La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.

Diabetic Peripheral Neuropathy (DPN) is one of the most common types of diabetes that can affect the cornea. An accurate analysis of the corneal epithelium nerve structures and the corneal endothelial cell can assist early diagnosis of this disease and other corneal diseases, which can lead to visual impairment and then to blindness. In this thesis, fully-automated segmentation and quantification algorithms for processing and analysing sub-basal epithelium nerves and endothelial cells are proposed for early diagnosis of diabetic neuropathy in Corneal Confocal Microscopy (CCM) images. Firstly, a fully automatic nerve segmentation system for corneal confocal microscope images is proposed. The performance of the proposed system is evaluated against manually traced images with an execution time of the prototype is 13 seconds. Secondly, an automatic corneal nerve registration system is proposed. The main aim of this system is to produce a new informative corneal image that contains structural and functional information. Thirdly, an automated real-time system, termed the Corneal Endothelium Analysis System (CEAS) is developed and applied for the segmentation of endothelial cells in images of human cornea obtained by In Vivo CCM. The performance of the proposed CEAS system was tested against manually traced images with an execution time of only 6 seconds per image. Finally, the results obtained from all the proposed approaches have been evaluated and validated by an expert advisory board from two institutes, they are the Division of Medicine, Weill Cornell Medicine-Qatar, Doha, Qatar and the Manchester Royal Eye Hospital, Centre for Endocrinology and Diabetes, UK.

Humane corneale Endothelzellen (HCEC) bilden einen Monolayer aus differenzierten Zellen an der posterioren Oberfläche der Cornea und sind essenziell für den Erhalt der cornealen Transparenz. HCEC zeigen nahezu keine proliferative Aktivität in vivo und nur eine begrenzte Proliferationsfähigkeit in vitro. Bei übermäßigem Zellverlust aufgrund von Traumata, Erkrankungen oder des Alters kann die Transparenz der Cornea irreversibel beeinträchtigt werden und die Transplantation einer Spenderhornhaut erforderlich sein, um die Hornhauttransparenz und damit die Sehfähigkeit wiederherzustellen. Dabei ist die weltweite Begrenzung der medizinischen Versorgung mit hochwertigen Spenderhornhäuten das derzeit größte Problem für die Therapie von Cornea-assoziierten Erkrankungen. Zellersatzstrategien mit in vitro kultivierten, quantitativ und qualitativ ausreichenden Spenderzellen sollen die weitestgehend ausgereizten logistischen Ansätze zur Verringerung des Spendermangels ergänzen. Die Entwicklung einer abschaltbaren bzw. transienten Methode zur in vitro- und in situ-Vervielfältigung primärer HCEC ohne Verlust ihrer typischen morphologischen Merkmale würde die Herstellung sowie eine detaillierte und umfassende Charakterisierung von Transplantaten aus primären HCEC ermöglichen. In dieser Arbeit sollten daher zunächst verschiedene proliferationsfördernde Faktoren (PF) identifiziert werden, die nach stabilem retroviralen Gentransfer mit Integrations-kompetenten lentiviralen Vektoren (ICLV) in primären HCEC ein starkes proliferationsförderndes Signal provozieren, das eine Immortalisierung der Zellen zur Folge hat. Dabei sollte die Pseudotypisierung der ICLV-Partikel mit alternativen viralen Glykoproteinen zytopathische Effekte verringern und die Transduktionseffizienz steigern. Nachfolgend sollten die identifizierten PF auf ihre Fähigkeit, die Proliferation primärer HCEC transient zu stimulieren, ohne die Zellen dabei zu transformieren, getestet werden. Mit Hilfe verschiedener retroviraler Expressionssysteme sollte ein klinisch anwendbares System entwickelt werden, das eine kontrollierte, zeitlich begrenzte Stimulierung der Proliferation bei gleichzeitiger Unterdrückung eines tumorartigen Zellwachstums ermöglichte. Hierzu dienten 1) Integrase-defiziente lentivirale Vektoren (IDLV), die eine transiente Transgenexpression durch direkte Transkription des