Submitted by Maria Rosa Moraes Maximiano (maria.maximiano@uffs.edu.br) on 2017-06-27T15:11:17Z No. of bitstreams: 1 SCOLARI.pdf: 2707592 bytes, checksum: d3d091bc0a6de5629a6c6feebf0555e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Diego dos Santos Borba (dborba@uffs.edu.br) on 2017-06-27T16:41:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 SCOLARI.pdf: 2707592 bytes, checksum: d3d091bc0a6de5629a6c6feebf0555e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T16:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SCOLARI.pdf: 2707592 bytes, checksum: d3d091bc0a6de5629a6c6feebf0555e2 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / A Araucaria angustifolia (Bertol.) O. Kuntze é uma das espécies nativas da região Sul do Brasil de maior importância econômica e ecológica. Nas últimas décadas devido aos grandes desmatamentos ocorridos para comercialização da madeira e para expansão da área agrícola, esta espécie entrou para a lista daquelas ameaçadas de extinção. Uma das maneiras de se preservar a A. angustifolia é a conservação da semente pois é a principal forma de propagação da espécie. No entanto, as sementes de A. angustifolia apresentam comportamento recalcitrante, o que dificulta a sua conservação por longos períodos, em virtude de não tolerarem a dessecação e temperaturas baixas. Por este motivo é necessário pesquisar outras alternativas para a conservação de sementes de A. angustifolia e uma das técnicas que merecem destaque é a criopreservação, que consiste em armazenar o material vegetal em nitrogênio líquido a -196°C. Entretanto, para se obter sucesso com esta técnica há uma série de condições que devem ser satisfeitas, como a redução da umidade das sementes e a formação de um estado vítreo que minimize a possibilidade de formação de cristais de gelo na célula. Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi estabelecer um protocolo de criopreservação para sementes de A. angustifolia, visando a manutenção de sua qualidade fisiológica por longos períodos de tempo. A pesquisa foi dividida em oito experimentos, onde se testou diferentes formas e períodos de desidratação, diferentes soluções para a crioproteção e distintas formas de congelamento das sementes. Os experimentos foram realizados em delineamento inteiramente casualizado. Para avaliação da qualidade fisiológica das sementes foram realizados os testes de tetrazólio, emergência de plântulas, índice de velocidade de protrusão radicular (IVP) e determinação do grau de umidade. Pelos resultados foi possível concluir que: houve redução progressiva do grau de umidade e da viabilidade das sementes de A. angustifolia com o aumento do período de imersão em solução de PVS2. A desidratação em sílica gel por 120 horas reduziu a viabilidade das sementes, porém o crioprotetor, glicose (60%) + glicerol (15%), quando utilizado por 72 horas, não prejudicou a qualidade fisiológica das sementes. A criopreservação em nitrogênio líquido e o congelamento em ultrafreezer independentemente do pré-tratamento utilizado foram letais as sementes de A. angustifolia. A aclimatação das sementes de A. angustifolia por 24 horas em solução de 3 molar (M) de sacarose mais 12 horas em solução com 2M de glicose + 0,4M de sacarose previamente a imersão em PVS2 por 24 horas reduziu a viabilidade e o vigor. O congelamento das sementes de A. angustifolia, crioprotegidas com glicose (60%) + glicerol (15%), a -5℃ e -18°C por 7 dias foi letal. A aclimatação das sementes de A. angustifolia por 15 horas em solução de 0,3M de sacarose, mais 8 horas em solução com 2M de glicose + 0,4M de sacarose previamente a imersão de 12 horas em PVS2 reduziu a viabilidade e o vigor. O congelamento das sementes de A. angustifolia, aclimatadas e crioprotegidas com PVS2, a -5℃ e -18°C por 7 dias foi letal. Com essa sequência de experimentos não foi possível estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação para as sementes de A. angustifolia. / Araucaria angustifolia (Bertol.) O. Kuntze is one of the native species from southern Brazil with economic and ecological importance. In recent decades, due to deforestation for timber marketing and expansion of agriculture, this species joined the list of those threatened with extinction. One of the ways to preserve A. angustifolia is per seed conservation, as it is the main process for the species propagation. However, the seeds of A. angustifolia endue recalcitrant behavior, not tolerating desiccation and low temperatures for long time. For this reason, it is necessary to look at alternatives for the conservation of the A. angustifolia seeds. One of the techniques that might be useful is cryopreservation, which