Orientador:Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T05:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_D.pdf: 15606775 bytes, checksum: 3232092d1eced36a575f660d994b44a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e função / Abstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:19:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_M.pdf: 1233125 bytes, checksum: 85502fc7f4b2dd6cdb2a6fc0c220c5b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As serpentes do gênero Crotalus incluem várias espécies amplamente distribuídas nocontinente Americano. Os venenos crotálicos das serpentes encontradas no Brasil apresentam características próprias. Entre os componentes bioativos, as fosfolipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) destacam-se por ser a principal componente, tais enzimas são dependentes de cálcio e hidrolisam a ligação sn-2 éster dos fosfolipídios e alem disso induz uma variedade de efeitos. Nesta tese, primeiramente nos desenvolvemos um novo protocolo de purificação com uma coluna C18 µ-Bondapack em HPLC de fase reversa destas toxinas, Os perfis obtidos mostraram que o veneno total da espécie Crotalus durissus cumanensis foi fracionado em quatorze picos, onde as frações 9 e 10 apresentam atividade PLA2. Do veneno de Crotalus durissus ruruima foram obtidos dezoito picos, sendo que as frações 12 e 13 apresentaram atividade PLA2 também. Assim, neste trabalho, nos apresentamos o isolamento, purificação determinação de sua estrutura primaria de duas isoformas fosfolipase A2 para cada espécie crotálica: Crotalus durissus cumanensis e Crotalus durissus ruruima denominados como Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13, respectivamente. Todas elas são formadas por 122 resíduos de aminoácidos. O alinhamento dos aminoácidos, das isoformas Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13 mostram um alto nível 93.4 % de homologia seqüencial para as duas primeiras e 92.6% para as outras, observaram-se com respeito a distintas PLA2 que diminuíram para cerca de 50 % de homologia. Todas elas foram identificadas como miotoxinas e apresentaram atividade fosfolipásica. Foi possível realizar, a partir das isoformas nativas um processo de modificação química, utilizando-se reagentes seletivos para amino ácidos específicos (His, Tyr e Lys) os quais estão envolvidos na rede catalítica ou na interação com sua interface, logo após, foram analisadas quanto a suas características físico-químicas e biológicas. Nossos estudos de miotoxicidade local e sistêmica de todas as isoformas nativas e modificadas dos venenos crotálicos in vivo, evidenciaram o incremento nos níveis de creatina cinase (CK) séricos e nas isoformas modificadas foram inibidas na sua atividade catalítica ou devido às mudanças estruturais que afetam outras regiões alem do sitio catalítico, revelando a importância de conhecer a relação estrutura-função. Em contraste, o efeito indutor de edema, não pode ser rapidamente correlacionado com suas diferenças estruturais. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar nosso conhecimento da relação dos sítios farmacológicos alem da região catalítica nas fosfolipases A2 / Abstract: The serpents of the genus Crotalus include several species widely distributed in the American continent. The poisons crotálicos of the serpents found in Brazil, they present own characteristics. Among the components bioativos, the phospholipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) standing out to be the main component, such enzymes are dependents of calcium and hidrolise the bond sn-2 éster of the fosfolipídios and besides that induced a variety of effects. In this thesis, firstly we develop a new purification protocol with a column C18 µ- Bondapack in HPLC of reverse phase of these toxins, The obtained profiles showed that the total poison of the species Crotalus durissus cumanensis was fractioned in fourteen picks, where the fractions 9 and 10 present activity PLA2. Of the poison of Crotalus durissus ruruima they were obtained eighteen picks, and the fractions 12 and 13 also presented activity PLA2. This way, in this work, we present the isolation, purification, determination of his primary structure of two isoforms fosfolipase A2 for each species crotálics: Crotalus durissus cumanensis and Crotalus durissus ruruima denominated like Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13, respectively. All of them are formed by 122 residues of amino acids. The alignment of amino acids of the isoforms Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13 it shows a high level of sequential homology 93.4% for the first two and 92.6% for the other ones, they were observed with regard to different PLA2 that decreased for about 50% of homology. All of them were identified as miotoxins and they presented phospholipasic activity. it was possible to carry out starting from the native isoforms a process of chemical modification, being used selective reagents for amino specific acids (His, Tyr and Lys) which are involved in the catalytic net or in the interaction with his interface, soon after, they were analyzed as for their physio-chemical and biological characteristics. Our studies of local and systemic miotoxicity of all the native and modified isoforms in vivo of the poisons crotálicos, evidenced the increment in the levels of