O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos. / Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

Gastrenterites virais em cães são doenças transmissíveis infecciosas com importância para a saúde animal, como as causadas por Parvovírus canino e Coronavírus canino (CCoV) e saúde pública, como no caso dos rotavírus. Rotavírus em cães são encontrados com baixa freqüência, tanto em cães com diarréia quanto sadios, mas sua importância como reservatório para a rotavirose humana já é conhecido. O CCoV, pertencente ao grupo 1 do gênero Coronavirus, ocorre sob a forma dos genótipos I e II, amplamente distribuídos mundialmente e implicados em diarréia moderada, mas podendo levar a elevada letalidade no caso de patótipos altamente patogênicos. No Brasil, a ocorrência de rotavírus do sorogrupo A em cães é um fato conhecido, mas, no caso do CCoV, existe, até o momento, apenas uma investigação relatando sua ocorrência, sem dados de diversidade molecular. A presente investigação teve por objetivos avaliar o papel de cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, como reservatórios de rotavírus, estudar a freqüência de ocorrência de Coronavírus canino (CCoV) em amostras fecais destes animais e estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV encontradas. Para tato foram colhidas 100 amostras fecais de cães não vacinados, entre 1 e 180 dias de idade entre 2007 e 2008, sendo 50 com diarréia e 50 sem diarréia no momento da colheita, nos Municípios de São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra e uma aldeia indígena em Parelheiros. Às amostras foi aplicada a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para a detecção de rotavírus e uma RT-PCR dirigida ao gene da proteína de membrana M do CCoV (nucleotídeos 337 a 746) para a detecção deste vírus, sendo os fragmentos detectados submetidos a seqüenciamento de DNA. As seqüencias obtidas, traduzidas em aminoácidos, foram utilizadas para a construção de uma árvore genealógica enraizada de distância com o algoritmo Neighbor-Joning e modelo de Poisson com 100 repetições de bootstrap. Nenhuma das amostras resultou positiva para rotavirus, enquanto que 47 foram positivas para CCoV, com freqüência significativamente superior nos animais com diarréia. Vinte e dois dos 47 fragmentos de DNA obtidos resultaram em seqüências viáveis de DNA, sendo 12 classificadas como CCoV Tipo I e 10 como Tipo II, tendo sido encontrada uma sublinhagem exclusivamente brasileira para o Tipo II. Em relação à amostra vacinal de CCoV submetida ao seqüenciamento de DNA, a maior identidade ocorreu com o grupo Tipo II sublinhagem 01, com um valor de 100%, seguido de 97,2% para o Tipo II sublinhagem 02 (a linhagem brasileira) e 93,2% para o Tipo I. Sugere-se que a diversidade de CCoV encontrada seja derivada da elevada freqüência de ocorrência deste vírus, o que pode aumentar a probabilidade de divergências e de possíveis falhas vacinais por diferenças entre a amostra vacinal (Tipo II) e as amostras de campo (Tipos I e II), e, dessa forma, a vacina não diminuiria a transmissão e novas linhagens de CCoV emergiriam. Conclui-se que cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, não tiveram papel como reservatório para rotavírus, considerando-se a região geográfica e o período de colheita de amostras. O CCoV ocorreu com uma freqüência de 47% na população canina estudada, com freqüência estatisticamente significativamente superior naqueles com diarréia do que naqueles sem diarréia. Finalmente, amostras brasileiras de CCoV, com base em seqüenciamento parcial do gene codificador da proteína de membrana M, ocorrem tanto como tipo I quanto II, sendo que, para o tipo II, há uma lihangem tipicamente brasileira. / Viral canine gastroenteritis is infectious transmissible diseases with importance for animal health, as those caused by Canine parvovirus and Canine coronavirus (CCoV) and public health, as in the case of rotavirus. Canine rotavirus occurs at low frequencies, both in diarrheic and health dogs, but the importance of dog as reservoirs for human rotaviruses is known. CCoV belongs to group 1 of the genus Coronavirus and occurs as genotypes I and II, worldwide distributed and implicated in mild diarrhea, but high pathogenic types might lead to high lethality. In Brazil, the occurrence of serogroup A rotavirus in dogs is already known but, in the case of