consists in storing the propagules in liquid nitrogen at -196°C. However, several conditions must be met to achieve success, such as reducing the moisture of the seed to assure the formation of a vitreous state that minimizes the possibility of the generation of ice crystals in the seed cells. Due to this obstacle, the objective of this work was to establish a protocol for cryopreservation of A. angustifolia seeds, targeting for the maintenance of the physiological quality for prolonged periods. The research was divided into eight experiments, where forms and periods of dehydration, solutions for cryoprotection and forms of freezing of the seeds were tested. The experiments were arranged in a completely randomized design. Tetrazolium tests were performed to evaluate the physiological quality of the seeds, in addition of measuring the variables seedling emergence, root protrusion and the seed moisture content. The results lead to the following conclusions: there was a progressive reduction of seed moisture content and viability with increasing period of immersion in PVS2 solution. Dehydration in silica gel for 120 hours reduced seed viability, but when glucose (60%) + glycerol (15%) was used for 72 hours, the physiological quality of seeds was maintained. The cryopreservation in liquid nitrogen or ultrafreezer, regardless of pre-treatment used, was lethal to seeds. The acclimatization of the seeds of A. angustifolia for 24 hours in a 3 molar (M) sucrose solution plus 12 hours in solution with 2M glucose + 0.4M sucrose prior to immersion in PVS2 for 24 hours, reduced viability and seed vigour. The freezing of A. angustifolia seeds, using cryoprotectants with glucose (60%) + glycerol (15%), at -5℃ and -18°C for 7 days, were lethal. The acclimatization of the seeds for 15 hours in a 0.3M solution of sucrose plus 8 hours in a 2M glucose + 0, 4M sucrose solution prior to immersion of 12 hours in PVS2 reduced seed viability and vigour. Freezing of acclimated seeds cryoprotected with PVS2, at -5℃ and -18°C for 7 days, was lethal. The results of these experiments not allowed to establish an efficient protocol for cryopreservation of A. angustifolia seeds.

Os limites geográficos que marcam o risco de congelamento são determinantes na biodiversidade de anfíbios. Os mecanismos fisiológicos envolvidos na preparação e reação aos eventos de temperatura extrema são específicos e dependem da previsibilidade e repetitividade destes eventos. Na América do Sul, existem regiões com risco de congelamento para os anfíbios, contudo pouco se conhece da tolerância ao congelamento em espécies endêmicas deste continente. O doutorado foi elaborado em locais com reportes de congelamento na Argentina e o Brasil, usando como modelo as espécies Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei e S. hayii, avaliando exposição potencial ao congelamento em refúgios termais, sobrevivência a temperatura congelante, mudanças em moléculas com função crioprotetora (colesterol, glicose, proteínas, triglicérides, ureia) e crescimento de gelo corporal. Dentro deste contexto, a minha hipótese geral foi que existem anfíbios que sobrevivem ao congelamento na América do sul e que estas espécies presentam mecanismos de resposta fisiológica que deveriam variar entre espécies em um evento de congelamento controlado. No decorrer do doutorado esta hipótese foi corroborada, encontrando sobrevivência a temperatura congelantes nas especies A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, sendo que existe uma amplia variedade de estratégias fisiológicas para fazer frente ás baixas temperaturas. Entre as espécies anteriormente reportadas, definiu-se que D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, são tolerantes ao congelamento devido a que apresentarem tanto acumulo de crioprotectores como crescimento de gelo corporal durante a exposição a baixas temperaturas. Por outro lado usando analises filogenéticos, conseguiu-se reforçar a hipóteses que a tolerância ao congelamento é convergente ao longo da historia evolutiva dos anfíbios, acontecendo independentemente em vários clados. As novas descobertas sobre a riqueza fisiologia no nível de adaptações frente ao congelamento em América do Sul são apenas pequenas amostras do que potencialmente pode ser achada pensando na biodiversidade existente neste continente, logo a presente tese, é só um incentivo para futuros trabalho na área / The geographical boundaries that mark the risk of freezing are determinants for amphibian biodiversity. The physiological mechanisms involved in the preparation and reaction to extreme temperature events are specific and depend on the predictability