Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-07-16T10:54:06Z No. of bitstreams: 1 wernervieiravieira.pdf: 1818667 bytes, checksum: 0f98b1d90ebb147a1e61c2d9e940ea8b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-09-03T16:16:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 wernervieiravieira.pdf: 1818667 bytes, checksum: 0f98b1d90ebb147a1e61c2d9e940ea8b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-03T16:16:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 wernervieiravieira.pdf: 1818667 bytes, checksum: 0f98b1d90ebb147a1e61c2d9e940ea8b (MD5) Previous issue date: 2018-04-13 / De acordo com a OMS, em 2014, 39% da população adulta mundial estava acima do peso e 13% foram diagnosticados com obesidade. A tuberculose (TB) é a segunda principal causa de morte por doenças infecciosas em todo o mundo. Estudos têm demonstrado que a obesidade ou o excesso de peso estão relacionados à diminuição do risco de desenvolver TB ativa. Além disso, demonstrou-se que as pessoas com alto índice de massa corporal têm níveis sistêmicos elevados da maioria das citocinas pró-inflamatórias e diminuição dos níveis de citocinas anti-inflamatórias. Além disso, tanto os humanos obesos quanto os camundongos têm uma composição microbiana que é significativamente diferente dos grupos eutróficos, considerados magros, e podem ser corresponsáveis pelo surgimento da obesidade. Reconhece-se agora que a microbiota intestinal mantém uma interação complexa e recíproca com o sistema imune do hospedeiro. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar se a obesidade promove alterações fisiológicas em camundongos infectados com BCG, com foco nas mudanças da microbiota intestinal. Para isso foram utilizados camundongos C57/BL6 alimentados com dieta hiperlipídica ou padrão. Os camundongos foram infectados ou não com M. bovis BCG. Após 24, 48 ou 72h de infecção os camundongos foram eutanasiados em câmara de gás carbônico (CO2). As amostras fecais foram coletadas diariamente após a infecção para identificação da composição da estrutura microbiana intestinal. Um lavado pleural foi realizado e os leucócitos pleurais foram montados em laminas para análise de corpúsculos lipídicos (CL) e o sobrenadante desse lavado foi utilizado para análise das citocinas. Além disso, a porção final do intestino foi coletada para análise histológica. As gorduras retroperitoneal e perigonadal foram retiradas para pesagem. Após 16 semanas, os camundongos alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram-se obesos. Nós avaliamos que a infecção induziu a biogênese de corpúsculos lipídicos em ambos os camundongos eutróficos ou obesos. Além disso, camundongos obesos 72hs pós-infecção mostraram um aumento significativo no número de corpúsculos lipídicos, quando comparado aos camundongos eutróficos. Além disso, observamos que a infecção induziu um aumento na síntese de KC e TNF-α, e a obesidade não conseguiu alterar esses níveis. Em relação a IL-10, notamos uma redução nos níveis de síntese nos camundongos obesos com 72hs de infecção quando comparados aos camundongos eutróficos. Além disso, demonstramos que os camundongos obesos apresentaram um perfil estrutural da microbiota intestinal diferente quando comparado aos eutróficos. Nos camundongos eutróficos, a infecção por M. bovis BCG modificou rapidamente a estrutura da comunidade microbiana, apresentando variações em 24, 48 e 72h. Observamos que a obesidade atrasou a mudança de estrutura da microbiota intestinal. Além disso, mudanças menores foram observadas com 24 e 48 horas após a infecção, no entanto, mudanças visíveis ocorreram após 72h de infecção. Além disso, um aumento da área de infiltrados inflamatórios intestinais em resposta a infecção foi observada no grupo obeso. Assim, sugerimos que a obesidade influencia o curso da infecção, modulando a biogênese de corpúsculos lipídicos, síntese de citocinas, infiltrados inflamatórios intestinais e composição estrutural de microbiota intestinal. Além disso, o possível efeito protetor da obesidade no desenvolvimento da tuberculose pode ocorrer de outras formas, pela resistência frente à mudança estrutural da microbiota intestinal e pela consequente estimulação do sistema imunológico. / Tuberculosis (TB) is the second leading cause of death from infectious diseases worldwide. According to WHO, by 2014, 39% of world's adult population were overweight and 13% were diagnosed with obesity. Studies have shown that obesity or overweight are related to a decreased risk of developing active TB. In addition, people with a high body mass index have been shown to have elevated systemic proinflammatory cytokine levels and decreased levels of anti-inflammatory cytokines. In addition, both obese humans and mice have a microbial composition that is significantly different from