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Yes / Background: This study proposes a decision support system created in collaboration with machine learning experts and ophthalmologists for detecting keratoconus (KC) severity. The system employs an ensemble machine model and minimal corneal measurements. Methods: A clinical dataset is initially obtained from Pentacam corneal tomography imaging devices, which undergoes pre-processing and addresses imbalanced sampling through the application of an oversampling technique for minority classes. Subsequently, a combination of statistical methods, visual analysis, and expert input is employed to identify Pentacam indices most correlated with severity class labels. These selected features are then utilized to develop and validate three distinct machine learning models. The model exhibiting the most effective classification performance is integrated into a real-world web-based application and deployed on a web application server. This deployment facilitates evaluation of the proposed system, incorporating new data and considering relevant human factors related to the user experience. Results: The performance of the developed system is experimentally evaluated, and the results revealed an overall accuracy of 98.62%, precision of 98.70%, recall of 98.62%, F1-score of 98.66%, and F2-score of 98.64%. The application's deployment also demonstrated precise and smooth end-to-end functionality. Conclusion: The developed decision support system establishes a robust basis for subsequent assessment by ophthalmologists before potential deployment as a screening tool for keratoconus severity detection in a clinical setting.

No / Orthokeratology (ortho-k) is the process of deliberately reshaping the anterior cornea by utilising specialty contact lenses to temporarily and reversibly reduce refractive error after lens removal. Modern ortho-k utilises reverse geometry lens designs, made with highly oxygen permeable rigid materials, worn overnight to reshape the anterior cornea and provide temporary correction of refractive error. More recently, ortho-k has been extensively used to slow the progression of myopia in children. This report reviews the practice of ortho-k, including its history, mechanisms of refractive and ocular changes, current use in the correction of myopia, astigmatism, hyperopia, and presbyopia, and standard of care. Suitable candidates for ortho-k are described, along with the fitting process, factors impacting success, and the potential options for using newer lens designs. Ocular changes associated with ortho-k, such as alterations in corneal thickness, development of microcysts, pigmented arcs, and fibrillary lines are reviewed. The safety of ortho-k is extensively reviewed, along with an overview of non-compliant behaviours and appropriate disinfection regimens. Finally, the role of ortho-k in myopia management for children is discussed in terms of efficacy, safety, and potential mechanisms of myopia control, including the impact of factors such as initial fitting age, baseline refractive error, the role of peripheral defocus, higher order aberrations, pupil size, and treatment zone size. / The CLEAR initiative was facilitated by the BCLA, with financial support by way of Educational Grants for collaboration, publication and dissemination provided by Alcon and CooperVision.

Yes / We report a technique for the fabrication of micropockets within electrospun membranes in which to study cell behavior. Specifically, we describe a combination of microstereolithography and electrospinning for the production of PLGA (Poly(lactide-co-glycolide)) corneal biomaterial devices equipped with microfeatures.

Yes / Tissue engineering is one of the most promising areas for treatment of various ophthalmic diseases particularly for patients who suffer from limbal stem cell deficiency and this is due to the lack of existence of appropriate matrix for stem cell regeneration. The aim of this research project is to design and fabricate triple layered electrospun nanofibers as a suitable corneal tissue engineering scaffold and the objective is to investigate and perform various in vitro tests to find the most optimum and suitable scaffold for this purpose. Electrospun scaffolds were prepared in three layers. Poly(d, l-lactide-co-glycolide; PLGA, 50:50) nanofibers were electrospun as outer and inner layers of the scaffold and aligned type I collagen nanofibers were electrospun in the middle layer. Furthermore, the scaffolds were cross-linked by 1-ethyl-3-(3 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and glutaraldehyde. Structural, physical, and mechanical properties of scaffolds were