Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-12T11:34:55Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14683 bytes, checksum: 031a660f530792989291494b96b6dc49 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T11:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 14683 bytes, checksum: 031a660f530792989291494b96b6dc49 (MD5) Previous issue date: 2001-08-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho teve por objetivo definir os parâmetros para a obtenção e regeneração de protoplastos de Crinipellis perniciosa. O melhor estabilizador osmótico para a liberação de protoplastos foi KCl 0.8M em tampão fosfato 10 mM, pH 5.8, contendo 20 mg.mL -1 da enzima lítica Glucanex e 10 mg.mL -1 de BSA, após 1 a 2 horas de digestão enzimática do micélio. Os protoplastos foram liberados nestas condições, na ordem de 2,0 x 10 7 por mL de estabilizador osmótico, a partir de 300mg de micélio secundário de C. perniciosa crescido em meio BDA. A melhor freqüência de regeneração obtida foi de 2,0% quando sacarose 0,5M foi utilizada como estabilizador osmótico. A coloração de núcleos dos protoplastos revelou que 58,8% dos protoplastos eram anucleados, 37,5% uninucleados e 3,7% binucleados. Uma análise genética por RAPD de C. perniciosa e das colônias regeneradas a partir de protoplastos não revelou polimorfismos entre elas, embora diferenças, como crescimento lento e aspecto morfológico do micélio de algumas colônias tenham sido observadas. O micélio do isolado de C. perniciosa, bem como das colônias regeneradas a partir de protoplastos, são dicarióticas e apresentam grampos de conexão. / The conditions for the production and regeneration of protoplasts from the fungus Crinipellis perniciosa were studied. The highest release of protoplasts was obtained with 0.8 M KCl in phosphate buffer, pH 5.8, as an osmotic stabilizer; 20 mg.mL -1 of the lytic enzyme Glucanex; 10 mg.mL -1 of BSA and 1 to 2 hours of enzymatic digestion. Under these conditions, about 2.0 x 10 7 prtoplast.mL -1 were released from the secondary mycelium of C. perniciosa grown in BDA. The best regeneration frequency was achieved when 0.5M sucrose was used as an osmotic stabilizer. Nuclear Giensa staining revealed that 58,8% of the protoplasts were anucleate, 37,5% uninucleate, and 3,7% binucleate. Although differences in colony growth and mycelial aspect had been observed, RAPD analysis of colonies regenerate form protoplasts did not reveal any genetic polymorphism. The mycelium of C. perniciosa as well as those from colonies regenerate from protoplasts were dikaryotic and possessed clamp connections.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T18:42:49Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 22408 bytes, checksum: e3f5068222be03351cd7ba5bce93b7f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T18:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 22408 bytes, checksum: e3f5068222be03351cd7ba5bce93b7f8 (MD5) Previous issue date: 2005-12-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho, elementos transponíveis da Classe I e da Classe II foram caracterizados no genoma do fungo Crinipellis perniciosa, agente causal da enfermidade conhecida como vassoura-de-bruxa no cacaueiro. C. perniciosa apresenta uma alta variabilidade genética e elementos transponíveis têm sido relatados como um dos principais agentes responsáveis pela alta plasticidade e adaptabilidade apresentada por fungos fitopatogênicos. Buscas preliminares feitas no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa revelaram a presença de uma seqüência de DNA com similaridade a transcriptase reversa de elementos da Classe I pertencente ao grupo gypsy/Ty3. Esta seqüência foi amplificada em diferentes isolados de C. perniciosa que pertencem aos biótipos C, S e L e distintas regiões geográficas. Seqüenciamento de fragmentos amplificados revelaram a ocorrência de vários eventos de transição G:C para A:T, indicando a existência de um possível mecanismo de silenciamento tipo RIP. Análises de hibridização mostraram a presença de um alto número de cópias da região que codifica a transcriptase reversa e diferentes perfis de hibridização nos isolados dos biótipos C, S e L, indicando que os elementos que contém estas seqüências podem ter um importante papel na variabilidade de C. perniciosa. O fragmento de DNA contendo a seqüência de transcriptase reversa foi utilizado para o isolamento de fagos recombinantes em um banco genômico de C. perniciosa. Retrotransposons do grupo gypsy/Ty3, denominados CpSaci1 e CpSaci2, foram caracterizados a partir de uma nova seqüência presente no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de- Bruxa e de um dos fagos recombinantes obtidos. CpSaci1 possui 6.856 pares de bases (pb) e contém longas repetições terminais (LTRs) diretas de 423 pb que não apresentam regiões normalmente encontradas em LTRs de retrotransposons. Duas seqüências de leitura aberta (ORFs) foramidentificadas codificando peptídeos similares à GAG e à poliproteína POL contendo os domínios protease, transcriptase reversa, RNase H e integrase. A seqüência de DNA de CpSaci2, que foi parcialmente caracterizada, possui cerca de 82% de identidade com CpSaci1. Estas duas cópias apresentam inserções de bases e códons de parada na região estrutural indicando que se tratam de cópias inativas. Entretanto, análises por RT-PCR revelaram a presença de transcritos CpSaci normalmente expressos em C. perniciosa cultivado em meio mínimo, e que, sob condições de estresse nutricional, apresentaram uma maior expressão. CpSaci está presente em alto número de cópias no genoma dos biótipos C, S e L de C. perniciosa, sendo que isolados do biótipo C originados do estado da Bahia apresentam dois perfis de hibridização, e alguns fragmentos de DNA em comum com isolados da região amazônica. Por possuir alto número de cópias e ser ativo, o retrotransposon CpSaci provavelmente está relacionado com a geração de variabilidade genética em C. perniciosa. Além do retrotransposon CpSaci, elementos transponíveis da Classe II também foram caracterizados. As cópias denominadas Boto1 e Boto2 foram obtidas a partir do banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa e a partir de um fago recombinante isolado de um banco genômico de C. perniciosa, respectivamente. Boto1 é flanqueado por uma duplicação de 3 pb (TAA) e possui duas ORFs, uma que codifica uma transposase