CCoV, theres a single report on the occurrence of this virus, with no data on its molecular diversity. The aims of the present investigation were to evaluate the roles of diarrheic and health young dogs as reservoirs of rotavirus, to study the occurrence of CCoV in these animals and to assess the molecular diversity of the strains found. One hundred fecal samples were collected from unvaccinated dogs between 2007 and 2008 (50 with diarrhea and 50 health dogs) in the Municipalities of São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra and in an indian community in Parelheiros. The samples were submitted to polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) for rotavirus detection and to an RT-PCR targeted to the membrane M protein gene (nucleotides 337 to 746) of CCoV for the detection of this virus; amplicons were then submitted to DNA sequencing and the putative amino acids sequences were used to build a rooted distance genealogic tree with the Neighbor-Joinng algorithm and he Poisson correction with 1,000 bootstrap replicates. No sample was positive to rotavirus, while 47 out of the 100 samples were positive for CCoV, with a statistically significative higher frequency for the dogs with diarrhea. Twenty-two out of the 47 ampicons resulted in viable sequences, being 12 classified as CCoV Type II and 10 as Type I; besides, and exclusively Brazilian sub lineage was found for Type II. Regarding the vaccine strain, the highest identity was found to Type II sub linage 02 (10%), followed by 97.2% for Type II sub linage II (the Brazilian sub linage) and 93.2% for Type I. Its suggested that the high diversity for CCoV detected is a consequence of the high frequency of occurrence of this virus, what might increase the probability of the emergence of divergence and possible vaccine failures due to differences amongst the vaccine strain (Type II) and field strains (Types I and II) and thus vaccination would not decrease the transmission and new lineages would emerge. It can be concluded that both health and diarrheic young dogs have played no role as reservoirs for rotavirus taking into account the geographic area and the time of samples collection. CCoV ocurred at a frequecy of 47%, with a higher frequency in the diarreic animals. Finally, Brazilian strains of CCoV, based on partial M gene sequences, occur as both type I and II, while, for Type II, a typical Brazilian lineage was described.

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos. / Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

O coronavírus bovino (BCoV) é classificado no Grupo 2 do gênero Coronavirus da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, causando disenteria (disenteria de inverno) em bovinos adultos, diarréia em bezerros neonatos e processos respiratórios em bovinos adultos e jovens. No presente estudo, 21 amostras fecais de vacas leiteiras colhidas durante um surto de disenteria em uma propriedade de Paranapanema no Estado de São Paulo positivas para BCoV foram submetidas a reações de PCR para amplificação parcial dos genes codificadores das proteínas S (448pb) e HE (441pb) do BCoV. Destas amostras, 14 foram positivas para cada PCR (não simultaneamente), sendo os fragmentos amplificados submetidos a seqüenciamento de DNA para reconstrução genealógica por máxima parcimônia através de algoritmo heurístico em conjunto com seqüências homólogas recuperadas do GenBank. Considerando-se o gene S, a identidade de nucleotídeos entre as 14 amostras aqui estudadas foi de 100%, tendo as mesmas segregado em um grupo exclusivo; além disso, demais amostras brasileiras incluídas no estudo segregam em outros dois grupos. Em relação ao gene HE, as 14 amostras estudadas apresentaram identidade de nucleotídeos de 100%, mas a árvore genealógica apresentou topologia pouco resolvida, tendo estas amostras, segregado em grupo politômico com as seqüências homólogas incluídas. Comparações entre os diversos grupos nas árvores do gene S em termos de aminoácidos revelaram marcadores grupo-específicos, com substituições exclusivas para as amostras de BCoV aqui estudadas. Com base nestes resultados, conclui-se que, durante o transcorrer do surto de disenteria de inverno, uma única linhagem de BCoV estava presente, baseado no seqüenciamento parcial dos genes S e HE e que há pelo menos três genótipos de BCoV presentes no Brasil em relação ao