eutrophic groups, considered lean, and may be co-responsible for the emergence of obesity. It is now recognized that the intestinal microbiota maintains a complex and reciprocal interaction with the host immune system. Thus, the objective of this study is to evaluate whether obesity promotes physiological changes in mice infected with BCG, focusing on changes in the intestinal microbiota. C57/BL6 mice fed a standard or hyperlipidic diets were used. Mice were infected or not with M. bovis BCG. After 24, 48 or 72h of infection the mice were euthanized in a carbon dioxide chamber (CO2). Fecal samples were collected daily after infection to identify the composition of the intestinal microbial structure. Pleural lavage was performed and pleural leukocytes were mounted on laminae for analysis of lipid bodies (LB) and the supernatant of this lavage was used for cytokine analysis. In addition, the final portion of the intestine was collected for histological analysis. Retroperitoneal and perigonadal fats were removed for weighing. After 16 weeks, the mice fed a hyperlipid diet were obese. We evaluated that the infection induced the biogenesis of lipidic corpuscles in both eutrophic and obese mice. Moreover, obese mice 72h after infection showed a significant increase in lipid bodies as compared to eutrophic mice. In addition, we observed that the infection induced an increase in the synthesis of KC and TNF-α, and obesity failed to change these levels. Regarding IL-10, we observed a reduction in the synthesis levels in obese mice with 72h of infection when compared to eutrophic mice. Moreover, we demonstrated that the obese mice presented a structural profile of the intestinal microbiota different when compared to the eutrophic In the eutrophic mice, M. bovis BCG infection rapidly modified the structure of the microbial community, showing variations in 24, 48 and 72 hours. We observed that obesity delayed the change in the structure of the intestinal microbiota. In addition, minor changes were observed at 24 and 48 hours post infection, however, visible changes occurred after 72h of infection. In addition, an increase in the area of inflammatory bowel infiltrates in response to infection was observed in the obese group. Thus, we suggest that obesity influences the course of infection by modulating biogenesis of lipid bodies, cytokine synthesis, intestinal inflammatory infiltrates and structural composition of intestinal microbiota. Moreover, the possible protective effect of obesity on the development of tuberculosis may occur in other ways, by resistance to the structural change of the intestinal microbiota and by the consequent stimulation of the immune system.

As fosfolipases A2 secretadas (sFLA2) de veneno de serpente apresentam homologia estrutural e funcional com as sFLA2s do GIIA de mamíferos, cujos níveis estão elevados em doenças inflamatórias, como a aterosclerose. Nesta doença, as células de músculo liso vascular (CMLVs) acumulam corpúsculos lipídicos (CLs) e se diferenciam em células espumosas. Porém, o papel das sFLA2s neste fenômeno não é conhecido. Neste estudo foram avaliados os efeitos das FLA2 MT-III, cataliticamente ativa, e da BthTx-II, sem atividade catalítica, em CMLVs, com ênfase na formação de CLs e a participação de fatores da homeostasia lipídica. Os resultados obtidos demonstraram que a MT-III e a BthTx-II induziram a formação de CMLVs espumosas. Para tanto, estas enzimas recrutaram diferentes fatores envolvidos na síntese e acúmulo de lipídios. Nesta condição, os CLs constituem um local de síntese de prostaglandinas. Ainda, a MT-III induziu a diferenciação de CMLVs para fenótipo e função de macrófagos. A atividade catalítica não é relevante para a formação de CLs induzida por FLA2s. / Bothrops snake venom secreted phospholipases A2 (sPLA2s) share structural and functional features with mammalian GIIA sPLA2s, which are highly expressed during inflammatory diseases, such as atherosclerosis. In this disease, vascular smooth muscle cells (VSMCs) are loaded with lipid droplets (LDs) differentiating into foam cells. However, the role of these enzymes in this process is still unknown. In this study the effects of snake venom PLA2s MT-III with catalytic activity and BthTx-II, devoid of catalytic activity in VSMCs, with focus on LDs formation and mechanisms involved were investigated. Results here obtained show that both MT-III and BthTx-II induce formation of foam VSMCs and recruit distinct factors of synthesis and storage of lipids in these cells. In this condition, LDs constitute sites for synthesis of prostaglandins. Moreover, MT-III showed the ability to modulate VSMCs functions, leading them to a phenotipic switch to macrophage-like cells. In addition, the catalytic activity is not relevant to sPLA2-induced LDs formation.