e outra que codifica uma proteína com baixa similaridade a um regulador da transcrição de plantas. As regiões estruturais que codificam as transposases de Boto1 e Boto2 são interrompidas por um intron de 53 pb com alto conteúdo A+T. As transposases de Boto1 e Boto2 são altamente similares à transposases de elementos PIF-like. Estas transposases são relacionadas à transposases de seqüências de inserção do grupo IS5 de bactérias e fazem parte de uma nova família de transposons da Classe II denominada PIF/IS5. A superfamília PIF/IS5 é raramente encontrada em fungos, e como análises filogenéticas indicam que as transposases Boto-like formam um ramo evolutivo independente, estas seqüências parecem ter sido transferidas horizontalmente para o genoma de C. perniciosa. Transcritos Boto- like foram amplificados por RT-PCR em C. perniciosa normalmente cultivado em meio de cultura, mas não foram ativados por estresse nutricional. Este é o primeiro relato de elementos da superfamília PIF/IS5 em um fungo fitopatogênico. / In this work, Class 1 (RNA) and Class 2 (DNA) transposable elements were characterized in the genome of Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches’ broom disease of cocoa. C. perniciosa presents a high genetic variability and transposable elements have been reported as the main agents responsible for the high plasticity and adaptability presented by phytopathogenic fungi. Once the genome of this fungus has been sequenced, preliminary searches in the database of the witches’ broom genome project revealed the presence of a DNA sequence with similarity to the reverse transcriptase of gypsy/Ty3-like retrotransposons. This sequence was amplified in different C. perniciosa isolates that belong to the C-, S-, and L-biotypes and to different geographical areas. The sequencing of the amplified fragments revealed the occurrence of several G:C to A:T transitions, indicating the existence of a possible RIP-like silencing mechanism. Southern analyses showed a high copy number of the reverse transcriptase gene with different profiles among the C-, S- and L- biotypes, indicating that the elements that contain these sequences may have an important role in C. perniciosa genetic variability. The DNA fragment containing the reverse transcriptase gene sequence was used to isolate different recombinant phages from a C. perniciosa genomic library. Gypsy/Ty3-like retrotransposons, named CpSaci1 and CpSaci2, were characterized from a new sequence present in the sequencing project database and from one recombinant phage. CpSaci1 contains 6.856 bp and long direct terminal repeats (LTRs) of 423 bp that do not present regions usually found in LTRs. Two open reading frame (ORFs) were identified and they code proteins with similarity to GAG and to a POL polyprotein showing protease, reverse transcriptase, RNase H, and integrase domains. Partially characterized DNA sequence of CpSaci2 possesses about xi82% of identity to CpSaci1. The copies CpSaci1 and CpSaci2 present punctual base insertions and stop codons in the structural region indicating that they are inactive copies. However, RT-PCR analyses revealed the presence of CpSaci- like transcripts expressed in C. perniciosa, presenting a higher expression under nutritional stress conditions. CpSaci is present in high copy number in the genome of the C-, S- and L-biotypes. The C-biotype isolates from Bahia state, Brazil, present two hybridization profiles and some DNA fragments similar to those of the isolates from the Amazon region. Once CpSaci presents a high copy number and activity, it is probably related to the generation of genetic variability in C. perniciosa. Besides the CpSaci retrotransposon, a Class II transposable element was also characterized. Two copies, named Boto1 and Boto2, were obtained from the genome sequencing database and from a recombinant phage obtained from a C. perniciosa genomic library, respectively. Boto1 is flanked by a 3 bp duplication (TAA) and possesses two ORFs, one that codes a transposase and another that codes a protein with low similarity to a plant transcription regulator. The structural regions that code the transposases of Boto1 and Boto2 are interrupted by a 53 bp intron with high A+T content. The aminoacid sequence of Boto1 and Boto2 transposases are highly similar to plant PIF-like transposases. These transposases are related to those of bacterial insertion sequences of the group IS5 and they are members of a new superfamily of Class II transposons named PIF/IS5. Once this superfamily is rarely found in fungi and phylogenetic analyses indicate that Boto1 and Boto2 transposases present an independent evolutionary branch, it seems that these sequences were horizontally transferred to C. perniciosa genome. Although Boto-like transcripts were amplified in C. perniciosa normally cultivated in culture medium, they were not activated by nutritional stress. This is the first report of elements of the PIF/IS5 superfamily in a phytopathogenic fungus.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T11:24:37Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 21086 bytes, checksum: 3d292df98b4ee48a6f67c9bd5e4e47b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T11:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 21086 bytes, checksum: 3d292df98b4ee48a6f67c9bd5e4e47b9 (MD5) Previous issue date: 2005-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho relata o isolamento e caracterização de dois elementos transponíveis da classe II no fungo Crinipellis perniciosa a partir de seqüências disponibilizadas no banco de dados do projeto “Genoma da Vassoura-de-Bruxa”. Este fungo é de grande importância econômica, uma vez que é o causador da mais séria enfermidade da cacauicultura. O prévio acesso ao banco de dados do projeto “Genoma da Vassoura-de-Bruxa” disponibilizou seqüências que apresentaram homologia a conhecidos elementos transponíveis pertencentes às superfamílias Tc1/mariner e hAT. Estas seqüências foram utilizadas para a construção de oligonucleotídeos. Um fragmento de DNA específico para cada elemento foi utilizado como sonda para o isolamento de elementos completos. Estes elementos foram isolados a partir do banco genômico de C. perniciosa construído no vetor λEMBL3 (Stratagene), sendo denominados Mico e Guppy. A análise da seqüência parcial do elemento Mico no banco de dados NCBI demonstrou alta