investigated by using N2 adsorption/desorption isotherms, Fourier transform infrared spectroscopy, contact angle measurement, tensile test, degradation, shrinkage analysis, and scanning electron microscopy (SEM). In addition, capability to support cell attachment and viability were characterized by SEM, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay, and 4′,6-diamidino-2-phenylindole staining. According to the result of Brunauer–Emmett–Teller analysis, specific surface area of electrospun scaffold was about 23.7 m2 g-1. Tensile tests on cross-linked scaffolds represented more suitable hydrophilicity and tensile behavior. In addition, degradation rate analysis indicated that noncross-linked scaffolds degraded faster than cross-linked one and cross-linking led to controlled shrinkage in the scaffold. The SEM analysis depicted nano-sized fibers in good shape. Also, the in vitro study represented an improved cell attachment and proliferation in the presence of human endometrial stem cells for both cross-linked and noncross-linked samples. The current study suggests the possibility of producing an appropriate substrate for successful cornea tissue engineering with a novel design. / Deputy of Research, Tehran University of Medical Science. Grant Number: 93‐01‐33‐25613

Justification: Le glaucome entraîne une perte progressive de la vision causée par la détérioration du nerf optique. Le glaucome est répandu dans le monde et cause la cécité dans environ sept millions de personnes. Le glaucome touche plus de 400 000 Canadiens et sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population.1,2 Il s'agit d'une maladie chronique surnoise dont les symptômes se manifestent uniquement lors des stades avancés et qui peuvent mener à la cécité. Présentement, le seul moyen possible d’arrêter la progression du glaucome au stade initial est de diminuer la pression intra-oculaire (PIO). Les analogues de prostaglandines (APG) topiques sont fréquemment utilisées comme traitement de première ligne. Cependant, la recherche démontre que cette classe de médicaments peut changer certaines propriétés de la cornée, et possiblement influencer la mesure de la PIO.3 Objectif: À déterminer si l'utilisation d'APG affecte les propriétés biomécaniques de la cornée. La conclusion sera basée sur l'analyse intégrée des résultats obtenus de l'analyseur Reichert oculaire Réponse (ORA), la tonométrie par applanation de Goldmann (TAG) et la pachymétrie ultrasonographique. Le deuxième objectif potentiel de cette étude est de déterminer la corrélation, le cas échéant, entre les propriétés biomécaniques de la cornée, l'épaisseur de la cornée centrale (ECC) et la PIO chez les patients subissant un traitement d’APG topique. L'hypothèse principale de cette étude est que l’APG influence les propriétés de la cornée telles que l'épaisseur centrale, l'élasticité et la résistance. Patients et méthodes : Soixante-dix yeux de 35 patients, âgés de 50-85 ans, atteints de glaucome à angle ouvert (GAO) et traités avec APG topique ont été examinés. Seulement les sujets avec une réfraction manifeste entre -6,00 D et +4,25 D ont été inclus. Les critères d'exclusion sont: patients avec n'importe quelle autre maladie de la cornée de l’œil, telles que la dystrophie endothéliale de Fuch’s et kératocône, ou tout antécédent de traumatisme ou d'une chirurgie de la cornée, ainsi que le port de lentilles de contact. Nous avons demandé aux patients atteints du glaucome qui ont des paramètres stables et qui utilisent l’APG dans les deux yeux de cesser l’APG dans l'œil moins affecté par la PIO, et de continuer l’utilisation d’APG dans l'œil contralatéral. Le meilleur œil est défini comme celui avec moins de dommage sur le champ visuel (CV) (déviation moyenne (DM), le moins négatif) ou une PIO maximale historique plus basse si la DM est égale ou encore celui avec plus de dommage sur la tomographie par cohérence optique (TCO, Cirrus, CA) ou la tomographie confocale par balayage laser (HRT, Heidelberg, Allemagne). Toutes les mesures ont été prises avant la cessation d’APG et répétées 6 semaines après l’arrêt. Les patients ont ensuite recommencé l’utilisation d’APG et toutes les mesures ont été répétées encore une fois après une période supplémentaire de 6 semaines. Après commencer ou de changer le traitement du glaucome, le patient doit être vu environ 4-6 semaines plus tard pour évaluer l'efficacité de la goutte.4 Pour cette raison, on été décidé d'utiliser 6 semaines d'intervalle. Toutes les mesures ont été effectuées à l’institut du glaucome de Montréal par le même technicien, avec le même équipement et à la même heure de la journée. L'œil contralatéral a servi comme œil contrôle pour les analyses