O escorpião Tityus serrulatus é considerado uma das espécies mais perigosas para os seres humanos no Brasil, e sua peçonha induz resposta inflamatória local e sistêmica. Neste projeto, tivemos como objetivo estudar a produção de mediadores inflamatórios, as vias de ativação celular e os receptores da imunidade inata responsáveis pelo reconhecimento da peçonha do escorpião T. serrulatus (TsV), bem como de suas toxinas. Nós demonstramos que TsV, e suas toxinas Ts1 e Ts6 induzem a produção de NO, IL-6 e TNF-? por células J774.1, as quais podem ser potencializadas pela presença de LPS. No entanto, Ts2 apresenta atividade anti-inflamatória por induzir produção de IL-10 e inibe a liberação de NO, IL-6 e TNF-?, induzida pelo LPS. Mostramos ainda que Ts2 ou Ts6 isoladas do TsV, além das citocinas, induzem a produção dos mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2), e estes contribuem para o recrutamento de leucócitos para a cavidade peritoneal. Em conjunto, os nossos dados demonstraram que Ts2 e Ts6 induzem inflamação por mecanismos dependentes da produção de citocinas e mediadores lipídicos, e que Ts2 pode desempenhar papel regulador da resposta. No entanto, os mecanismos responsáveis pelo reconhecimento da peçonha e indução da liberação de mediadores inflamatórios por células de mamíferos, são desconhecidos. Assim, dando continuidade aos nossos estudos, demonstramos que os receptores TLR2, TLR4 e CD14 reconhecem TsV, e medeiam a produção de citocinas e mediadores lipídicos. Além disso, nós demonstramos que TsV ativa NF-?B dependente de MyD88, e o fator c-Jun, independente de MyD88. Semelhante ao TsV, a sua toxina majoritária, Ts1, induz a fosforilação de NF-?B dependente de MyD88, via reconhecimento por TLR2 e TLR4, enquanto a ativação c-Jun é via TLR4, mas independente de MyD88. Dentro deste contexto, nós propusemos o termo Padrões Moleculares Associados à Venenos (VAMP) para se referir às moléculas que são introduzidas no hospedeiro por picadas e são reconhecidas por receptores de reconhecimento padrão (PRRs), resultando em inflamação. Demonstramos ainda, a formação de corpúsculos lipídios (CLs) e a geração de eicosanóides, após o reconhecimento do TsV por TLR2 e TLR4. Nossos dados mostraram que a formação de eicosanóides se correlaciona com a formação dos CLs, que por sua vez são dependentes de TLR2 e TLR4, e da ativação de PPAR?, sugerindo que este receptor nuclear pode modular a produção de citocinas pró-inflamatórias. Assim, concluímos que PPAR? pode ser um candidato-alvo atrativo para novas estratégias terapêuticas para prevenção dos efeitos deletérios resultantes da intensa liberação sistêmica de mediadores inflamatórios após envenenamento. / Tityus serrulatus is the scorpion considered one of the most dangerous species to humans in Brazil, which venom induces local and systemic inflammatory response. In this project, we aimed to study In this project, we aimed to study the inflammatory mediators production, cell activation and receptors of innate immunity responsible for recognition of the venom of the scorpion T. serrulatus (TsV) as well as their toxins. We have demonstrated that TsV and their toxins Ts1 and Ts6 induce NO, IL-6 and TNF-? production in J774.1 cells, which may be potentiated by presence of LPS. However, Ts2 exhibits anti-inflammatory activity due induction of IL-10 production and inhibits the release of NO, IL- 6 and TNF-? induced by LPS. We also show that Ts2 or Ts6 isolated of TsV, besides of the cytokines, induce the production of lipid mediators (LTB4 and PGE2), and these mediators contribute to leukocytes recruitment into the peritoneal cavity. Taken together, our data demonstrated that Ts2 and Ts6 induce inflammation by mechanisms dependent on the production of cytokines and lipid mediators, and that Ts2 may play regulatory role on the cell response. Furthermore, continuing our studies, we demonstrated that TLR2, TLR4 and CD14 receptors recognize TsV, mediating cytokines and lipid mediators production. We also showed TsV MyD88- dependent activation of NF-?B, and a MyD88-independent activation of the factor c-Jun. Similar to TsV, the majority toxin Ts1 induces MyD88-dependent phosphorylation of NF-kB via TLR2 and TLR4 recognition, while the c-Jun activation is through TLR4 recognition, but independent of MyD88. Within this context, we propose the term Venom-Associated Molecular Pattern (VAMP), to refer molecules that are introduced into the host by st ings and recognized by PRRs, resulting in inflammation. Finally, we investigated the formation of lipid bodies (LBs) and generation of eicosanoids, through TsV recognition by TLR2 and TLR4. Our data showed that eicosanoid production correlates with the LBs formation, which are dependent on TLR2, TLR4 and PPAR? activation, suggesting that this nuclear receptor can modulate cytokines inflammatory. Thus, we suggest that PPAR? may be an attractive candidate target for novel therapeutic strategies to prevent the deleterious effects of intense systemic release of inflammatory mediators after envenomation.