similaridade com o domínio funcional DDE, domínio catalítico presente em transposases da superfamília Tc1/mariner. Para a seqüência parcial do elemento Guppy, foram evidenciadas regiões de conservação de aminoácidos, apesar de não indicar a presença dos domínios conservados I, II e III (hATC), essenciais para a atividade de transposição dos elementos da superfamília hAT. A análise da expressão destes elementos realizada neste trabalho não forneceu evidências da atividade destes elementos, sob condições de estresse por temperatura e concentração salina. A análise de distribuição dos elementos Mico e Guppy, em diferentes isolados pertencentes a diferentes biótipos de C. perniciosa, pelas técnicas de PCR e hibridização sugere a presença de cópias polimórficas e a ocorrência de subfamília destes elementos no genoma de C. perniciosa. O perfil de hibridização homogêneo do elemento Guppy fornece indícios de que este seja um elemento não-nativo e tenha sido adquirido por um ancestral comum dos biótipos. Já o perfil de hibridização do elemento Mico permitiu o agrupamento dos diferentes isolados do biótipo C, relacionando com as diferentes regiões geográficas das quais os fungos foram isolados, demonstrando, assim, o seu potencial para o uso como marcador molecular. / This study reports the isolation and characterization of two class II transposable elements in the fungus Crinipellis perniciosa from sequences available in the data bank of the "Witch's Broom Genome" project. This fungus is of great economic importance once it is the causal agent of the most serious disease in cocoa crop. Previous acess to the data bank of the "Witch's Broom Genome" project allowed the identification of sequences with homology to known transposable elements belonging to the superfamilies Tc1/mariner and hAT. These sequences were used for the construction of oligonucleotides. An specific DNA fragment for each element was used as a probe for the isolation of the complete elements. These elements were isolated from C. perniciosa genomic bank constructed in the vector λEMBL3 (Stratagene) and named Mico and Guppy. The analysis of the partial sequence of Mico element in NCBI database showed high similarity to the DDE functional domain, which is a catalytic domain present in transposases of the superfamily Tc1/mariner. Conserved aminoacids regions were evidenced in the analysis of the partial sequence of Guppy element, although they did not indicate the presence of the I, II or III conserved domains (hATC), essential for the transposition activity of the elements of the superfamily hAT. The analysis of the expression of these elements performed in this study did not give evidence of the activity of these elements under stress conditions of temperature and salt concentration. The analysis xof distribution of Mico and Guppy elements in different isolates from different biotypes of C. perniciosa by PCR and hybridization techniques suggests the presence of polymorfic copies and the occurrence of subfamilies of these elements in C. perniciosa genome. The homogenic hybridization profile of Guppy element offers proofs that it may be a non-native element and may be acquired by a common ancestor of the biotypes. The hybridization profile of Mico element allowed the grouping of the different isolates of the biotype C relating to the different geographic regions from which the fungi were isolated, showing its potential as a molecular mark.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:19:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) Previous issue date: 2003-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho abordou a transformação genética em C. perniciosa, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, investigando os fatores que podem influenciar a eficiência de transformação neste organismo, bem como a forma de integração do vetor no genoma do fungo. A transformação dos protoplastos foi realizada pelo método químico do PEG/CaCl 2 e a seleção dos transformantes foi feita com base na resistência à higromicina B. A eficiência de transformação foi analisada em função do promotor utilizado para expressar o gene marcador (se proveniente de basidiomiceto ou de ascomiceto), da forma do vetor (circular ou linear) e da presença de inibidores de nuclease (ácido aurintricarboxílico, putrecina e espermidina) na mistura de transformação. A técnica REMI (restriction enzyme mediated integration) foi realizada utilizando a enzima de restrição BamHI. Também foi construído um vetor contendo o gene que confere resistência à higromicina B (hph) sob o comando do promotor do gene gpd de Agaricus bisporus, para experimentos futuros de mutagênese insercional. A utilização do promotor gpd de Agaricus bisporus resultou em uma eficiência de transformação cinco vezes superior àquela obtida quando o promoter gpd de Aspergillus nidulans foi utilizado. Além disso, os transformantes desenvolveram- se mais rapidamente, com redução do tempo necessário para visualização das colônias nas placas em comparação aos transformantes que continham o gene hph sob o controle do promotor gpd Aspergillus. Os inibidores de nucleases putrecina e ATA (ácido aurintricarboxílico) reduziram a eficiência de transformação nas condições utilizadas, enquanto que a presença de espermidina não exerceu influência quando comparado ao controle. A linearização do vetor não influenciou a eficiência de transformação e todos os transformantes resultantes desse tratamento que foram analisados por hibridização apresentaram um padrão complexo de integração, com duas ou mais cópias do plasmídeo inseridas em posições distintas no genoma. A mais elevada eficiência de transformação foi obtida com REMI, utilizando-se 10U da enzima de restrição BamHI e 10 μg do vetor na forma circular. Nesta condição, foram obtidos cerca de 64 transformantes/μg de plasmídeo, cerca de três vezes mais transformantes que o tratamento onde BamHI não esteve presente. Não foi verificada a influência da enzima de restrição promovendo a obtenção de transformantes com uma única cópia do vetor integrada. Os transformantes mostraram alto nível de resistência à higromicina (>500 μg/mL). Dos transformantes analisados quanto à estabilidade mitótica, 100% conservaram-se resistentes após a passagem por meio não seletivo durante 40 dias. / The present work has investigated the different conditions that may influence