statistiques. La tonométrie par applanation de Goldmann a été utilisée pour mesurer la PIO, la pachymétrie ultrasonographique pour mesurer l'ECC, et l’ORA pour mesurer les propriétés biomécaniques de la cornée, incluant l'hystérèse cornéenne (HC). L’hypothèse de l'absence d'effet de l'arrêt de l’APG sur les propriétés biomécaniques a été examiné par un modèle linéaire à effets mixtes en utilisant le logiciel statistique R. Les effets aléatoires ont été définies à deux niveaux: le patient (niveau 1) et l'œil de chaque patient (niveau 2). Les effets aléatoires ont été ajoutés au modèle pour tenir compte de la variance intra-individuelle. L’âge a également été inclus dans le modèle comme variable. Les contrastes entre les yeux et les temps ont été estimés en utilisant les valeurs p ajustées pour contrôler les taux d'erreur internes de la famille en utilisant multcomp paquet dans R. Résultats: Une augmentation statistiquement significative due l 'HC a été trouvée entre les visites 1 (sur APG) et 2 (aucun APG) dans les yeux de l'étude, avec une moyenne (±erreur standard) des valeurs de 8,98 ± 0,29 mmHg et 10,35 ± 0,29 mmHg, respectivement, correspondant à une augmentation moyenne de 1,37 ± 0,18 mmHg (p <0,001). Une réduction significative de 1,25 ± 0,18 mmHg (p <0,001) a été observée entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne HC finale de 9,09 ± 0,29 mmHg. En outre, une différence statistiquement significative entre l’oeil d’étude et le contrôle n'a été observée que lors de la visite 2 (1,01 ± 0,23 mmHg, p <0,001) et non lors des visites 1 et 3. Une augmentation statistiquement significative du facteur de résistance conréen (FRC) a été trouvée entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 10,23 ± 0,34 mmHg et 11,71 ± 0,34 mmHg, respectivement. Le FRC a ensuite été réduit de 1,90 ± 0,21 mmHg (p <0,001) entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne FRC finale de 9,81 ± 0,34 mmHg. Une différence statistiquement significative entre l’oeil d’étude et le contrôle n'a été observée que lors de la visite 2 (1,46 ± 0,23 mmHg, p <0,001). Une augmentation statistiquement significative de l'ECC a été trouvée entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 541,83 ± 7,27 µm et 551,91 ± 7,27 µm, respectivement, ce qui correspond à une augmentation moyenne de 10,09 ± 0,94 µm (p <0,001). L'ECC a ensuite diminué de 9,40 ± 0,94 µm (p <0,001) entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne finale de 542,51 ± 7,27 µm. Une différence entre l’étude et le contrôle des yeux n'a été enregistré que lors de la visite 2 (11,26 ± 1,79 µm, p <0,001). De même, on a observé une augmentation significative de la PIO entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 15,37 ± 0,54 mmHg et 18,37 ± 0,54 mmHg, respectivement, ce qui correspond à une augmentation moyenne de 3,0 ± 0,49 mmHg (p <0,001). Une réduction significative de 2,83 ± 0,49 mmHg (p <0,001) a été observée entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne de la PIO finale de 15,54 ± 0,54 mmHg. L’oeil de contrôle et d’étude ne différaient que lors de la visite 2 (1,91 ± 0,49 mmHg, p <0,001), ce qui confirme l'efficacité du traitement de l’APG. Lors de la visite 1, le biais de la PIO (PIOcc - PIO Goldmann) était similaire dans les deux groupes avec des valeurs moyennes de 4,1 ± 0,54 mmHg dans les yeux de contrôles et de 4,8 ± 0,54 mmHg dans les yeux d’études. Lors de la visite 2, après un lavage de 6 semaines d’APG, le biais de la PIO dans l'œil testé a été réduit à 1,6 ± 0,54 mmHg (p <0,001), ce qui signifie que la sous-estimation de la PIO par TAG était significativement moins dans la visite 2 que de la visite 1. La différence en biais PIO moyenne entre l'étude et le contrôle des yeux lors de la visite 2, en revanche, n'a pas atteint la signification statistique (p = 0,124). On a observé une augmentation peu significative de 1,53 ± 0,60 mmHg (p = 0,055) entre les visites 2 et 3 dans les yeux de l'étude, avec une valeur de polarisation finale de la PIO moyenne de 3,10 ± 0,54 mmHg dans les yeux d'études et de 2,8 ± 0,54 mmHg dans les yeux de contrôles. Nous avons ensuite cherché à déterminer si une faible HC a été associée à un stade de glaucome plus avancé chez nos patients atteints du glaucome à angle ouvert traités avec l’APG. Lorsque l'on considère tous les yeux sur l’APG au moment de la première visite, aucune association n'a été trouvée entre les dommages sur le CV et l'HC. Cependant, si l'on considère seulement les yeux avec un glaucome plus avancé, une corrélation positive significative a été observée entre la DM et l'HC (B = 0,65, p = 0,003). Une HC inférieure a été associé à une valeur de DM de champ visuelle plus négative et donc