gene S e ao menos um em relação ao gene HE, considerando-se as regiões gênicas e as seqüências incluídas no presente estudo. / Bovine coronavirus (BCoV) is classified in group 2 of the genus Coronavirus, family Coronaviridae, order Nidovirales, and causes winter dysentery in adult bovine, neonatal calf diarrhea, and respiratory disorders in both adult and young bovine. In this investigation, 21 fecal samples from dairy cows collected during an outbreak of dysentery in a farm located at Paranapanema, São Paulo State, all positive to BCoV, were submitted to PCRs to partial amplification of genes S (448bp) and HE (441bp ) of BCoV. Fourteen out of these samples were positive for each PCR (not simultaneously) and the amplicons were submitted to DNA sequencing for genealogic reconstruction with maximum parsimony and heuristic algorithm with homologous sequences retrieved from the GenBank. Regarding S gene, the nucleotide identity among the 14 strains was 100% and these segregated in an exclusive cluster; furthermore, the other Brazilian strains included in the analysis segregated in other two clusters. Taking into account the HE gene, the 14 strains analyzed presented a nucleotide identity of 100%, but the genealogic tree showed a low-resolved topology, having these samples segregated in a polytomic cluster with the homologous sequences included. Amino acid comparisons among the different clusters in the trees of gene S revealed cluster-specific markers, with exclusive substitutions for the BCoV strains studied herein. Based on these results, one can conclude that, during the winter dysentery outbreak, a single BCoV lineage was involved based on partial S and HE genes sequences and that there are at least three genotypes of BCoV in Brazil regarding S gene and at least one regarding HE gene, taking into account the gene regions and the sequences included in this investigation.

Coronavirus bovino (BCoV), um membro da família i>Coronaviridae, causa severa diarréia em bezerros neonatos e tem sido associado a diarréias de inverno em vacas leiteiras em vários paises, incluindo o Brasil. A morbidade da disenteria de inverno e alta chegando ate 100% , sendo um fator importante para economia já que causa queda da produção leiteira, levando a grandes perdas as criações de vacas leiteiras. O objetivo deste trabalho foi pesquisar a ocorrência de BCoV em vacas, diagnosticando amostras positivas por RT-PCR gene Rp Rd e isolando estas amostras positivas em células da linhagem HRT-18G. As amostras de fecais foram obtidas de 43 vacas leiteiras com disenteria de 8 propriedades dos Estados de São Paulo e Minas Gerais, Brasil. Das dez (10/43=23%) amostras positivas para esta técnica, 7 foram inoculadas em células da linhagem HRT-18G, sendo que o isolamento foi comprovado pela mesma técnica após seis passagens seriadas em 4 inoculações. Com isso, mostra-se que o BCoV também esta envolvido em disenterias de inverno em vacas leiteiras no Brasil. E através de isolamentos deste vírus, podemos contribuir para estudos continuados ajudar no esclarecimento de sua epidemiologia e possibilitar com um banco de vírus a prevenção de ordem também especifica da enfermidade. / Bovine coronavirus (BCoV), a member of Coronaviridae family, causes severe diarrhea in newborn calves and has been associated with outbreaks of winter dysentery (WD) in adult cattle in several countries, including Brazil. The morbidity rate of WD is very high (50-100%) and the disease causes severe economic losses once it decreases milk production. The aim of the present study was to survey for the occurrence of BCoV in cows using a RT-PCR targeted to the replicase gene and to isolate positive samples in HRT-18G cells. The fecal samples were obtained from 43 adult dairy cows with dysentery from São Paulo and Minas Gerais States, Brazil. Ten (23%) of the 43 fecal samples were positive for BCoV and 7 of these were inoculated in HRT-18G cells, when the isolation of 4 samples was proved by RT-PCR after sex passages. These findings indicate that BCoV is also involved in outbreaks of dysentery in adult cattle in Brazil. This shows the importance of more comprehensive studies on coronavirus in dairy cattle in the surveyed area and, with the isolation of the virus strains studied herein, one may contribute to other studies to enlighten the epidemiology and prevention of the disease.