the transformation efficiency and the way transforming DNA integrates into the genome of the fungus Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease of cacao. Protoplast transformation was done by the PEG/CaCl 2 method. Transformant colonies were selected for resistance to hygromycin B. The transformation efficiency was related to the type of promoter used to express the hph gene (either from an ascomycete or from a basidiomycete fungus), vector shape (linear or circular forms), and the presence of nuclease inhibitors (aurintricarboxylic acid, putrescine or spermidine) in the transformation mix. The REMI (restriction enzyme-mediated integration) technique was employed using BamHI. For future experiments of insertional mutagenesis, a plasmid containing the hph gene controlled by the gpd gene from Agaricus bisporus was constructed. The use of the gpd promoter from Agaricus bisporus resulted in a five-fold increase in transformation efficiency compared to that obtained with the gpd promoter from Aspergillus nidulans. In addition, these transformants showed faster growth than those containing gpd from Aspergillus. Putrescine and ATA (aurintricarboxylic acid) decreased the transformation efficiency, while spermidine did not have any influence in comparison to the control. Vector linearization was not effective and a complex pattern of plasmid integrations resulted from this procedure, with two or more copies integrated throughout the genome. The highest efficiency was obtained with REMI (10U of BamHI added prior to transformation with 10 μg of circular vector). An efficiency of 64 transformants/μg of plasmid was obtained in this treatment. Under the analyzed conditions, BamHI did not induce single copy integrations in Crinipellis perniciosa, although an approximate three-fold increase in the transformation efficiency was obtained. The transformants were highly resistant to hygromycin (> 500 μg/mL). All transformants analyzed were mitotically stable after successive transfers to nonselective media for 40 days.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-30T17:09:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 737829 bytes, checksum: 468c7b1f1e49b2d94408b2a47398d2e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T17:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 737829 bytes, checksum: 468c7b1f1e49b2d94408b2a47398d2e3 (MD5) Previous issue date: 2004-05-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Considerando a importância da modelagem para o detalhamento dos mecanismos envolvidos no sistema solo-planta-atmosfera, desenvolveu-se no presente trabalho, um modelo para o desenvolvimento e a produtividade do cacaueiro, considerando as relações entre o clima e os processos fisiológicos e fenológicos da cultura, denominado Modelo Cacau. Além disso, foram estudados os possíveis fatores climáticos e fenológicos atuantes sobre a ocorrência de vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Utilizou-se o conceito de modelagem modular, que preconiza a compartimentalização dos processos em módulos independentes e interligados, para o desenvolvimento de um modelo mecanístico para o cacaueiro. O modelo considera os dados meteorológicos diários como variáveis de entrada, os quais atuam nos compartimentos referentes à fisiologia da cultura, incluindo os processos de fotossíntese, respiração, evapotranspiração, partição de assimilados, entre outros, gerando informações sobre as épocas de lançamentos foliares e a produção de amêndoas.Os dados experimentais utilizados neste trabalho foram coletados nas safras agrícolas de 1991 a 1995, em lavoura comercial de cacau com 6 anos de idade, localizada na cidade de Camacã, Bahia (Latitude 15,4oS; Longitude 39,5oW),. Obtiveram-se dados diários de clima e dados semanais de fenologia do cacaueiro e ocorrência de vassoura-de-bruxa. Parte dos dados experimentais serviu para a simulação utilizando o Modelo Cacau, cujas respostas foram comparadas aos dados observados no mesmo período. Para o estudo dos fatores climáticos e fenológicos atuantes sobre a ocorrência de vassoura-de-bruxa do cacaueiro , os dados experimentais foram organizados em diferentes intervalos de tempo até a ocorrência da doença em ramos e a formação de frutos morango. A comparação foi realizada por meio da análise de trilha. Os resultados indicaram que o ciclo anual do cacaueiro completa-se aos 3000 Graus-dia Acumulados (GD), com início de lançamentos foliares em torno de 200, 1100 e 1900GD. A formação de almofadas florais ocorreu apenas no intervalo de 400 a 2800 GD e o ciclo de frutos foi completado em 1400 GD. O modelo modular de desenvolvimento do cacaueiro simulou as épocas de ocorrência de surtos de lançamentos foliares na Bahia. As infecções causadas por Crinipellis perniciosa em ramos vegetativos ocorreram preferencialmente nas gemas em desenvolvimento, cerca de 3 a 4 semanas antes dos fluxos de lançamentos foliares, os quais coincidiram com o aparecimento de sintomas. A umidade do ar teve influência sobre a ocorrência da doença em ramos e sobre a formação de frutos morango. O monitoramento das condições de umidade do ar, juntamente com o acompanhamento da fenologia da cultura através das ferramentas de modelagem, pode ser utilizado na indicação das épocas propícias à infecção de C. perniciosa, quando medidas eficazes de controle poderão ser acionadas. / The first part of the present study had for objective the development of a dynamic deterministic mechanistic model for the cocoa crop considering the relationships between the climate and its physiologic and phenologic processes. The modulate modeling concept was used, which concerns the compartmentalization of the processes in independent and interlinked modules, for the development of the cocoa mechanistic model. The model considers the daily meteorological data as entrance variables, which act in the compartments referring to the physiology of the culture, including the photosynthesis processes, breathing, evapotranspiration, partition of assimilates, among others, generating information about the period of foliate releasing and about the pod production. The experimental data used in this study were collected in a commercial crop in Bahia from 1991 to 1995, including hourly climate data and weekly cocoa phenology data and witches broom occurrence data. Part of the experimental data was used for the development