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Donor cells for nuclear transfer are usually prepared by the culture of fresh tissue. However, animal carcasses are sometimes frozen without cryoprotectants and if it were possible to obtain live cells from carcasses (tissue) preserved in this manner, it could be very beneficial in nuclear transfer cloning of trophy or extinct animals. This study tested the hypothesis that tissue samples of skin, muscle, and oral mucosa could be cryopreserved without cryoprotection. The tissue samples were taken from euthanized goats and placed into a -20°C freezer for varying lengths of time. The samples were thawed by two different methods. One method was in 37°C water bath and the other was on ice, thawing to room temperature from 1°C to 25°C. The samples were then processed and placed into an incubator to evaluate cell growth. Skin samples frozen for up to 34 days obtained cell growth to confluency and the cells were then cryopreserved with cryoprotectant. The cells were able to tolerate the potentially lethal effects of ice nucleation and dehydration brought about by ice formation and colligative factors. Although this method of cryopreservation has been shown to yield growth of cells that might be useful for nuclear transfer cloning, it is not the recommended method to cryopreserve tissues if cryoprotectants are available or if only short term storage is needed. These procedures would be especially useful when a precious animal dies unexpectedly and cryoprotectant is not available and the sample can not be processed before 10 days.

Os limites geográficos que marcam o risco de congelamento são determinantes na biodiversidade de anfíbios. Os mecanismos fisiológicos envolvidos na preparação e reação aos eventos de temperatura extrema são específicos e dependem da previsibilidade e repetitividade destes eventos. Na América do Sul, existem regiões com risco de congelamento para os anfíbios, contudo pouco se conhece da tolerância ao congelamento em espécies endêmicas deste continente. O doutorado foi elaborado em locais com reportes de congelamento na Argentina e o Brasil, usando como modelo as espécies Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei e S. hayii, avaliando exposição potencial ao congelamento em refúgios termais, sobrevivência a temperatura congelante, mudanças em moléculas com função crioprotetora (colesterol, glicose, proteínas, triglicérides, ureia) e crescimento de gelo corporal. Dentro deste contexto, a minha hipótese geral foi que existem anfíbios que sobrevivem ao congelamento na América do sul e que estas espécies presentam mecanismos de resposta fisiológica que deveriam variar entre espécies em um evento de congelamento controlado. No decorrer do doutorado esta hipótese foi corroborada, encontrando sobrevivência a temperatura congelantes nas especies A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, sendo que existe uma amplia variedade de estratégias fisiológicas para fazer frente ás baixas temperaturas. Entre as espécies anteriormente reportadas, definiu-se que D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, são tolerantes ao congelamento devido a que apresentarem tanto acumulo de crioprotectores como crescimento de gelo corporal durante a exposição a baixas temperaturas. Por outro lado usando analises filogenéticos, conseguiu-se reforçar a hipóteses que a tolerância ao congelamento é convergente ao longo da historia evolutiva dos anfíbios, acontecendo independentemente em vários clados. As novas descobertas sobre a riqueza fisiologia no nível de adaptações frente ao congelamento em América do Sul são apenas pequenas amostras do que potencialmente pode ser achada pensando na biodiversidade existente neste continente, logo a presente tese, é só um incentivo para futuros trabalho na área / The geographical boundaries that mark the risk of freezing are determinants for amphibian biodiversity. The physiological mechanisms involved in the preparation and reaction to extreme temperature events are specific and depend on the predictability and repeatability of these events. In South America, there are regions with freezing risk for amphibians, however little is known about the freezing tolerance in endemic species to this continent. The present doctoral dissertation was prepared in places with freezing reports in Argentina and Brazil, using as biological models the species Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei and S. hayii, evaluating potential exposure to freezing in thermal refuges, survival to freezing temperature, changes in cryoprotectant molecules (cholesterol, glucose, proteins, triglycerides, urea) and body ice growth. Within this context, my general hypothesis was that there are amphibians that survive freezing in South America and that these species present physiological mechanisms that should vary among species in a controlled freezing event. In the course of my doctorate, this hypothesis was confirmed, finding survival to freezing temperature in the species A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei and S. hayii, being a wide variety of physiological strategies to protect the animals to the low temperatures. Among the previously reported species, D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei, S. hayii, were defined as freezing tolerant because they exhibit both accumulation of cryoprotectants and body ice growth during freeze exposure. On the other hand using phylogenetic analyzes, it was possible to reinforce the hypotheses that the freezing tolerance strategy is convergent throughout the evolutionary history of the amphibians, happening independently in several clades. The new findings about physiological richness at the level of adaptations to freezing in South America are only small samples of what can be found within the biodiversity existing on this continent, so the present thesis is only an incentive for future work in the area