Infections in the central nervous system pose a considerable challenge to the host. On one hand, a quick and rapid immune response is important to control the infection, while on the other hand, too robust a response can damage the CNS, which has poor regenerative properties. Therefore, nowhere else in the body is such a balance between pro- and anti-inflammatory mediators as important. Mice infected with the coronavirus, mouse hepatitis virus strain J2.2-V-1, are a useful model for understanding the two sides of the immune system. In this neurotropic viral infection, demyelination occurs secondary to the immune response's control of the viral infection. Thus, J2.2-V-1 infection also functions as an infectious animal model for multiple sclerosis (MS). Many arms of the pro-inflammatory immune system have been studied during J2.2-V-1 infection but the anti-inflammatory immune response has not been thoroughly investigated prior to this study. The data demonstrated here represent an in-depth look into the role of regulatory T cells and IL-10 during J2.2-V-1 infection. Specifically, by adoptive transfer of Tregs, I show that there is a relative paucity of Tregs during J2.2-V-1 infection in C57BL/6 mice and their addition decreases clinical scores, demyelination and the T cell response during infection without affecting viral clearance. A RAG1-/- adoptive transfer model demonstrates clinical results consistent with results obtained in B6 mice, while further demonstrating that Tregs function in the draining cervical lymph node by dampening dendritic cell activation and pro-inflammatory chemokine and cytokine release. There is also a relative decrease in T cell proliferation. Thus, Tregs are protective in J2.2-V-1-induced encephalomyelitis and their enhancement is a potential therapy for MS. Additionally, IL-10 is an important anti-inflammatory component of the immune response, as its absence causes increased immunopathology with increased demyelination in J2.2-V-1-infected B6 mice. Through the development of a recombinant J2.2-V-1 virus that produces IL-10, I also demonstrate that increasing the level of IL-10 at the site of infection is protective early in the immune response. Antigen-specific IFN-γ+ CD4 and CD8 T cells produce IL-10 at the height of the inflammation. CD8 T cells require a high level of antigen stimulation and the most recently activated CD69+CD8 T cells express high levels of IL-10. Additionally, this IL-10 expression is transient in both CD4 and CD8 T cells, presumably only by the recently stimulated cells. Through microarray analysis, protein expression and cytolytic assay, I show that IL-10+CD8 T cells are more activated than IL-10-CD8 T cells. Nonetheless, the IL-10 produced is anti-inflammatory and its production in CD8 T cells is protective in J2.2-V-1-infected mice. Thus, the most activated and cytotoxic CD8 T cells self-regulate the immune response through the production of IL-10. Overall, these studies show that the anti-inflammatory component of the immune system is vital to protecting the host from the immunopathology that occurs during J2.2-V-1 virus clearance. Specifically, the addition of Tregs and IL-10 helps ameliorate clinical disease and demyelination. These studies suggest that increasing Tregs and/or increasing the cytokine IL-10 in patients with MS may have therapeutic potential.