plus de dommages liés au glaucome. Conclusions : Les prostaglandines topiques affectent les propriétés biomécaniques de la cornée. Ils réduisent l'hystérèse cornéenne, le facteur de résistance cornéen et l'épaisseur centrale de la cornée. On doit tenir compte de ces changements lors de l'évaluation des effets d’APG sur la PIO. Plus de recherche devrait être menées pour confirmer nos résultats. De plus, d’autres études pourraient être réalisées en utilisant des médicaments qui diminuent la PIO sans influencer les propriétés biomécaniques de la cornée ou à l'aide de tonomètre dynamique de Pascal ou similaire qui ne dépend pas des propriétés biomécaniques de la cornée. En ce qui concerne l'interaction entre les dommages de glaucome et l'hystérésis de la cornée, nous pouvons conclure qu' une HC inférieure a été associé à une valeur de DM de CV plus négative. Mots Clés glaucome - analogues de prostaglandines - hystérèse cornéenne – l’épaisseur de la cornée centrale - la pression intraoculaire - propriétés biomécaniques de la cornée. / Rationale: Glaucoma is a chronic disease that causes a gradual loss of vision due to progressive damage to the optic nerve. It is widespread in the world and causes blindness in about seven million people. In addition, it affects more than 400,000 Canadians and its prevalence is increasing with the aging of the population.1, 2 Glaucoma becomes symptomatic only in the more advanced stages of the disease, and currently, the goal of treatment is to halt the progression of the disease by lowering the intra-ocular pressure (IOP). Topical prostaglandin analogs (PGA) are currently the first line treatment, however research has shown that this class of medications may change certain properties of the cornea, and hence the measurement of IOP.3 Aim: To determine whether the use of topical prostaglandin analogs (PGA) affects the biomechanical properties of the cornea. The conclusion will be based on the integrated analysis of the data collected from the Reichert Ocular Response Analyzer (ORA), Goldmann tonometry and ultrasound pachymetry. The second potential aim of this study is to determine the correlations, if any, between the biomechanical properties of cornea, the Central Corneal Thickness (CCT) and IOP in patients undergoing topical PGA treatment. The main hypothesis of this study is that the PGA drops influence the properties of the cornea such as central thickness, elasticity and resistance. Patients and Methods: In this study, seventy eyes of 35 patients, aged 50 - 85 years, with open angle glaucoma (OAG) and treated with topical PGA were examined. Only subjects with a manifest refraction between -6.00 D and +4.25 D were included. Exclusion criteria included patients with any other corneal eye disease, such as Fuch’s endothelial dystrophy or keratoconus, or any past history of corneal trauma or surgery. Contact lens wearers were also excluded. Patients with stable glaucoma parameters who were using topical PGA in both eyes prior to the start of the study were asked to discontinue the PGA in the best eye and to continue the application of PGA to the contralateral eye. The "best" eye, representing the eye with the least amount of glaucoma-related damage, was selected based on the results of the Humphrey Visual Field (HFA, Carl Zeiss Meditec, Inc., Dublin, CA), Heidelberg Retinal Tomography (HRT II, Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Germany), Optical Coherence Tomography (CIRRUS HD-OCT, Carl Zeiss Meditec, Inc., Dublin, CA) and maximum IOP. The contralateral eye served as a control for statistical analyses. Corneal measurements were taken before PGA cessation and repeated 6 weeks after cessation. Patients then restarted the use of PGA and all measurements were repeated once more after an additional 6 weeks. After starting or changing glaucoma treatment the patient should be seen approximately 4-6 weeks later to assess efficacy of the drop.4 For this reason it was decided to use 6 weeks interval. All measurements were performed at The Montreal Glaucoma Institute by the same trained technician, with the same equipment and at the same time of day. Goldmann applanation tonometry was used to measure the patient’s intraocular pressure (IOP), ultrasound pachymetry was used to measure central corneal thickness (CCT) and the ORA provided the measurements of the corneal biomechanical properties, including corneal hysteresis (CH). The hypothesis of no effect regarding the discontinuation of PGA on the biomechanical properties was examined by a linear mixed-effect model using the nlme package in R. Random-effects was defined on two levels: the patient (level-1) and the eye within each patient (level-2). Those