Os limites geográficos que marcam o risco de congelamento são determinantes na biodiversidade de anfíbios. Os mecanismos fisiológicos envolvidos na preparação e reação aos eventos de temperatura extrema são específicos e dependem da previsibilidade e repetitividade destes eventos. Na América do Sul, existem regiões com risco de congelamento para os anfíbios, contudo pouco se conhece da tolerância ao congelamento em espécies endêmicas deste continente. O doutorado foi elaborado em locais com reportes de congelamento na Argentina e o Brasil, usando como modelo as espécies Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei e S. hayii, avaliando exposição potencial ao congelamento em refúgios termais, sobrevivência a temperatura congelante, mudanças em moléculas com função crioprotetora (colesterol, glicose, proteínas, triglicérides, ureia) e crescimento de gelo corporal. Dentro deste contexto, a minha hipótese geral foi que existem anfíbios que sobrevivem ao congelamento na América do sul e que estas espécies presentam mecanismos de resposta fisiológica que deveriam variar entre espécies em um evento de congelamento controlado. No decorrer do doutorado esta hipótese foi corroborada, encontrando sobrevivência a temperatura congelantes nas especies A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, sendo que existe uma amplia variedade de estratégias fisiológicas para fazer frente ás baixas temperaturas. Entre as espécies anteriormente reportadas, definiu-se que D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei e S. hayii, são tolerantes ao congelamento devido a que apresentarem tanto acumulo de crioprotectores como crescimento de gelo corporal durante a exposição a baixas temperaturas. Por outro lado usando analises filogenéticos, conseguiu-se reforçar a hipóteses que a tolerância ao congelamento é convergente ao longo da historia evolutiva dos anfíbios, acontecendo independentemente em vários clados. As novas descobertas sobre a riqueza fisiologia no nível de adaptações frente ao congelamento em América do Sul são apenas pequenas amostras do que potencialmente pode ser achada pensando na biodiversidade existente neste continente, logo a presente tese, é só um incentivo para futuros trabalho na área / The geographical boundaries that mark the risk of freezing are determinants for amphibian biodiversity. The physiological mechanisms involved in the preparation and reaction to extreme temperature events are specific and depend on the predictability and repeatability of these events. In South America, there are regions with freezing risk for amphibians, however little is known about the freezing tolerance in endemic species to this continent. The present doctoral dissertation was prepared in places with freezing reports in Argentina and Brazil, using as biological models the species Alsodes gargola, Bokermanohyla gouveai, Dendrosophus minutus, D. microps, Hypsiboas latistriatus, H. polytaenius, Melanophryniscus moreirae, Pleurodema bufoninum, Ologygon brieni, Scinax duartei and S. hayii, evaluating potential exposure to freezing in thermal refuges, survival to freezing temperature, changes in cryoprotectant molecules (cholesterol, glucose, proteins, triglycerides, urea) and body ice growth. Within this context, my general hypothesis was that there are amphibians that survive freezing in South America and that these species present physiological mechanisms that should vary among species in a controlled freezing event. In the course of my doctorate, this hypothesis was confirmed, finding survival to freezing temperature in the species A. gargola, B. gouveai, D. microps, H. latistriatus, H. polytaenius, M. moreirae, P. bufoninum, S. duartei and S. hayii, being a wide variety of physiological strategies to protect the animals to the low temperatures. Among the previously reported species, D. microps, H. polytaenius, P. bufoninum, S. duartei, S. hayii, were defined as freezing tolerant because they exhibit both accumulation of cryoprotectants and body ice growth during freeze exposure. On the other hand using phylogenetic analyzes, it was possible to reinforce the hypotheses that the freezing tolerance strategy is convergent throughout the evolutionary history of the amphibians, happening independently in several clades. The new findings about physiological richness at the level of adaptations to freezing in South America are only small samples of what can be found within the biodiversity existing on this continent, so the present thesis is only an incentive for future work in the area

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Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gustavo_gastal.pdf: 739881 bytes, checksum: b574c63315d3936c87fcc0279216b06c (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / The xanthan gum can contribute to reduce the formation of ice crystals in the sperm freezing solution, facilitating the preservation of sperm viability after thawing. However, there is no information about the use of xanthan gum as an additive for cryoprotection of ram sperm. This study aimed to determine the effect of three different concentrations of xanthan (0.15%, 0.20% and 0.25%) on post-thawing ram sperm quality. In vitro tests, evaluating sperm motility and vigor, membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality were conducted before freezing and after thawing. Biochemical tests were performed to evaluate reactive oxygen species (ROS) and total antioxidant capacity (TOSC) by using a fluorometer and the fluorescent probe H2DCF-DA. The addition of xanthan did not benefit sperm membrane and acrossome integrity and mitochondrial functionality (p>0.05), but the post-thawing sperm motility was lower (p<0.05) in treatments with 0.20 and 0.25% xanthan (22.2% ± 4.1 and 20.8% ± 4.1, respectively) than in the control without xanthan (32.2% ± 4.1). On the other hand, xanthan showed antioxidant characteristics, since the concentration of ROS decreased with increasing xanthan production (p<0.05). Thus, xanthan showed extracellular antioxidant capacity, being efficient on reducting the ROS generated during the freezing process. / A goma xantana pode contribuir para reduzir a formação de cristais de gelo no meio usado para congelamento de sêmen, favorecendo a preservação da viabilidade espermática pós-descongelamento. Como não existem informações acerca do uso da goma xantana como aditivo crioprotetor para sêmen ovino, este trabalho objetivou determinar o efeito de três diferentes concentrações de xantana (0,15%, 0,20% e 0,25%) sobre a qualidade espermática pós-descongelamento. Testes in vitro de qualidade seminal, avaliando a motilidade e vigor, integridade de membrana e do acrossoma e a função mitocondrial foram realizados pré-congelamento e pós-descongelamento. Foram realizados testes bioquímicos para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e capacidade antioxidante total (TOSC) através da utilização de um fluorímetro e a sonda fluorescente H2DCF-DA. A adição de xantana não trouxe benefícios para a integridade da membrana e do acrossoma, nem para a funcionalidade mitocondrial (p>0.05), mas a motilidade espermática pós-descongelamento foi reduzida (p<0.05) nos tratamentos com 0,20 e 0,25% de xantana (22,2% ± 4,1 e 20,8% ± 4,1, respectivamente), em comparação com o controle sem inclusão de xantana (32,2% ± 4,1) (p<0.05). Por outro lado, a xantana mostrou características antioxidantes, pois a produção de EROs foi reduzida conforme aumentou a concentração da xantana (p<0.05). Assim, a xantana apresentou capacidade antioxidante extracelular, sendo eficiente na diminuição das espécies reativas de oxigênio geradas no processo de congelamento.