The 5’ untranslated region (UTR) of coronaviral genomes contains cis-acting sequences necessary for replication, transcription and translation. A consensus secondary structural model of the 5' 140 nucleotides of the 5' UTRs of nine coronaviruses (CoVs) derived from all three major CoV groups is presented and characterized by three major stem loops, SL1, SL2 and SL4. SL2 is conserved in all CoVs, typically containing a pentaloop (C47-U48-U49-G50-U51 in MHV) stacked on a 5-bp stem, with some sequences containing an additional U 3' to U51. NMR structural studies of SL2 hairpin reveal that SL2 adopts a U-turn-like conformation. Parallel molecular genetic experiments reveal that SL2 plays an essential role in sgRNA synthesis as does SL1. We observe strong genetic selection against viruses that contain a deletion of A35, an extrahelical nucleotide that destabilizes SL1, in favor of genomes that contain a diverse panel of destabilizing second-site mutations, due to introduction of a collection of non-canonical base pairs near the deleted A35. Viruses containing destabilizing SL1-∆A35 mutations also contain one of two specific single nucleotide mutations in the 3' UTR. Thermal denaturation and imino proton solvent exchange experiments reveal that the lower half of SL1 is unstable and that second-site SL1-∆A35 substitutions recover one or more features of the wild-type SL1. We propose a "dynamic SL1" model that supports viral replication; these characteristics of SL1 appear to be conserved in other coronaviral genomes. The coronaviral nucleocapsid (N) protein contains two or more RNA binding domains. We investigated the RNA-binding properties of the N-terminal (NTD) and Cterminal (CTD) domain of MHV N. Our results reveal that the NTD specifically interacts with the TRS-L3 sequence. The role of conserved residues (Y127, Y129 and R110) for this specific interaction were systematically investigated. In contrast to the NTD, the MHV CTD is homodimeric in solution and binds single-strand RNA nonspecifically in a binding mode of the noncooperative large ligand lattice model. The CTD dimer binds with a site size, n=4 nucleotide and the appending of the NTD enhances the single-strand nucleic acid binding affinity.

Fever in infants younger than 2 months of age causes a significant number of emergency department visits and is particularly worrisome because of the potential for serious infection. Management of febrile infants is problematic because clinical observation is not a reliable indicator of serious bacterial illness (SBI), such as bacteremia, meningitis, and urinary tract infection (UTI). Numerous investigators have proposed methods of screening laboratory tests to ascertain the risk of SBI in febrile infants. These screening tests could potentially avoid the invasive and costly sepsis work-up, which usually includes complete blood count (CBC), blood culture, urinalysis, urine culture, and lumbar puncture. We conducted a prospective, cross-sectional study that examined the prevalence of rhinovirus (RV) and coronavirus (CoV), which are two of the most common causes of upper respiratory infections in the first year of life, and human metapneumovirus (hMPV), which is a common cause of bronchiolitis, in infants younger than 2 months of age. This study also examined whether febrile infants with RV were more or less likely to also have a SBI than infants without a viral respiratory infection. Methodology: Fever was defined as rectal temperatures greater than 37.9C or a historical fever greater than 100.3F. Nasal swabs were tested with reverse transcriptase polymerase chain reaction (rt-PCR) techniques for rhinoviruses (RV), human metapneumovirus (hMPV) and coronaviruses (CoV). Nasal samples were also tested for RSV, influenza A and B, parainfluenza types 1, 2 and 3, and adenovirus via direct fluorescent antibody (DFA). Conclusion: Rhinovirus (RV) was the most commonly detected respiratory viral pathogen in our cohort (14% out of 98 total enrolled patients). Coronovirus (CoV) and human metapneumovirus (hMPV) were both detected but in only one patient (1%) each. RV occurred predominantly in the summer (79%). This cohort of patients showed no difference between the incidence of serious bacterial illness (SBI) with and without RV infection (p=0.84).

Thesis (M. Med. Sc.)--University of Hong Kong, 2005.