creatine kinase (CK) séricos and in the modified isoformas they were inhibited in his activity catalytic or due the structural changes that they affect other regions besides the catalytic place, revealing the importance of knowing the relationship structure-function. In contrast, the effect producing edema, it cannot be correlated quickly with their structural differences. The results presented in this work provide the obtaining of an useful biochemical tool to increase our knowledge of the relationship of the pharmacological sites also of the catalytic region in the phopholipases A2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DizFilho_EduardoBrittodosSantos_M.pdf: 1713352 bytes, checksum: 603465fac59506eae00eb719cec694e7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Na região norte do Brasil a serpente Crotalus durissus ruruima (C.d.r) é responsável por diversos casos de acidentes ofídicos, e é principalmente encontrada próxima à fronteira com a Venezuela e Colômbia. Contudo a Crotalus durissus cumanensis (C.d.c). é outra serpente bastante comum no sul da Venezuela próximo a fronteira com o Brasil. Ambas as serpentes são encontradas na região equatorial da América do Sul e ambos os venenos mostraram diferenças significativas em suas composições, se comparadas com a Crotalus durissus terrificus (C.d.t.). A crotoxina é a principal toxina, e responsável pelos principais efeitos toxicológicos do veneno de C.d.t. O objetivo principal desta dissertação foi o de isolar e caracterizar isoformas de PLA2s isoladas de ambos os venenos e caracterizar farmacológica e bioquimicamente estas PLA2s e outras toxinas. A análise comparativa do veneno total de C.d.r. mostrou uma presença sutil de convulxina e giroxina, enquanto a análise da C.d.c. revelou ausência de convulxina no veneno. Alem disso, ambos demonstraram significativas diferenças para a atividade de PLA2. A análise de cada crotoxina isolada de C.d.r. ou de C.d.c. também revelou significante variação em comparação com a C.d.t. Neste trabalho nos isolamos duas novas isoformas de PLA2 de C.d.r. e C.d.c.. Ambas as proteínas foram caracterizadas como básicas e ambas demonstram massa molecular de aproximadamente 14 kDa. Em dicroísmo circular ambas as proteínas demonstraram a presença de alta quantidade de alfa hélice, contudo foi encontrada uma pequena diferença para a quantidade de folha Seta e cadeias randômicas. Estes resultados sugerem que a diferença estrutural entre estas proteínas, corrobora com os resultados da análise de seqüência N-terminal e a análise filogenética. Além das diferenças bioquímicas encontradas para os dois venenos, para a crotoxina, PLA2 e crotapotina, nos observamos que o veneno e a crotoxina isolada da C.d.c. exibiram alta atividade neurotóxica em preparação de músculo nervo frênico diafragma de camundongo, enquanto o veneno e a crotoxina de C.d.r. não. bogo nos concluímos que ambos .os venenos mostraram diferenças em suas propriedades bioquímicas e farmacológícas, entre os dois venenos e estes em comparação com a C. d. terrificus e C. d. collilineatus. Ambas as isoformas de PLA2 demonstraram algumas similaridades estruturais em alguns aspectos, mas nqs observamos algumas poucas diferenças que provavelmente estão associadas com as diferenças farmacológicas e enzimáticas encontradas entre as isoformas de PLA2 isoladas de C.d.r. e C.d.c / Abstract: In the north region of Brazil the Crotalus durissus ruruima (C.d.r.) is responsible for several snake bit cases and mainly found in the region near the Venezuela and Colombia. Although the Crotalus durissus cumanensis (C.d.e.) is other wide spread rattlesnake in south Venezuela frontier. Both snakes are only found in the equatorial region of South America and both venoms showed significative difference in the composition if compared to Crotalus durissus terrifieus (C.d.t). 'The crotoxin is the principal toxin and responsible for the main toxicology effect of the Crotalus durissus terrifieus venom. The main focus of the thesis was isolation and characterization of the PLA2 isoforms isolated from the both venom and characterized the pharmacological and biochemical characterization PLA2 and other toxins. The comparative analysis of whole venom of C.d.r. showed the marginal presence of convulxin and gyroxin while the analysis of the C.d.c. the convulxin was absent in the venom. Beyond this, both also showed significative differences for the PLA2 activity. The analysis of the each crotoxin isolated from the C.d.r. or C.d.c. also showed significant variation in comparison with C.d.t. In this work we isolated two new isoforms of PLA2 from the C.d.r. and C.d.c. Both proteins were characterized as basic protein and both showed a molecular mass around 14 kDa. In the circular dichroism, both proteins showed the presence of high content of alpha helix although they found slights differences for the beta sheets or random coil.These results suggest the structural difference of both proteins that were corroborated by the N-terminal sequence analysis and by phylogenetic analysis. Beside the biochemical differences found for both venom, crotoxins, PLA2 and erotapotins, we observed the venom and Crotoxins isolated from the C.d.e. exhibited higher neurotoxic activity on the phrenic nerve diaphragm preparation while the venom and crotoxin isolated from the C.d.r. was not. )"hus