and repeatability of these events. In South America, there are regions with freezing risk for amphibians, however little is known about the freezing tolerance in endemic species to this continent. The present doctoral dissertation was prepared in places with freezing reports in Argentina and Brazil, using as biological models the species Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei and S. hayii, evaluating potential exposure to freezing in thermal refuges, survival to freezing temperature, changes in cryoprotectant molecules (cholesterol, glucose, proteins, triglycerides, urea) and body ice growth. Within this context, my general hypothesis was that there are amphibians that survive freezing in South America and that these species present physiological mechanisms that should vary among species in a controlled freezing event. In the course of my doctorate, this hypothesis was confirmed, finding survival to freezing temperature in the species A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei and S. hayii, being a wide variety of physiological strategies to protect the animals to the low temperatures. Among the previously reported species, D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei, S. hayii, were defined as freezing tolerant because they exhibit both accumulation of cryoprotectants and body ice growth during freeze exposure. On the other hand using phylogenetic analyzes, it was possible to reinforce the hypotheses that the freezing tolerance strategy is convergent throughout the evolutionary history of the amphibians, happening independently in several clades. The new findings about physiological richness at the level of adaptations to freezing in South America are only small samples of what can be found within the biodiversity existing on this continent, so the present thesis is only an incentive for future work in the area

Os limites geográficos que marcam o risco de congelamento são determinantes na biodiversidade de anfíbios. Os mecanismos fisiológicos envolvidos na preparação e reação aos eventos de temperatura extrema são específicos e dependem da previsibilidade e repetitividade destes eventos. Na América do Sul, existem regiões com risco de congelamento para os anfíbios, contudo pouco se conhece da tolerância ao congelamento em espécies endêmicas deste continente. O doutorado foi elaborado em locais com reportes de congelamento na Argentina e o Brasil, usando como modelo as espécies Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei e S. hayii, avaliando exposição potencial ao congelamento em refúgios termais, sobrevivência a temperatura congelante, mudanças em moléculas com função crioprotetora (colesterol, glicose, proteínas, triglicérides, ureia) e crescimento de gelo corporal. Dentro deste contexto, a minha hipótese geral foi que existem anfíbios que sobrevivem ao congelamento na América do sul e que estas espécies presentam mecanismos de resposta fisiológica que deveriam variar entre espécies em um evento de congelamento controlado. No decorrer do doutorado esta hipótese foi corroborada, encontrando sobrevivência a temperatura congelantes nas especies A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, sendo que existe uma amplia variedade de estratégias fisiológicas para fazer frente ás baixas temperaturas. Entre as espécies anteriormente reportadas, definiu-se que D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, são tolerantes ao congelamento devido a que apresentarem tanto acumulo de crioprotectores como crescimento de gelo corporal durante a exposição a baixas temperaturas. Por outro lado usando analises filogenéticos, conseguiu-se reforçar a hipóteses que a tolerância ao congelamento é convergente ao longo da historia evolutiva dos anfíbios, acontecendo independentemente em vários clados. As novas descobertas sobre a riqueza fisiologia no nível de adaptações frente ao congelamento em América do Sul são apenas pequenas amostras do que potencialmente pode ser achada pensando na biodiversidade existente neste continente, logo a presente tese, é só um incentivo para futuros trabalho na área / The geographical boundaries that mark the risk of freezing are determinants for amphibian biodiversity. The physiological mechanisms involved in the preparation and reaction to extreme temperature events are specific and depend on the predictability and repeatability of these events. In South America, there are regions with freezing risk for amphibians, however little is known about the freezing tolerance in endemic species to this continent. The present doctoral dissertation was prepared in places with freezing reports in Argentina and