OLIVEIRA, Francisco Mário Sidney. Detecção de coronavírus humanos em pacientes pediátricos com pneumonia atendidos em um hospital de referência em Fortaleza-Ce nos anos de 2011 e 2012. 2014. 91 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-09T11:34:12Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_fmsoliveira.pdf: 1279732 bytes, checksum: b238cb41e87ecdf824ea7f52b0e35bcd (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-09T12:06:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_fmsoliveira.pdf: 1279732 bytes, checksum: b238cb41e87ecdf824ea7f52b0e35bcd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-09T12:06:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_fmsoliveira.pdf: 1279732 bytes, checksum: b238cb41e87ecdf824ea7f52b0e35bcd (MD5) Previous issue date: 2014 / Four genotypes of human coronavirus (CoVh-229E, OC43, NL63 and HKU1) are often associated with diseases of the upper respiratory tract as well as in the lower.Despite the diversity of human coronavirus associated with acute respiratory infections, little is known about the impact of infections associated with them in child populations living in tropical regions.The present study had as objective detect CoVh in nasopharyngeal samples from pediatric patients with pneumonia treated at emergency rooms and wards of a referral hospital in the city of Fortaleza - Ceará, during the years 2011 and 2012.To that end, we collected 522 nasopharyngeal aspirates, where the principle indirect immunofluorescence (IIF) was used for detection of influenza A and B viruses, respiratory syncytial virus, adenovirus and parainfluenza 1, 2 and 3, and 99 (19%) samples positive by this technique. Negative samples by IFA were subjected to polymerase chain reaction in real-time (RT-qPCR) for detection of CoVh. Of the 423 negative samples by IFA, 71 (16.80%) had a positive result for CoVh, where the type 229E was the most frequent (34.11%), followed by genotypes OC43 and NL63 with 28.23% each and with lower detection HKU1 genotype (9.4%).We observed 14 (19.71%) co-detections with at most two genotypes among CoVh.All types of CoVh were observed during the study period.A rate of 67.60% of the infected children was treated by CoVh in emergency, but it is worth mentioning the high detection rate in hospitalized patients (32.40%).HKU1 genotype identified in a child with one month old who died, where the only risk factor was age observed.Our results show the circulation four types of CoVh in our city,being detected in pediatric patients with pneumonia, demonstrating the potential importance of these viruses in severe respiratory syndromes. / Quatro genótipos de coronavírus humanos (CoVh-229E, OC43, NL63 e HKU1) são frequentemente associados a doenças no trato respiratório superior como também no inferior. Apesar da diversidade de coronavírus associados a infecções respiratórias agudas humanas pouco se conhece sobre o impacto das infecções a eles associadas em populações infantis que vivem em regiões tropicais. O presente estudo teve como objetivo detectar os CoVh em amostras de nasofaringe provenientes de pacientes pediátricos com pneumonia atendidos na emergência e nas enfermarias de um hospital de referênciana cidade de Fortaleza – Ceará, durante os anos de 2011 e 2012. Para tanto, foram coletadas 522 aspirados de nasofaringe, onde a princípio foi utilizada a técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para detecção dos vírus influenza A e B, sincicial respiratório (VSRh), adenovírus (ADVh), e parainfluenza 1, 2 e 3 (VPIh 1, 2 e 3), sendo 99 (19%) amostras positivas por esta técnica. As amostras negativas por IFI foram submetidas à reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecção dos CoVh. Das 423 amostras negativas por IFI, 71 (16,80%) tiveram o resultado positivo para os CoVh, onde o tipo 229E foi o mais frequente (34,11%), seguidos pelos tipos OC43 e NL63 com 28,23% cada e como menor detecção o HKU1 (9,4%). Todos os tipos de CoVh puderam ser observados durante o período de estudo. Uma taxa de 67,60% das crianças infectadas pelos CoVh foram atendidas na emergência, mas vale ressaltar a alta taxa de detecção em pacientes hospitalizados (32,40%). Quanto aos sinais e sintomas clínicos, observamos uma maior frequência de coriza, tosse, febre e dispnéia nos pacientes positivos para os CoVh. Identificamos o tipo HKU1 em uma criança com um mês de idade que foi a óbito, onde o único fator de risco observado foi a idade. Nossos resultados demonstram a circulação de quatro tipos de CoVh no Nordeste do Brasil, sendo detectados em pacientes pediátricos com pneumonia, mostrando a possível importância desses vírus em síndromes respiratórias mais graves. Este estudo representa a primeira análise sobre a epidemiologia dos CoVh em nosso estado.