we conclude that both venoms showed differences at biochemical and pharmacological properties between both venom and these in comparison with C.d. terrifieus or C.d. collilineatus. Both PLA2 isoforms showed some similar structural aspects but we observed some slight different that probably were associated with the pharmacological and enzimatical differences found for both PLA2 isolated from the C.d. e. and C.d.r / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Ophidian accidents involving species of the genus Crotalus, are usually serious and frequently fatal due to the frequency of acute renal failure. Unfortunately, there have been few studies of the toxinologic effects of Crotalus durissus cumanensis venom. The renal effects of the venom used in this study were observed by perfusion of isolated kidneys. Infusion of C. d. cumanensis venom (10 Âg/mL) produced an increase in perfusion pressure (PP) and renal vascular resistance (RVR). Urinary flow (UF) and glomerular filtration rate (GFR) were reduced. The venom was able to decrease the percentage of sodium tubular transport (%TNa+) and the percentage of chloride tubular transport (%TCl-). In kidneys perfused with (10 Âg/mL) crotoxin, there were no significant changes in PP or RVR. The GFR decreased, while the UF increased. In contrast with whole venom, crotoxin reduced %TNa+, %TK and %TCl-. Analysis of the cytotoxic effects of Crotalus durissus cumanensis venom and crotoxin on renal tubular MDCK cells was performed by the MTT method. The venom promoted a concentration-dependent cytotoxic effect with an IC50 value of 5.38 Âg/mL. In aortic rings precontracted by phenylephrine (Phe; 0.1 mM) with intact endothelium, C. d. cumanensis venom (0.1â30.0 Âg/mL) resulted in an increased maximal contraction up to 130.0  6.6% at a concentration of 30.0 Âg/mL. In contrast, in endothelium denuded rings, vasocontraction was reduced in a concentration-dependent manner to 66.7  4.9% (50.0 Âg/mL). The effect was similar in the case of potassium-induced contraction (K+; 40 mM), in which there was a significant increase in the contraction of endothelium intact rings up to 115.6  4.9% (30.0 Âg/Ml) and a vasorelaxant effect (70.9  4.7%) at a dose of 50.0 Âg/mL after removal of the endothelium. In conclusion, C. d. cumanensis venom and crotoxin cause toxicity in isolated kidneys, however, only the whole venom has a cytotoxic effect on renal tubular cells. In aortic ring assays, whole venom causes endothelium dependent vasoconstriction. It is suggested that the toxic effects produced by the venom of Crotalus durissus cumanensis in kidney and isolated aorta, probably due to the participation of other fractions or a synergism of the components that make up the total venom / Os acidentes ofÃdicos envolvendo o gÃnero Crotalus, sÃo graves e frequentemente fatais devido à freqÃÃncia que evolui para a falÃncia renal aguda. Considerando a insuficiÃncia de esclarecimentos dos efeitos toxinolÃgicos do veneno da Crotalus. durissus cumanensis teve-se a necessidade de conduzir um estudo dos efeitos renais e vasculares ocasionados pelo veneno total e fraÃÃo crotoxina. Os efeitos renais foram avaliados atravÃs da perfusÃo de rim isolado. A infusÃo do veneno na concentraÃÃo de 10Âg/mL produziu um aumento na pressÃo de perfusÃo (PP), na resistÃncia vascular renal (RVR) e uma diminuiÃÃo do ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) e no fluxo urinÃrio (FU). O veneno foi causou ainda reduÃÃo nos transportes tubulares de sÃdio (%TNa+) e cloreto (%TCl-). No grupo perfundido com crotoxina (10Âg/mL), nÃo foi observada alteraÃÃes significativas na PP e RVR. PorÃm, o RFG foi diminuÃdo enquanto que o FU aumentou. A crotoxina reduziu ainda os transportes tubulares de sÃdio, potÃssio e cloreto. Na avaliaÃÃo da citotoxicidade em cÃlulas tubulares renais MDCK pelo mÃtodo MTT, o veneno total da C. d. cumanensis causou um efeito citotÃxico direto dependente da concentraÃÃo com um valor de CI50 de 5,38Âg/mL. O presente estudo avaliou os efeitos vasculares do veneno total e crotoxina em ensaios com aorta isolada. Em anÃis de aorta prÃ-contraÃdas com fenilefrina (Phe 0,1 M) com endotÃlio intacto, o veneno da C. d. cumanensis (0,1 â 30,0Âg/mL) produziu um aumento mÃximo da contraÃÃo para 130,0  6,6% na concentraÃÃo de 30,0Âg/mL. Em contraste, em anÃis ausentes de endotÃlio, a vasoconstriÃÃo foi reduzida para 66,7  6,6% (50,0 Âg/mL). Efeito similar observados nas preparaÃÃes prÃ-contraÃdas com potÃssio (K+ 40mM), em que ocorreu um aumento das contraÃÃes em anÃis com endotÃlio intacto para 115,6  4,9% (30,0Âg/mL) e um efeito vasorelaxante (70,9  4,9%) na concentraÃÃo de 50,0Âg/mL, apÃs a remoÃÃo do endotÃlio. Nos ensaios com anÃis prà contraÃdos com fenilefrina e potÃssio a adiÃÃo cumulativa de crotoxina (0,1 â 30,0Âg/mL) nÃo modificou a contratilidade aÃrtica. Em conclusÃo, o veneno total e a fraÃÃo crotoxina causam toxicidade em rins isolados, entretanto, somente o veneno total possui um efeito citotÃxico direto nas cÃlulas tubulares renais. Em anÃis de aorta o veneno total produz um efeito vasoconstritor dependente da integridade do endotÃlio. Sugere-se que os efeitos tÃxicos produzidos pelo veneno da Crotalus durissus cumanensis em rim e aorta isolada, provavelmente deve-se a participaÃÃo de outras fraÃÃes ou a um sinergismo dos componentes que compÃe o veneno total.