random-effects were added to the model to account for the intra-individual variance due to the repeated-measure design. Age was also included in the model as a covariate. Contrasts between the eyes and times were estimated using adjusted p-values to control for familywise error rate using multcomp package in R. Results: A statistically significant increase in CH was found between Visit 1 (on PGA) and Visit 2 (no PGA) in the study eyes, with mean (±Standard Error) values of 8.98 ± 0.29 mmHg and 10.35 ± 0.29 mmHg, respectively, corresponding to a mean increase of 1.37 ± 0.18 mmHg (p < 0.001). A significant reduction of 1.25 ± 0.18 mmHg (p < 0.001) was also observed between Visits 2 and 3, with a final mean CH value of 9.09 ± 0.29 mmHg. In addition, a statistically significant difference between the study and control eyes was only observed at Visit 2 (1.01 ± 0.23 mmHg; p < 0.001) and not at Visits 1 and 3. A statistically significant increase in Corneal Resistance Factor (CRF) was found between Visits 1 and 2 in the study eyes, with mean values of 10.23 ± 0.34 mmHg and 11.71 ± 0.34 mmHg, respectively. CRF was then reduced by 1.90 ± 0.21 mmHg (p < 0.001) between Visits 2 and 3, with a final mean CRF value of 9.81 ± 0.34 mmHg. A statistically significant difference between the study and control eyes was only observed at Visit 2 (1.46 ± 0.23 mmHg; p < 0.001). A statistically significant increase in CCT was found between Visits 1 and 2 in the study eyes, with mean values of 541.83 ± 7.27 µm and 551.91 ± 7.27 µm respectively, corresponding to a mean increase of 10.09 ± 0.94 µm (p < 0.001). CCT then decreased by 9.40 ± 0.94 µm (p < 0.001) between Visits 2 and 3, with a final mean value of 542.51 ± 7.27 µm. A difference between the study and control eyes was only recorded at Visit 2 (11.26 ± 1.79 µm; p < 0.001). Similarly, a significant increase in IOP was observed between Visits 1 and 2 in the study eyes, with mean values of 15.37 ± 0.54 mmHg and 18.37 ± 0.54 mmHg respectively, corresponding to a mean increase of 3.0 ± 0.49 mmHg (p < 0.001). A significant reduction of 2.83 ± 0.49 mmHg (p < 0.001) was observed between Visits 2 and 3, with a final mean IOP value of 15.54 ± 0.54 mmHg. The control and study eyes only differed at Visit 2 (1.91 ± 0.49 mmHg; p < 0.001), confirming the effectiveness of PGA treatment. At Visit 1, the IOP bias (IOPcc – Goldmann IOP) was similar in both groups, all eyes at that time being on long term PGA medication, with mean values of 4.1 ± 0.54 mmHg in the control eyes and 4.8 ± 0.54 mmHg in the study eyes. At Visit 2, after a 6 week washout of PGAs, the IOP bias in the tested eye was reduced to 1.6 ± 0.54 mmHg (p<0.001), meaning that underestimation of IOP by Goldmann tonometry was significantly less than at Visit 1. The difference in mean IOP bias between the study and control eyes at Visit 2, however, did not reach statistical significance (p= 0.124). A marginally significant increase of 1.53 ± 0.60 mmHg (p = 0.055) was observed between Visits 2 and 3 in the study eyes, with a final mean IOP bias value of 3.10 ± 0.54 mmHg in the study eyes and 2.8 ± 0.54 mmHg in the control eyes. We then tried to determine if a low CH was associated with signs of more severe glaucoma progression among our open-angle glaucoma patients treated with PGA. When considering all eyes on PGA at the time of the first Visit, no association was found between VF damage and CH. However, when considering only eyes with more advanced glaucoma, a significant positive correlation was observed between VF MD and CH (B = 0.65; p = 0.003). A lower CH was associated with a more negative visual field MD value and thus greater glaucoma-related damage. Conclusions: Topical prostaglandin analogs reduce CH, CRF, CCT and IOP in glaucomatous eyes. The changes in CH and CCT influence the measurement of IOP, and therefore, these changes should be taken into account when evaluating IOP lowering response to PGA medications. To discern an interaction between IOP and corneal hysteresis, further research should be conducted with intraocular pressure control. It can be achieved by using systemic medications that decrease IOP and do not influence biomechanical properties. It can also be achieved by using Pascal dynamic contour tonometry or a similar tonometer that does not depend on the biomechanical properties of the cornea. Regarding the interaction between severity of glaucoma damage and corneal hysteresis, it was demonstrated that a lower CH was associated with a more negative visual field MD value. Key Words glaucoma – prostaglandin analogs – corneal hysteresis – central corneal thickness – intraocular pressure – biomechanical properties of the cornea.

