modèle de travail en intégrant le concept de la rétention intracellulaire de cette isoforme qui semble médier la plupart de l’activité pro-proliférative reliée à l’activité PACE4, ce qui en fait la cible pharmacologique principale des inhibiteurs peptidiques dans le cancer de la prostate, mais aussi un biomarqueur potentiel. / Abstract: Prostate cancer is the most common cancer among men. The capabilities of tumors to adapt and overcome antiandrogenic therapy is persistently worsening patient’s prognostic and the development of novel therapeutic approaches to circumvent tumor progression therefore represents an unmet need. Many reports now demonstrate the implication of the enzymes from the proprotein convertase family in the progression of tumor from many cancer types. These enzymes are responsible for the processing of various protein precursors playing important roles in tumorigenesis. In prostate cancer, the proprotein convertase PACE4 is strongly overexpressed in cancer cells and plays a role in cell proliferation and tumor formation thus making a strong case for its use as a pharmacological target. For this reason, PACE4 peptidomimetic inhibitors were generated to develop PACE4-targeted therapies. However, to develop an optimal therapeutic approach regarding the inhibition of this enzyme, a complete understanding of the level of functional redundancy between the different convertases in prostate cancer is needed. Moreover, understanding the molecular mechanisms both upstream and downstream of PACE4 in prostate cancer cells would allow a better understanding of the considerations underneath such a therapeutic strategy. Using a stable gene silencing approach to knockdown all co-expressed member of the convertase family in prostate cancer cells, the roles of PACE4 in tumor progression were found to be unique and non-redundant among the other family member. Through a comparative proteomic approach, the first PACE4-specific substrate in prostate cancer; growth and differentiation factor 15, was identified. With this substrate growth factor, it is now possible to initiate the dissection of PACE4 biochemical functions in the prostate cancer molecular landscape. Using a radiolabelled version of the PACE4 peptide inhibitors, it was possible to demonstrate using molecular imaging that when applied in cellulo and in vivo, the compound is uptaken by cancer cells as well as by tissues according to their PACE4 expression levels. These data suggest that such PACE4 molecular imaging with pharmacological inhibitor could be developed as a theranostic assay to predict which tumor could be treated by PACE4-targetted therapy. Lastly, PACE4 mRNA alternative splicing analysis permitted the discovery of a new PACE4 isoform; named PACE4-altCT, which is strongly overexpressed by prostate cancer cells as well as other cancer types. As this isoform displays specific biochemical features and functions, notably being intracellularly retained and mediating most of the PACE4-associated cell growth capabilities, this discovery further redefined our working model, pointing to PACE4-altCT as the pharmacological target of inhibitory peptides in prostate cancer as well as a potential biomarker.