episomalen DNA-Vektorgenoms erlauben, und 2) das transiente Foamyvirus-Vektorsystem (TraFo-VS), dass auf der Enkapsidierung und dem Transfer nicht-viraler mRNA in permissiven Zielzellen basiert. Es konnte gezeigt werden, dass ICLV-Pseudotypen, die entweder eine SFVmcy-Glykoproteinvariante (ICLVSFV) oder das VSV-G-Protein enthielten (ICLVVSV), eine signifikante Transduktionseffizienz aufwiesen und dabei keine zytopathischen Effekte in den Zielzellen auslösten, weshalb beide Glykoproteine für weiterführende Experiment genutzt wurden. Unter Verwendung des optimierten ICLV-Systems konnten drei PF identifiziert werden, die eine reproduzierbare Immortalisierung primärer HCEC infolge stabiler Expression durch Transduktion mit den ICLV-Pseudotypen ermöglichten. Dazu zählten der Cyclin D1/CDK4-Proteinkomplex (4D), die SV40 T-Antigene (SV40T) sowie die transformierenden Proteine E6 und E7 (E6/E7) des HPV-16. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Proliferation transduzierter primärer HCEC nach stabiler Transduktion mit PF-codierenden ICLV-Partikeln in einer dosisabhängigen Weise signifikant erhöht werden konnte. Untersuchungen mit IDLV-Varianten haben jedoch gezeigt, dass transduzierte HCEC ein vergleichbares proliferatives Verhalten wie ihre stabil transduzierten Äquivalente aufwiesen. Dies demonstrierte die restliche, geringgradige, nicht-kanonische Integrationskapazität von IDLV-Partikeln besonders im Zusammenhang mit der Expression von potenten PF. Nach erfolgter Transduktion mit TraFo-VP konnten die transferierten PF-codierenden mRNA in den Primärzellen nachgewiesen werden. Die Anwendung dieses Systems resultierte jedoch weder in einer nachweisbaren PF-Expression noch konnte eine proliferationsfördernde Wirkung in transduzierten Zellen festgestellt werden. Auch durch sequenzielle Transduktion der Zielzellen konnte keine Steigerung der Proliferationsrate induziert werden. Durch Verwendung von 50 fach konzentrierten SV40T-codierenden TraFo-VP konnte der mRNA-Transfer erhöht werden, wodurch dann auch die SV40T-Proteinexpression in den transduzierten Zellen nachweisbar wurde. Zudem konnte erstmalig gezeigt werden, dass sich im zeitlichen Verlauf sowohl die zellassoziierte SV40T-mRNA als auch die SV40T-Proteinkonzentration verringerte, bis sie nicht mehr nachweisbar war. Dabei konnte jedoch auch mit den konzentrierten TraFo VP keine nachweisbare transiente Immortalisierung primärer HCEC erreicht werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass eine permanente genetische Manipulation mit den viralen PF und dem 4D-Komplex eine Verlängerung der replikativen Lebensdauer ermöglichte und damit einhergehend die Immortalisierung primärer HCEC. Obgleich eine transiente Immortalisierung primärer HCEC mit den getesteten Systemen in dieser Arbeit nicht möglich war, ist eine klinische Anwendung des TraFo-VS, nicht aber des IDLV-Systems, in der angewandten Form, vielversprechend, um die Verfügbarkeit von qualitativ geeignetem Spendergewebe für die Transplantation bzw. Zellen für das Bioengineering des Hornhautendothels zu erhöhen. Daneben könnte das TraFo-VS ebenfalls genutzt werden, um andere zelluläre Funktionen in HCEC oder auch anderen Zielzellen transient zu modifizieren, z. B. Ionenfluss, replikative Seneszenz, Phagozytose oder Apoptose. / Human corneal endothelial cells (HCEC) form a monolayer of differentiated cells on the posterior surface of the cornea and are essential for maintaining corneal transparency. HCECs show almost no proliferative activity in vivo and only limited proliferative capacity in vitro. With excessive cell loss due to trauma, disease, or age-related degeneration, corneal transparency may be irreversibly compromised, and donor cornea transplantation may be required to restore vision. In this context, the global limitations in the medical supply of high-quality donor corneas are currently the most significant obstacle to the treatment of cornea-associated diseases. Cell replacement strategies using in vitro cultured donor cells of sufficient quantity and quality could complement the largely exhausted logistic approaches