of the model and the remaining was used for a simulation, whose answers were compared to the data observed in the same period. In the final part of this study, the possible climatic and phenologic factors acting on the occurrence of cocoa witches broom were studied. The experimental data were organized in different intervals of time to the occurrence of the disease in branches and the development of chirimoia fruits for the comparison through path analysis. The results indicated that the cocoa annual cycle is completed in 3000 degree-days (GD), with foliate release around 200, 1100 and 1900GD; floral cushions formation done between 400 and 2800 GD and fruit cycle completed in 1400 GD. The influence of soil humidity was also verified in the crop phenology. The modulate model of cocoa development successfully simulated the pod productivity in conditions of water deficit and the periods of occurrence of foliate releasing in Bahia. The infections caused by Crinipellis perniciosa in vegetative branches mainly occured in developing buds, about 3 to 4 weeks before the occurrence of the foliate release, which coincided with symptom developing. The air humidity had influence on the occurrence of the disease in branches and in the chirimoia fruit formation. The air humidity condition monitoring and the cocoa phenology accompaniment through modeling tools can be used in the indication of the favorable periods to the infection of C. perniciosa, when effective control should be done.

Die Hexenbesenkrankheit (Crinipellis perniciosa) ist eine Pilzkrankheit, die nur meristematisches Pflanzengewebe des Kakaobaumes befällt. Sie tritt bisher ausschließlich auf dem Lateinamerikanischen Kontinent auf. Für die Region des Alto Beni im feuchttropischen Tiefland Boliviens wurden die Interaktionen zwischen Witterung, Inokulum und Phänologie der Wirtspflanze untersucht, um effiziente und ökonomisch vertretbare Kontroll- und Bekämpfungsprogramme zu entwickeln. Von 1994 bis 97 wurden zudem die Kakaoklone ICS 1, ICS 6, ICS 8, ICS 95 und TSH 565 unter Feldbedingungen auf Hexenbesentoleranz und Ertrag untersucht. Zusätzlich wurden unterschiedliche Baumschnittfrequenzen auf ihre Effizienz hinsichtlich des Ertragsverhaltens der Klone und der Auswirkung auf Hexenbeseninfektionen überprüft. Die Ergebnisse zeigen einen Zusammenhang zwischen Niederschlagsereignissen und der Ausbildung von Fruchtkörpern an Hexenbesen. Es konnte im gesamten Untersuchungszeitraum jedoch kein kausaler Zusammenhang zwischen der Intensität von Fruchtkörperbildungen an Hexenbesentrieben und der Anzahl an Hexenbeseninfektionen der untersuchten Bäume festgestellt werden. Die fünf Klone zeigten sowohl signifikante Unterschiede in Bezug auf ihre Anfälligkeit gegenüber Hexenbesen als auch in ihrem Ertragsverhalten. Die unterschiedliche Schnitthäufigkeit zeigte dagegen weder statistisch abgesicherte Differenzen hinsichtlich der Anzahl von Hexenbeseninfektionen noch hatte sie Einfluss auf den Ertrag. Die gängigen Bekämpfungsmethoden wie Baumschnitt und der Einsatz von tolerantem Pflanzenmaterial stellen keine grundsätzliche Lösung des Problems dar. Die bisher gewonnen Erfahrungen im Landbau unter Anwendung der Prinzipien sukzessionaler Agroforstsysteme zeigten, dass diese möglicherweise eine langfristige Perspektive für die Landnutzung in tropischen Regionen und zur Reduzierung phytosanitärer Probleme darstellen könnten. / The witches’ broom disease (Crinipellis perniciosa) is a fungal infection which only affects the meristematic plant tissues of the cocoa tree. To date it has been restricted to the Latin American continent. The aim of this work was to examine scientifically the measures undertaken in the Alto Beni region in the humid tropical lowlands of Bolivia, to curb the witches’ broom disease (Crinipellis perniciosa) by phytosanitary pruning measures and by the use of various tolerant clones From 1994 to 97, the cocoa clones ICS 1, ICS 6, ICS 8, ICS 95 and TSH 565 were also studied under field conditions at the Sapecho location for witches’ broom tolerance and yield. In addition, various pruning frequencies were examined for their efficiency with regard to the yields of the clones and the effects on witches’ broom infection The results show a connection between rainfall levels and the formation of basidiocarps on the witches’ broom. However, over the whole of the investigation period, no causal connection was found between the intensity of basidiocarp production on the witches’ broom shoots and the number of witches’ broom infections on the trees under investigation. The five clones showed significant differences both in relation to their susceptibility to witches’ broom and in their yields. The different pruning frequencies, on the other hand, did not show any statistically provable differences in terms of the number of witches’ broom infections, nor did they influence the yields. It has become clear that neither the own studies nor the many research works undertaken at an international level were able to find a fundamental solution to the witches’ broom problem. Agriculture using the principles of successional agroforestry systems could represent a long-term perspective for land use in these areas, with the emphasis on more than short-term economic, social or structural objectives.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-02T18:13:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573742 bytes, checksum: 98367309cf338c51806873dec72c8ab1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573742 bytes, checksum: 98367309cf338c51806873dec72c8ab1 (MD5) Previous issue date: 2005-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Durante a realização deste trabalho teve-se por objetivo isolar da superfície de frutos de cacaueiro bactérias endosporogênicas e actinomicetos e selecionar os isolados mais eficientes visando o biocontrole da vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) e da podridão-parda (Phytophthora spp) em frutos de cacaueiro. Foram obtidos um total 203 isolados de endosporogênicas e 94 de actinomicetos. À coleção adicionaram-se mais 39 isolados de bactérias antagônicas a patógenos do cacaueiro obtidas em trabalhos anteriores, totalizando 336 isolados. A seleção dos mais promissores foi feita com base na capacidade dos isolados inibirem a germinação de basidiósporos na superfície de frutos destacados do