Brazil, using as biological models the species Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei and S. hayii, evaluating potential exposure to freezing in thermal refuges, survival to freezing temperature, changes in cryoprotectant molecules (cholesterol, glucose, proteins, triglycerides, urea) and body ice growth. Within this context, my general hypothesis was that there are amphibians that survive freezing in South America and that these species present physiological mechanisms that should vary among species in a controlled freezing event. In the course of my doctorate, this hypothesis was confirmed, finding survival to freezing temperature in the species A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei and S. hayii, being a wide variety of physiological strategies to protect the animals to the low temperatures. Among the previously reported species, D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei, S. hayii, were defined as freezing tolerant because they exhibit both accumulation of cryoprotectants and body ice growth during freeze exposure. On the other hand using phylogenetic analyzes, it was possible to reinforce the hypotheses that the freezing tolerance strategy is convergent throughout the evolutionary history of the amphibians, happening independently in several clades. The new findings about physiological richness at the level of adaptations to freezing in South America are only small samples of what can be found within the biodiversity existing on this continent, so the present thesis is only an incentive for future work in the area

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gustavo_gastal.pdf: 739881 bytes, checksum: b574c63315d3936c87fcc0279216b06c (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / The xanthan gum can contribute to reduce the formation of ice crystals in the sperm freezing solution, facilitating the preservation of sperm viability after thawing. However, there is no information about the use of xanthan gum as an additive for cryoprotection of ram sperm. This study aimed to determine the effect of three different concentrations of xanthan (0.15%, 0.20% and 0.25%) on post-thawing ram sperm quality. In vitro tests, evaluating sperm motility and vigor, membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality were conducted before freezing and after thawing. Biochemical tests were performed to evaluate reactive oxygen species (ROS) and total antioxidant capacity (TOSC) by using a fluorometer and the fluorescent probe H2DCF-DA. The addition of xanthan did not benefit sperm membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality (p>0.05), but the post-thawing sperm motility was lower (p<0.05) in treatments with 0.20 and 0.25% xanthan (22.2% ± 4.1 and 20.8% ± 4.1, respectively) than in the control without xanthan (32.2% ± 4.1). On the other hand, xanthan showed antioxidant characteristics, since the concentration of ROS decreased with increasing xanthan production (p<0.05). Thus, xanthan showed extracellular antioxidant capacity, being efficient on reducting the ROS generated during the freezing process. / A goma xantana pode contribuir para reduzir a formação de cristais de gelo no meio usado para congelamento de sêmen, favorecendo a preservação da viabilidade espermática pós-descongelamento. Como não existem informações acerca do uso da goma xantana como aditivo crioprotetor para sêmen ovino, este trabalho objetivou determinar o efeito de três diferentes concentrações de xantana (0,15%, 0,20% e 0,25%) sobre a qualidade espermática pós-descongelamento. Testes in vitro de qualidade seminal, avaliando a motilidade e vigor, integridade de membrana e do acrossoma e a função mitocondrial foram realizados pré-congelamento e pós-descongelamento. Foram realizados testes bioquímicos para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade antioxidante total (TOSC) através da utilização de um fluorímetro e a sonda fluorescente H2DCF-DA. A adição de xantana não trouxe benefícios para a integridade da membrana e do acrossoma, nem para a funcionalidade mitocondrial (p>0.05), mas a motilidade espermática pós-descongelamento foi reduzida (p<0.05) nos tratamentos com 0,20 e 0,25% de xantana (22,2% ± 4,1 e 20,8% ± 4,1, respectivamente), em comparação com o controle sem inclusão de xantana (32,2% ± 4,1) (p<0.05). Por outro lado, a xantana mostrou características antioxidantes, pois a produção de EROs foi reduzida conforme aumentou a concentração da xantana (p<0.05). Assim, a xantana apresentou capacidade antioxidante extracelular, sendo eficiente na diminuição das espécies reativas de oxigênio geradas no processo de congelamento.