Orientador: Fernandes Denardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T05:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esteves_SandroCassiano_M.pdf: 4359044 bytes, checksum: ef86ac776f66f2a4dfc46a48740ef92b (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Apesar do aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação, o potencial fértil do sêmen humano criopreservado ainda é insatisfatório. Por outro lado, o processamento do sêmen constitui etapa fundamental nas técnicas de reprodução assistida. A técnica de "swim-up" é o método mais freqüentemente utilizado para o processamento do sêmen humano, pois permite a seleção de um grande número de espermatozóides móveis. O objetivo do presente estudo foi avaliar se a seleção de espermatozóides humanos pela técnica de "swim-up", antes da criopreservação, é capaz de minimizar a perda de motilidade, vitalidade e integridade acrossômica, decorrentes do processo de congelamento-descongelamento. Visa-se, dessa forma, propiciar, após o descongelamento, a recuperação de espermatozóides com potencial fértil superior àqueles não-selecionados. Amostras de sêmen de 15 indivíduos com fertilidade comprovada foram obtidas por masturbação, após 2 a 3 dias de abstinência sexual, e divididas em duas alíquotas de volumes iguais. A primeira delas não recebeu qualquer tratamento (não¬selecionada), enquanto que a segunda foi processada pela técnica de "swim-up" (selecionada). Ambas as alíquotas foram, então, criopreservadas através da técnica de vapor de nitrogênio líquido. A motilidade percentual, e os parâmetros da motilidade espermática foram avaliados por um analisador computadorizado. A integridade acrossômica foi analisada pela técnica de fluorescência, empregando-se a lecitina do amendoim (FITC-PNA), em associação com o corte supravital bis-benzimida (Hoescht¬33258), para avaliação da vitalidade espermática. Cada alíquota foi avaliada quanto à motilidade percentual, parâmetros da motilidade espermática, vitalidade e integridade acrossômica, antes e depois da criopreservação. O teste "t" de Student para amostras pareadas, com nível de significância de 0,05, foi utilizado para determinar diferenças estatísticas na motilidade espermática, vitalidade e integridade acrossômica, bem como para avaliar as diferenças pecentuais destes parâmetros de antes para depois da criopreservação. Os espermatozóides selecionados pela técnica de "swim-up" apresentaram, antes da criopreservação, valores médios de vitalidade, motilidade percentual e parâmetros da motilidade espermática, com exceção da linearidade, significativamente superiores aos dos espermatozóides não-selecionados. Entretanto, não houve diferença estatística no percentual de espermatozóides com acrossomos intactos entre as amostras não-selecionadas e selecionadas. Após a criopreservação, observou-se, em ambas as amostras, queda significativa da motilidade percentual, parâmetros da motilidade espermática, vitalidade e integridade acrossômica. Contudo, não houve diferença estatística na variação percentual da motilidade e vitalidade espermática, de antes para depois da criopreservação, entre as amostras não-selecionadas e selecionadas pela técnica de "swim-up". Em contrapartida, a integridade acrossômica dos espermatozóides criopreservados foi significativamente superior nas amostras selecionadas por esta técnica. Além disso, a queda percentual da integridade acrossômica, depois da criopreservação, foi significativamente menor nas amostras selecionadas pela técnica de "swim-up". Embora a técnica de "swim-up" tenha selecionado a subpopulação de espermatozóides qualitativamente superior, antes da criopreservação, tal tratamento não foi eficaz para minimizar a perda de motilidade e vitalidade, decorrentes do processo de criopreservação. Entretanto, o processamento do sêmen pela técnica de "swim-up", anteriormente à criopreservação, permitiu a recuperação de um percentual maior de espermatozóides com acrossomos intactos, reduzindo a perda de integridade acrossômica, causada pelo processo de criopreservação. Portanto, a seleção de espermatozóides pela técnica de "swim-up", previamente à criopreservação, é benéfica para aumentar o potencial fértil dos espermatozóides criopreservados / Abstract: Despite of the developments in freezing techniques, the fertilizing potential of human spermatozoa after thawing remains poor. Sperm processing, on the other hand, is a fundamental step in assisted reproductive techniques. Swim-up is the most frequent used procedure for processing of human spermatozoa, as it selects a high number of motile spermatozoa. The aim of this study was to evaluate whether sperm selection by the swim¬up technique before freezing can minimize loss of motility, viability and acrosome integrity due to the freezing-thaw process, thus yielding post-thaw recovery of spermatozoa with higher fertilizing potential than unprocessed ones. Semen specimens from 15 healthy individuaIs with proven fertility were obtained by masturbation after 2 to 3 days of abstinence, and divided into two equal aliquots. The first aliquot received no treatment (unprocessed) and the second was processed by the swim-up technique (processed). Both aliquots were then cryopreserved by the liquid nitrogen vapor method. Percent motility and sperm motion characteristics