O escorpião Tityus serrulatus é considerado uma das espécies mais perigosas para os seres humanos no Brasil, e sua peçonha induz resposta inflamatória local e sistêmica. Neste projeto, tivemos como objetivo estudar a produção de mediadores inflamatórios, as vias de ativação celular e os receptores da imunidade inata responsáveis pelo reconhecimento da peçonha do escorpião T. serrulatus (TsV), bem como de suas toxinas. Nós demonstramos que TsV, e suas toxinas Ts1 e Ts6 induzem a produção de NO, IL-6 e TNF-? por células J774.1, as quais podem ser potencializadas pela presença de LPS. No entanto, Ts2 apresenta atividade anti-inflamatória por induzir produção de IL-10 e inibe a liberação de NO, IL-6 e TNF-?, induzida pelo LPS. Mostramos ainda que Ts2 ou Ts6 isoladas do TsV, além das citocinas, induzem a produção dos mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2), e estes contribuem para o recrutamento de leucócitos para a cavidade peritoneal. Em conjunto, os nossos dados demonstraram que Ts2 e Ts6 induzem inflamação por mecanismos dependentes da produção de citocinas e mediadores lipídicos, e que Ts2 pode desempenhar papel regulador da resposta. No entanto, os mecanismos responsáveis pelo reconhecimento da peçonha e indução da liberação de mediadores inflamatórios por células de mamíferos, são desconhecidos. Assim, dando continuidade aos nossos estudos, demonstramos que os receptores TLR2, TLR4 e CD14 reconhecem TsV, e medeiam a produção de citocinas e mediadores lipídicos. Além disso, nós demonstramos que TsV ativa NF-?B dependente de MyD88, e o fator c-Jun, independente de MyD88. Semelhante ao TsV, a sua toxina majoritária, Ts1, induz a fosforilação de NF-?B dependente de MyD88, via reconhecimento por TLR2 e TLR4, enquanto a ativação c-Jun é via TLR4, mas independente de MyD88. Dentro deste contexto, nós propusemos o termo Padrões Moleculares Associados à Venenos (VAMP) para se referir às moléculas que são introduzidas no hospedeiro por picadas e são reconhecidas por receptores de reconhecimento padrão (PRRs), resultando em inflamação. Demonstramos ainda, a formação de corpúsculos lipídios (CLs) e a geração de eicosanóides, após o reconhecimento do TsV por TLR2 e TLR4. Nossos dados mostraram que a formação de eicosanóides se correlaciona com a formação dos CLs, que por sua vez são dependentes de TLR2 e TLR4, e da ativação de PPAR?, sugerindo que este receptor nuclear pode modular a produção de citocinas pró-inflamatórias. Assim, concluímos que PPAR? pode ser um candidato-alvo atrativo para novas estratégias terapêuticas para prevenção dos efeitos deletérios resultantes da intensa liberação sistêmica de mediadores inflamatórios após envenenamento. / Tityus serrulatus is the scorpion considered one of the most dangerous species to humans in Brazil, which venom induces local and systemic inflammatory response. In this project, we aimed to study In this project, we aimed to study the inflammatory mediators production, cell activation and receptors of innate immunity responsible for recognition of the venom of the scorpion T. serrulatus (TsV) as well as their toxins. We have demonstrated that TsV and their toxins Ts1 and Ts6 induce NO, IL-6 and TNF-? production in J774.1 cells, which may be potentiated by presence of LPS. However, Ts2 exhibits anti-inflammatory activity due induction of IL-10 production and inhibits the release of NO, IL- 6 and TNF-? induced by LPS. We also show that Ts2 or Ts6 isolated of TsV, besides of the cytokines, induce the production of lipid mediators (LTB4 and PGE2), and these mediators contribute to leukocytes recruitment into the peritoneal cavity. Taken together, our data demonstrated that Ts2 and Ts6 induce inflammation by mechanisms dependent on the production of cytokines and lipid mediators, and that Ts2 may play regulatory role on the cell response. Furthermore, continuing our studies, we demonstrated that TLR2, TLR4 and CD14 receptors recognize TsV, mediating cytokines and lipid mediators production. We also showed TsV MyD88- dependent activation of NF-?B, and a MyD88-independent activation of the factor c-Jun. Similar to TsV, the majority toxin Ts1 induces MyD88-dependent phosphorylation of NF-kB via TLR2 and TLR4 recognition, while the c-Jun activation is through TLR4 recognition, but independent of MyD88. Within this context, we propose the term Venom-Associated Molecular Pattern (VAMP), to refer molecules that are introduced into the host by st ings and recognized by PRRs, resulting in inflammation. Finally, we investigated the formation of lipid bodies (LBs) and generation of eicosanoids, through TsV recognition by TLR2 and TLR4. Our data showed that eicosanoid production correlates with the LBs formation, which are dependent on TLR2, TLR4 and PPAR? activation, suggesting that this nuclear receptor can modulate cytokines inflammatory. Thus, we suggest that PPAR? may be an attractive candidate target for novel therapeutic strategies to prevent the deleterious effects of intense systemic release of inflammatory mediators after envenomation.