to alleviate donor shortage. The development of a method for strictly transient in vitro and in situ replication of primary HCECs without loss of their natural morphological characteristics would allow the production of well-characterized grafts derived from primary HCECs. To this end, I first aimed to identify different proliferation factors (PF) that provoke a robust proliferation-promoting signal in primary HCECs through stable retroviral gene transfer of candidate PF genes with integration-competent lentiviral vectors (ICLVs). Additionally, the pseudotyping of ICLV particles with alternative viral glycoproteins should reduce cytopathic effects and increase transduction efficiency. Subsequently, it should be clarified to what extent the identified PFs are capable of stimulating the proliferation of primary HCEC for a limited duration in a non-transformed context. Using different retroviral expression systems, I attempted to develop a clinically applicable system that allowed controlled, time-limited stimulation of proliferation while circumventing tumor-like cell growth. For this purpose, 1) integrase-deficient lentiviral vectors (IDLV), which allow transient transgene expression by direct transcription of the episomal DNA vector genome, and 2) the transient foamy virus vector system (TraFo-VS), which is based on encapsidation and transfer of non-viral mRNA in permissive target cells, were used. It was shown that ICLV pseudotypes containing either an SFVmcy glycoprotein variant (ICLVSFV) or the VSV-G protein (ICLVVSV) exhibited significant transduction efficiency without eliciting cytotoxic effects in target cells, highlighting both as viable candidates. Employing the optimized ICLV system, three PFs were identified that enabled reproducible immortalization of primary HCECs through stable expression after transduction with the ICLV pseudotypes. These included the cyclin D1/CDK4 protein complex (4D), the SV40 T antigens (SV40T), and the transforming proteins E6 and E7 (E6/E7) of HPV16. It was also shown that proliferation of transduced primary HCEC could be significantly increased in a dose-dependent manner following stable transduction with PF encoding ICLV particles. However, studies conducted using IDLV variants showed that PF-transduced HCEC exhibited a comparable proliferative behavior to their stably transduced equivalents. This demonstrated the residual, non-canonical integration capacity of IDLV particles especially in the context of potent PF expression. After successful transduction with TraFo-VP, the transferred PF-encoding mRNA could be detected in primary cells. However, application of this system did not result in detectable PF protein expression, nor could a proliferation-promoting phenotype be detected in transduced cells. Sequential transduction of target cells also failed to induce an increased proliferation rate. By using 50-fold concentrated SV40T-encoding TraFo-VPs, mRNA transfer could be increased, enabling detectable SV40T protein expression in transduced cells. In addition, it was shown for the first time that both cell-associated SV40T mRNA and SV40T protein levels decreased over time until they were no longer detectable. No observable transient immortalization of primary HCEC could be achieved even with the concentrated SV40T-encoding TraFo-VP. In conclusion, permanent genetic manipulation with the viral PFs and 4D protein complex allowed the prolonging of the cellular replicative lifespan in vitro and concomitant immortalization of primary HCEC. Although transient immortalization of primary HCECs was not possible with the systems tested in this investigation, clinical application of the TraFo-VS, but not the IDLV system as applied, remains a promising approach to increase the availability of suitable donor tissue for transplantation or cells for corneal endothelial bioengineering. Additionally, the TraFo-VS could also be used to transiently modify other cellular functions in HCEC or other target cells, e.g., ion flux, replicative senescence, phagocytosis, or apoptosis, for further cell biological research approaches.