genótipo TSH 516, com 20-30 dias de idade. Numa primeira fase, cada isolado foi testado em um único fruto. Os isolados que inibiram a germinação de pelo menos 50 % dos basidiósporos foram novamente testados, desta vez cada isolado foi aplicado a três frutos. Foram obtidos como os mais promissores os isolados Ac4, Ac19, Ac26, Ac68, e Ac79 todos pertencentes ao gênero Streptomyces. Verificou-se que o uso de células vegetativas provenientes do cultivo desses antagonistas em meio liquido era mais eficiente que o uso dos esporos desses mesmos isolados na inibição da germinação dos basidiósporos. Adicionalmente, o sobrenadante proveniente do cultivo desses isolados em meio liquido mostrou-se tão eficiente quanto o uso de células vegetativas. A seleção final dos antagonistas foi também baseada na inibição da germinação de basidiósporos do patógeno porém, em condições de campo quando o isolado Ac79 foi considerado como o mais promissor. Os isolados pré-selecionados foram também testados quanto a sua capacidade em proteger frutos de cacau contra a podridão-parda (Phytophthora palmivora) em que destacou-se o isolado Ac26. Em ensaios em laboratório verificou-se que os cinco melhores isolados eram capazes de produzir sideróforos, ácido cianídrico e quitinases porém a estas substâncias atribui-se apenas papel secundário na inibição da germinação de propágulos de C. perniciosa. Adicionalmente, verificou-se que os isolados Ac26 e Ac79, em diferentes meios de cultura, produzem substâncias capazes de inibir a germinação de basidiósporos de C. perniciosa. As substâncias com essa propriedade produzidas pelo isolado Ac79 apresentam massa molecular inferior a 1 kDa enquanto aquelas produzidas pelo isolado Ac26 apresentam massa molecular entre 1 e 12 kDa. Para esse último, o fracionamento do sobrenadante em colunas e troca aniônica e catiônica permitem afirmar que pelo menos duas substâncias diferentes estão presentes sendo uma aniônica e uma catiônica. Os isolados Ac26 e Ac79 foram testados quando a sua capacidade em induzir resistência em mudas de cacaueiro. Verificou-se que os isolados foram capazes de induzir aumento na atividade de peroxidases e polifenol oxidases. Porém a não ocorrência de sintomas em mudas inoculadas com C. perniciosa dificultou estimar o real significado do aumento da atividade dessas enzimas na proteção das mudas. Ensaios mostraram a incompatibilidade entre os dois antagonistas quando aplicados em mistura porém quando o sobrenadante desses dois antagonistas foram combinados, houve efeito sinergístico na proteção de frutos contra P. palmivora. Em campo foi testada a real capacidade dos antagonistas aplicados tanto individualmente como em associação em proteger frutos de cacaueiro contra a inciência natural da podridão-parda e da vassoura- de-bruxa. A efetividade dos isolados foi comparada à efetividade do óxido cuproso e à plantas sem nenhum tratamento. Não foi observada diferença estatísticamente significativa entre os diferentes tratamentos. Esta ausência de controle das doenças é atribuída ao início tardio das aplicações. Com base nos resultados dos diferentes ensaios pode-se concluir que o isolado Ac26 é um antagonista promissor para o biocontrole da podridão-parda enquanto o Ac79 é um antagonista promissor para o biocontrole da vassoura-de-bruxa. Porém são necessários mais estudos visando confirmar a efetividade desses isolados em condições de campo. / This work had as main objective to isolate from the surface of cocoa fruits sporogenic bacteria as well as actinomycetes and select the ones more efficient for the biocontrole of witches’ broom (Crinipellis perniciosa) and black pod (Phytophthora spp.) in cocoa fruits. A total of 336 isolates was obtained, being 203 of them sporogenic bacteria, 94 actinomycetes and 39 bacteria antagonic to cocoa pathogens, selected in previous research. The initial screen was accomplished based on the ability of every isolate under investigation to inhibit basidiospore germination onto the surface of 20-30 days old detached fruits (TSH 516 genotype). In a first approach, a single fruit per isolate was used and potential antagonists able to inhibit basiodiospore germination in, at least, 50% were selected. In a second approach, selection was done over, by using three fruits per isolate. At the end of the selection procedure, the potential antagonists namely Ac4, Ac19, Ac26, Ac68 and Ac79, all of them actinomycetes belonging to the genus Streptomyces, were chosen for continuing the work. It was verified that vegetative cells from liquid cultures were more efficient than spores for inhibiting basidiospore germination as well as that supernates from liquid cultures were as efficient as vegetative cells. Repeating the same procedure under field conditions with the best 5 isolates lead us to select definitely the isolate Ac79. The five selected antagonists were able to protect cocoa fruits against black pod (Phytophthora palmivora) and out of the isolate Ac26 was the most efficient in this aspect. In laboratory tests, it was possible to detect that the five isolates were able to produce siderophores, cyanide and chitinases but apparently those determinants of microbial antagonism seem to have a secondary importance on the inhibition of C. perniciosa basidiospores. Moreover, it was verified that antagonists Ac26 and Ac79, after being grown in distinct culture media are able to produce substances that inhibit basidiospore germination. Isolate Ac79 synthesizes inhibitory substance with a molecular weight smaller than 1 kDa while the one given off by isolate Ac26 have molecular weights ranging from 1 to 12 kDa. For the latter, resolution of supernates by column chromatography (ion exchange, either anionic or cationic) allowed us to conclude that at least two distinct antimicrobial compounds are present, being one negatively charge and the other one positively. Isolates Ac26 and Ac79 were checked for their ability as resistance inducers in cocoa seedlings and cocoa tissue exposure to their propagules did increase activity of peroxidases and polyphenoloxidases. Nevertheless, lack of symptoms in inoculated seedlings make difficult to evaluate the actual meaning of the aforementioned increases in activity as far as induced resistance is concerned. Compatibility assays indicated that it is impossible to deliver to fruits to be protected a mixture of propagules of both antagonism but the same does not apply to a mixture of their supernates and that this latter mixture has even a synergistic effect in terms of protection of cocoa fruits against an isolate of P. palmivora. In the field antagonists were delivered either alone or combined, in attempts to protect cocoa fruits against natural incidence of witches’ broom and black pod, being cuprous oxide and water as controls. No significant differences were observed among treatments and the reason might be because sprayings started too late. Results obtained from the aforementioned trials suggest that isolate Ac26 is a good antagonist for black pod while isolate Ac79 may turn into a good biocontrol agent for wiches’s broom, in spite of the fact that more tests ought to be performed in order to support this statement. / Tese importada do Alexandria

A vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) é a doença mais importante da cacauicultura no Brasil. Sua principal forma de controle é o emprego de variedades resistentes, entretanto, devido à estreita base genética encontrada nos plantios comerciais de cacaueiro, esta resistência tem sido freqüentemente quebrada. Os objetivos deste trabalho foram: selecionar novas fontes de resistência a C. perniciosa entre acessos de cacaueiro originalmente coletados na Amazônia Brasileira (série CAB), identificar por mapeamento genético locos controladores de características quantitativas (QTLs) associados a esta resistência nos genótipos selecionados; e avaliar a relação genética dos clones CAB utilizados como genitores resistentes nos cruzamentos contrastantes com os acessos selecionados por agricultores do Sul da Bahia e as fontes tradicionais de resistência a C. perniciosa. Com base na proporção de infecção de vassoura-de-bruxa, foram avaliados os níveis de resistência a C. perniciosa de 44 famílias de cacaueiro em condições de casa de vegetação e campo. Nos ensaios de casa de vegetação, as médias das proporções de infecção foram comparadas através de contrastes pelo teste de Wald, e nos de campo por análise de medidas repetidas e contrastes. Dentre as famílias avaliadas em casa de vegetação e campo, as que apresentaram menores incidências de sintomas de vassoura-de-bruxa foram aquelas derivadas de ‘CAB 0169’, ‘CAB 0208’, ‘CAB 0214’, ‘CAB 0270’, ‘CAB 0371’, ‘CAB 0388’, ‘CAB 0392’ e ‘CAB 0410’. Foram desenvolvidos dois mapas de ligação conjuntos para as populações dos cruzamentos contrastantes entre os acessos selecionados como mais resistentes a C. perniciosa e o genitor suscetível ‘ICS 39’. Nas construções dos mapas de ligação foram utilizados 65 locos de microssatélites. Para a família derivada do cruzamento de ‘ICS 39 x CAB 0208’ foram formados 11 grupos de ligação com cobertura total de 541 cM e distância média entre marcas de 14 cM. O mapa de ligação ‘ICS 39 x CAB 0214’ apresentou cobertura total de 501 cM nos 10 grupos de ligação formados com distância média entre marcas de 11,4 cM. Dectataramse três QTLs associados à resistência a C. perniciosa, um no grupo de ligação VIII de ‘ICS 39 x CAB 0208’ e dois no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’, sendo um no grupo de ligação IV e outro no grupo IX. A relação genética entre os dois clones ‘CAB’ genitores das populações contrastantes e 81 genótipos de cacaueiro utilizados como fontes de resistência a C. perniciosa foram baseadas nas freqüências alélicas de 20 locos de microssatélites. As análises de dissimilaridade genética entre os acessos de cacaueiro originaram dois grupos. Os ‘CAB 0208’ e ‘CAB 0214’ não fizeram parte dos grupos formados. O grau de parentesco entre estes dois acessos foi muito alto, chegando próximo ao de irmãos-germano, não sendo aparentados com nenhum dos outros acessos. Os clones selecionados por agricultores derivam na sua maioria de ‘Scavina 6’, a fonte de resistência comumente empregada. / The witches’ broom (Crinipellis perniciosa) is the most important disease of cacao in Brazil. The main method of disease control is the use of resistant cultivars, however due to the narrow genetic basis found in commercial cacao growing areas, the resistance is frequently broken. The objectives of this work were: to select new sources of resistance to C. perniciosa among cacao accessions originally collected in the Brazilian Amazon (CAB series); to identify by genetic mapping, quantitative trait loci (QTLs) associated with resistance in selected genotypes; and to evaluate the genetic relationship between the selected accessions and clones selected by cacao growers from Southern Bahia with traditional resistance sources against C. perniciosa. Based on the proportion of witches’ broom infection, the levels of resistance to C. perniciosa were estimated in 44 cacao families under greenhouse and field conditions. Under greenhouse conditions, the average proportion of infection was compared based on Wald test, and under field conditions using an analysis of repeated measures and contrast. Among the families evaluated under greenhouse and field conditions, the ones with least incidence of witches’ broom symptoms derived from ‘CAB 0169’, ‘CAB 0208’, ‘CAB 0214’, ‘CAB 0270’, ‘CAB 0371’, ‘CAB 0388’, ‘CAB 0392’ and ‘CAB 0410’. Two linkage maps were developed for populations derived from crosses between contrasting accessions selected as the most resistant to C. perniciosa (‘CAB 0208’ and ‘CAB 0214’) and a susceptible accession ‘ICS 39’. The linkage maps were developed using 65 microsatellite loci, applying the software JoinMap 3.0®. The identification and localization of QTLs associated with resistance to C. perniciosa were performed using MAPQTLTM 4.0. For the family derived from ‘ICS 39 x CAB 0208’, 11 linkage groups were formed, with total coverage of 541 cM and 14 cM average distance between markers. The linkage map from ‘ICS 39 x CAB 0214’ presented a total coverage of 501 cM in 10 linkage groups formed with an average distance between markers of 11.4 cM. Three QTLs associadted with resistance to C. perniciosa were detected, with one at linkage group VIII of ‘ICS 39 x CAB 0208’, and two for the ‘ICS 39 x CAB 0214’ family, with one located at linkage group IV and another at group IX. The genetic relationship between these two CAB accessions and 81 genotypes used as source of resistance to C. perniciosa were determined using genetic dissimilarity and co-ancestry based on allele frequencies of 20 microsatellite loci. The dissimilarity analyses among the accessions generated two distinct groups. ‘CAB 0208’ and ‘CAB 0214’ did not belong to any of the two groups. The co-ancestry between the two accesions were high, close to full-sib, but without any relationship with any of the other genotypes. The clones selected by growers derived mostly from ‘Scavina 6’, a commonly used source of resistance to C. perniciosa.

A vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) é a doença mais importante da cacauicultura no Brasil. Sua principal forma de controle é o emprego de variedades resistentes, entretanto, devido à estreita base genética encontrada nos plantios comerciais de cacaueiro, esta resistência tem sido freqüentemente quebrada. Os objetivos deste trabalho foram: selecionar novas fontes de resistência a C. perniciosa entre acessos de cacaueiro originalmente coletados na Amazônia Brasileira (série CAB), identificar por mapeamento genético locos controladores de características quantitativas (QTLs) associados a esta resistência nos genótipos selecionados; e avaliar a relação genética dos clones CAB utilizados como genitores resistentes nos cruzamentos contrastantes com os acessos selecionados por agricultores do Sul da Bahia e as fontes tradicionais de resistência a C. perniciosa. Com base na proporção de infecção de vassoura-de-bruxa, foram avaliados os níveis de resistência a C. perniciosa de 44 famílias de cacaueiro em condições de casa de vegetação e campo. Nos ensaios de casa de vegetação, as médias das proporções de infecção foram comparadas através de contrastes pelo teste de Wald, e nos de campo por análise de medidas repetidas e contrastes. Dentre as famílias avaliadas em casa de vegetação e campo, as que apresentaram menores incidências de sintomas de vassoura-de-bruxa foram aquelas derivadas de ‘CAB 0169’, ‘CAB 0208’, ‘CAB 0214’, ‘CAB 0270’, ‘CAB 0371’, ‘CAB 0388’, ‘CAB 0392’ e ‘CAB 0410’. Foram desenvolvidos dois mapas de ligação conjuntos para as populações dos cruzamentos contrastantes entre os acessos selecionados como mais resistentes a C. perniciosa e o genitor suscetível ‘ICS 39’. Nas construções dos mapas de ligação foram utilizados 65 locos de microssatélites. Para a família derivada do cruzamento de ‘ICS 39 x CAB 0208’ foram formados 11 grupos de ligação com cobertura total de 541 cM e distância média entre marcas de 14 cM. O mapa de ligação ‘ICS 39 x CAB 0214’ apresentou cobertura total de 501 cM nos 10 grupos de ligação formados com distância média entre marcas de 11,4 cM. Dectataramse três QTLs associados à resistência a C. perniciosa, um no grupo de ligação VIII de ‘ICS 39 x CAB 0208’ e dois no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’, sendo um no grupo de ligação IV e outro no grupo IX. A relação genética entre os dois clones ‘CAB’ genitores das populações contrastantes e 81 genótipos de cacaueiro utilizados como fontes de resistência a C. perniciosa foram baseadas nas freqüências alélicas de 20 locos de microssatélites. As análises de dissimilaridade genética entre os acessos de cacaueiro originaram dois grupos. Os ‘CAB 0208’ e ‘CAB 0214’ não fizeram parte dos grupos formados. O grau de parentesco entre estes dois acessos foi muito alto, chegando próximo ao de irmãos-germano, não sendo aparentados com nenhum dos outros acessos. Os clones selecionados por agricultores derivam na sua maioria de ‘Scavina 6’, a fonte de resistência comumente empregada. / The witches’ broom (Crinipellis perniciosa) is the most important disease of cacao in Brazil. The main method of disease control is the use of resistant cultivars, however due to the narrow genetic basis found in commercial cacao growing areas, the resistance is frequently broken. The objectives of this work were: to select new sources of resistance to C. perniciosa among cacao accessions originally collected in the Brazilian Amazon (CAB series); to identify by genetic mapping, quantitative trait loci (QTLs) associated with resistance in selected genotypes; and to evaluate the genetic relationship between the selected accessions and clones selected by cacao growers from Southern Bahia with traditional resistance sources against C. perniciosa. Based on the proportion of witches’ broom infection, the levels of resistance to C. perniciosa were estimated in 44 cacao families under greenhouse and field conditions. Under greenhouse conditions, the average proportion of infection was compared based on Wald test, and under field conditions using an analysis of repeated measures and contrast. Among the families evaluated under greenhouse and field conditions, the ones with least incidence of witches’ broom symptoms derived from ‘CAB 0169’, ‘CAB 0208’, ‘CAB 0214’, ‘CAB 0270’, ‘CAB 0371’, ‘CAB 0388’, ‘CAB 0392’ and ‘CAB 0410’. Two linkage maps were developed for populations derived from crosses between contrasting accessions selected as the most resistant to C. perniciosa (‘CAB 0208’ and ‘CAB 0214’) and a susceptible accession ‘ICS 39’. The linkage maps were developed using 65 microsatellite loci, applying the software JoinMap 3.0®. The identification and localization of QTLs associated with resistance to C. perniciosa were performed using MAPQTLTM 4.0. For the family derived from ‘ICS 39 x CAB 0208’, 11 linkage groups were formed, with total coverage of 541 cM and 14 cM average distance between markers. The linkage map from ‘ICS 39 x CAB 0214’ presented a total coverage of 501 cM in 10 linkage groups formed with an average distance between markers of 11.4 cM. Three QTLs associadted with resistance to C. perniciosa were detected, with one at linkage group VIII of ‘ICS 39 x CAB 0208’, and two for the ‘ICS 39 x CAB 0214’ family, with one located at linkage group IV and another at group IX. The genetic relationship between these two CAB accessions and 81 genotypes used as source of resistance to C. perniciosa were determined using genetic dissimilarity and co-ancestry based on allele frequencies of 20 microsatellite loci. The dissimilarity analyses among the accessions generated two distinct groups. ‘CAB 0208’ and ‘CAB 0214’ did not belong to any of the two groups. The co-ancestry between the two accesions were high, close to full-sib, but without any relationship with any of the other genotypes. The clones selected by growers derived mostly from ‘Scavina 6’, a commonly used source of resistance to C. perniciosa.