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées. / Introduction : Despite their growth arrest in vivo, corneal endothelial cells (CEC) can be amplified in vitro. Their subsequent transplantation by cell-injection therapy could overcome the tissue scarcity associated with traditional allo-transplantation, which is the only currently available treatment for irreversible corneal endothelial failure. Objective : To evaluate the functionality of a corneal endothelium reconstituted by cell- injection therapy in the feline. Methods: The right eyes of 16 animals underwent surgery. Eight underwent central endothelial scraping and injection with 2x10e5 (n=4) or 1x10e6 (n=4) feline CEC supplemented with Y-27632 and labeled with SP-DiOC18(3). After total scraping, two eyes were injected with 1x10e6 labeled CEC and Y-27632. The central (n=3) or entire (n=3) endothelium was scraped in six controls followed by Y-27632 injection without CEC. Outcomes included clinical performance, anatomical integrity, functional phenotype and SP-DiOC18(3) expression of the new endothelium. Results: Corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls performed the best clinically. Entirely scraped controls remained hazy and thick. Histopathology revealed a confluent, functional endothelial monolayer in corneas grafted with 2x10e5 CEC and centrally scraped controls, a non-uniform, non-functional endothelial multilayer in centrally scraped corneas grafted with 1x10e6 CEC, and a non-functional fibrotic endothelium in entirely scraped grafts and controls. SP-DiOC18(3) was scarce in grafts and absent in controls. Conclusion : Cell-injection therapy reconstituted an incompletely functional endothelium, to which injected CEC contributed little. Y-27632 injection without CEC reconstituted the healthiest endothelium. Further studies investigating the therapeutic effect of Y-27632 alone are warranted.

Le contrôle de la transparence de la cornée dépend de l'intégrité de l'endothélium cornéen mono-stratifié qui est classiquement considéré dès la naissance, dépourvu de capacité de régénération chez l’homme. Dans des conditions pathologiques conduisant à la cécité par œdème cornéen, les pertes significatives en cellules endothéliales (CE) ne sont pas remplacée efficacement, ce qui signifie que ni de nouvelles CE provenant de cellules souches (CS), ni la division des cellules voisines des lésions ne peuvent contribuer à la régénération endothéliale. Toutefois, plusieurs travaux ont prouvé depuis 25 ans que les CE possédaient une capacité proliférative résiduelle ex vivo et deux équipes ont suggéré l’existence de CS ou de progéniteurs à la périphérie de l’endothélium cornéen. Dans notre travail de thèse, nous avons tout d'abord optimisé, en la systématisant, une technique d’immunomarquage spécialement adaptée à l'endothélium cornéen intact de cornées montées à plat. A l’issue de ces développements, nous disposons de protocoles simples de fixation à température optimale et de démasquages antigéniques susceptibles de permettre la révélation de nombreuses protéines. A partir d’une importante série de cornées humaines non conservées et d’autres conservées en organoculture, et grâce à cet outil désormais efficace, nous avons étudié le cycle cellulaire des CE et la localisation de potentielles CS sur l’endothélium cornéen humaine. Nos résultats démontrent que dans ces conditions, les CE expriment de façon homogène des régulateurs positifs (PCNA, MCM2, cycline D1, cycline E et cycline A) et des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (P16, P27); certaines particularités ont par ailleurs pu être décrites de façon innovante, comme la localisation cytoplasmique diffuse de MCM2, paranucléaire de la cycline D1, l’absence de P21. L’ensemble des marquages pourrait suggérer que les CE sont arrêtées en fin de G1, après le point de restriction et que de nombreux mécanismes de réparation de l’ADN sont mis en jeux dans les CE exposées à un stress oxydant important tout au long de l’existence. Nous avons identifié une nouvelle organisation de la micro-anatomie de la périphérie et de l'extrême périphérie de l’endothélium où des cellules regroupées en multiples clusters pluristratifiés semblent alimenter des colonnes de CE radiaires longues d'un millimètre. Ces éléments, associés à l’observation d'une moindre différenciation et d’une compétence proliférative plus élevés en périphérie suggèrent un nouveau modèle d’homéostasie endothéliale humaine in vivo: toute la vie, des CS périphériques alimentent de façon très lente la périphérie cornéenne en CE qui migrent de façon centripète pour assurer la stabilité du centre cornéen dont les propriétés optiques