in unprocessed and processed specimens were analyzed by computer-assisted semen analysis. Sperm viability was evaluated by a supra-vital dye bis-benzimide (Hoescht-33258). The acrosome integrity were assessed by fluorescein iso-thiocyanate conjugated peanut lectin (FITC-PNA). Each aliquot was evaluated for percent motility, motion characteristics, sperm viability and acrosome integrity either before freezing and afieI' thawing. The paired Student's "t" test was used to test for statistical differences in sperm motility, viability and acrosome integrity either before freezing and after thawing, as well as for percent change' on these parameters due to the cryopreservation processo A alpha leveI of 0.05 was considered significant. Compared with the unprocessed samples, the spermatozoa selected by the swim-up technique exhibited better percent motility, viability and all motion parameters, except linearity, before freezing. However, the frequency of spermatozoa exhibiting intact acrosomes was not different between unprocessed and swim-up specimens. After thawing, a significant impairment was observed in percent motility, motion characteristics, sperm viability and acrosome integrity in both unprocessed and swim-up specimens. Nevertheless, there was no difference in the percent change of sperm motility and viability from before freezing to after thawing between unprocessed and swim-up groups. However, acrosome integrity was significant1y higher in swim-up se1ected spermatozoa after thawing. In addition, the percent decrease in acrosome integrity from before freezing to after thawing was significant1y 10wer in swim-up se1ected specimens. Although sperm processing by the swim-up technique se1ected a better qua1ity sperm popu1ation before freezing, this treatment have not been ab1e to minimize the 10ss in moti1ity and viabi1ity due to the freeze-thaw processo However, pre-freeze se1ection of spermatozoa by the swim-up technique yie1ded a higher frequency of spermatozoa with intact acrosomes and reduced the 10ss in acrosome integrity due to the cryopreservation processo Therefore, pre-freeze sperm se1ection by swim-up may increase the ferti1izing potentia1 of spermatozoa after cryopreservation / Mestrado / Cirurgia / Mestre em Cirurgia

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:40:28Z : No. of bitstreams: 1 paes_mcf_dr_jabo.pdf: 652606 bytes, checksum: 36fc9416b423c16aa4b65e4486ef48e2 (MD5) / O gênero Brycon tem despertado grande interesse nas instituições de pesquisa, não só pela excelente qualidade e sabor da carne, mas também por características adequadas à pesca esportiva, rápido crescimento e ganho de peso. A piracanjuba tem sofrido drástica redução dos estoques em decorrência da ação antrópica estando na lista do IBAMA de espécies ameaçadas de extinção. A criopreservação de gametas e embriões de espécies migradoras e espécies raras surge como uma alternativa para a reprodução, repovoamento, criação de banco genético, transporte e possível obtenção de larvas ao longo do ano. Assim, este trabalho teve por objetivo ampliar os conhecimentos de criogenia utilizando embriões de piracanjuba (Brycon orbignyanus), com o intuito de estabelecer um protocolo de resfriamento para ser utilizado em projetos de reprodução e conservação desta espécie. Após a obtenção dos embriões por meio de reprodução induzida, estes, quando na fase de fechamento do blastóporo, foram contados e subdivididos em parcelas, considerando como unidade experimental um tubo (vacutainer) contendo 100 embriões. Cada tratamento teve oito repetições. Com exceção dos grupos controles, os demais tratamentos foram submetidos a diferentes combinações e concentrações de crioprotetores (sacarose, metanol, etilenoglicol e DMSO), diferentes temperaturas (0,0±2,0°C e 8,0±2,0ºC) e tempos de estocagem em refrigerador (6h, 10h, 24h, 72h, 168h). Transcorridos os tempos de estocagem, os embriões foram aclimatados, rehidratados e transferidos para incubadoras para monitoramento do desenvolvimento e aferições das taxas de eclosão, sobrevivência e deformidade. Para avaliar o desenvolvimento de tecidos e células após a realização do experimento, amostras foram fixadas, observadas em estereomicroscópio e... / The genus Brycon have aroused great interest of research institutions, not only for the excellent quality and flavor of the meat, but also for characteristics suited to sport fishing, quick growth and weight gain. Piracanjuba suffers drastic reduction in natural environment as a result of human action and is in the list of endangered species of IBAMA. The cryopreservation of gametes and embryos of migratory and rare species is an alternative to reproduction, repopulation, creating genetic database, transport of larvae and obtainment of larvae throughout the year. The aim of this study is expand the knowledge of cryogenics using embryos of piracanjuba (Brycon orbignyanus) and establishing a cooling protocol to be used in projects of reproduction and conservation of this species. After obtaining embryos from induced reproduction, those ones that were in this phase of blastopore closuring, were colected, counted and divided into groups, considering as experimental unit each tube (vacutainer) containing 100 embryos. Each treatment had eight replications. Except for the control groups, the other treatments were subjected to different combinations and concentrations of cryoprotectants (sucrose, methanol, ethylene glycol and DMSO), different temperatures (0,0 ± 2,0ºC and 8,0 ± 2,0°C) and storage time on refrigerator (6h, 10h, 24h, 72h, 168h). Elapsed times of storage, the embryos were acclimated, washed and transferred to incubators for monitoring the development of measurements and hatching rates, survival and deformity. To evaluate the development of tissues and structures after the experiment, samples were put on fixative solution and observed under stereomicroscope, and after that were processed and analyzed by light microscopy and transmission electron microscopy. It was observed that... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Banca: Lilian Cristina Makino / Banca: Sérgio Fonseca Zaiden / Banca: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: Darci Carlos Fornari / Resumo: O gênero Brycon tem despertado grande interesse nas instituições de pesquisa, não só pela excelente qualidade e sabor da carne, mas também por características adequadas à pesca esportiva, rápido crescimento e ganho de peso. A piracanjuba tem sofrido drástica redução dos estoques em decorrência da ação antrópica estando na lista do IBAMA de espécies ameaçadas de extinção. A criopreservação de gametas e embriões de espécies migradoras e espécies raras surge como uma alternativa para a reprodução, repovoamento, criação de banco genético, transporte e possível obtenção de larvas ao longo do ano. Assim, este trabalho teve por objetivo ampliar os conhecimentos de criogenia utilizando embriões de piracanjuba (Brycon orbignyanus), com o intuito de estabelecer um protocolo de resfriamento para ser utilizado em projetos de reprodução e conservação desta espécie. Após a obtenção dos embriões por meio de reprodução induzida, estes, quando na fase de fechamento do blastóporo, foram contados e subdivididos em parcelas, considerando como unidade experimental um tubo (vacutainer) contendo 100 embriões. Cada tratamento teve oito repetições. Com exceção dos grupos controles, os demais tratamentos foram submetidos a diferentes combinações e concentrações de crioprotetores (sacarose, metanol, etilenoglicol e DMSO), diferentes temperaturas (0,0±2,0°C e 8,0±2,0ºC) e tempos de estocagem em refrigerador (6h, 10h, 24h, 72h, 168h). Transcorridos os tempos de estocagem, os embriões foram aclimatados, rehidratados e transferidos para incubadoras para monitoramento do desenvolvimento e aferições das taxas de eclosão, sobrevivência e deformidade. Para avaliar o desenvolvimento de tecidos e células após a realização do experimento, amostras foram fixadas, observadas em estereomicroscópio e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Brycon have aroused great interest of research institutions, not only for the excellent quality and flavor of the meat, but also for characteristics suited to sport fishing, quick growth and weight gain. Piracanjuba suffers drastic reduction in natural environment as a result of human action and is in the list of endangered species of IBAMA. The cryopreservation of gametes and embryos of migratory and rare species is an alternative to reproduction, repopulation, creating genetic database, transport of larvae and obtainment of larvae throughout the year. The aim of this study is expand the knowledge of cryogenics using embryos of piracanjuba (Brycon orbignyanus) and establishing a cooling protocol to be used in projects of reproduction and conservation of this species. After obtaining embryos from induced reproduction, those ones that were in this phase of blastopore closuring, were colected, counted and divided into groups, considering as experimental unit each tube (vacutainer) containing 100 embryos. Each treatment had eight replications. Except for the control groups, the other treatments were subjected to different combinations and concentrations of cryoprotectants (sucrose, methanol, ethylene glycol and DMSO), different temperatures (0,0 ± 2,0ºC and 8,0 ± 2,0°C) and storage time on refrigerator (6h, 10h, 24h, 72h, 168h). Elapsed times of storage, the embryos were acclimated, washed and transferred to incubators for monitoring the development of measurements and hatching rates, survival and deformity. To evaluate the development of tissues and structures after the experiment, samples were put on fixative solution and observed under stereomicroscope, and after that were processed and analyzed by light microscopy and transmission electron microscopy. It was observed that... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:34Z : No. of bitstreams: 1 000843878_20151231.pdf: 905384 bytes, checksum: 9b6eaf7fcedae316cec999a302400d52 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:30Z: 000843878_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:26Z : No. of bitstreams: 1 000843878.pdf: 3505593 bytes, checksum: 74afed02afd55eb520396764b8c59504 (MD5) / A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ...

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: Cristiele da Silva Ribeiro / Banca: George Shigueki Yasui / Resumo: A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos... / Abstract: The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringer's lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes ... / Mestre