primordiales sont sous-tendues par un endothélium qui ne perd que 0,6% de CE par an. A la différence de l’épithélium cornéen, ce système ne peut être accéléré lors de circonstances pathologiques. Les perspectives de nos travaux sont désormais d’essayer d’isoler de l’extrême périphérie les CS endothéliales ou les progéniteurs et de les cultiver en recréant un microenvironnement favorable. La possibilité de produire un grand nombre de CE in vitre non pas à partir de CE sénescentes prélevées sur la totalité de l’endothélium comme cela a été tenté par la passé, mais cette fois à partir de CS ou des progéniteurs ouvriraient la voie d'une véritable thérapie cellulaire endothéliale. L'enrichissement des greffons pendant la durée de leur conservation à la banque de cornée pourrait constituer une première étape majeure avant d’envisager créer de novo un endothélium sur un support greffable pour une greffe endothéliale du 3e type qui deviendrait ainsi enfin indépendante des aléas de la découpe du greffon. Enfin, l’ïdentification de la CS endothéliale et de son microenvironnement permettra aussi d'envisager une thérapie cellulaire in vivo pour traiter les stades précoces des pathologies endothéliales cornéennes / The control of corneal transparency depends on the integrity of the mono-stratified corneal endothelium, which is considered devoid of regenerative capacity after birth in humans. In pathological conditions leading to blindness by irreversible corneal edema, the significant losses of endothelial cells (ECs) are not replaced efficiently, indicating that neither new ECs derived from stem cells (SC) nor the division of ECs neighboring the lesions can contribute to a form of regeneration. However, several works of the last 25 years demonstrated that ECs possess residual capacity of proliferation ex vivo, and more recently, two teams suggested the existence of SC or endothelial progenitors located in the corneal periphery. In this thesis work, we have firstly optimized an immunostaining technique specially adapted to intact endothelium of flat mounted whole corneas. Consequently, we now have simple protocols of fixation at the right temperature, and of antigen retrieval that allow detecting multiple proteins with a clear subcellular localization. Using important series of non-stored and of organ cultured corneas, and thanks to this technique, we investigated the cell cycle status of ECs and the location of potential SC in human corneal endothelium. Our results indicate that ECs homogeneously express positive regulators (PCNA, MCM2, cyclin D1, cyclin E and cyclin A) as well as negative regulators of the cell cycle (P16, P27); several original descriptions have been made: diffuse cytoplasmic location of MCM2, paranuclear location of cyclin D1, absence of P21. The expression patterns suggest that ECS could be arrested after the restriction point of the G1 phase and that numerous mechanism of DNA repair are stimulated in ECs exposed to an important oxidative stress throughout live. We identified a novel organization of the micro-anatomy of the endothelial periphery and extreme-periphery, where cells accumulate in multiple small multilayered clusters connected radial centripetal cell rows of nearly 1 mm of length. Associated with the observation of a lesser differentiation and an increased proliferation capacity in this area, these elements suggest a novel model of endothelial homeostasis in humans: during life, SC continuously and extremely slowly sustain the endothelial periphery with new ECs that migrate toward centre forming cells rows. These cells ensure the stability of the center, which optical fundamental properties require a perfect stability, as indicated by an annual cell loss of only 0.6%. Contrary to the corneal epithelium, this system is incapable of accelerations in case of important cell loss. Further studies are necessary to understand this limitation. Our works offer several perspectives: the next step is to isolate the SC or the progenitors from the extreme periphery and to cultivate them in an adapted microenvironment. The possibility to cultivate endothelial cells directly from SC or progenitors and not, as previously tried in the past, from senescent EC from the whole endothelium open the way of a true endothelial cell therapy. The increase of endothelial cell density during corneal storage by eye banks could be a first step before developing bioengineered endothelium on a specific carrier that could be implanted in the recipient eye. Finally, the identification of SC and of its microenvironment would allow developing the basis of an in vivo cell therapy able to treat early stages of endothelial dysfunctions