La pause transcriptionnelle marquée par les ARN polymérases (RNAP) est un mécanisme clé pour réguler l'expression des gènes dans tous les règnes de la vie et est une condition préalable à la terminaison de la transcription. Le facteur de transcription bactérien essentiel NusA stimule à la fois la pause et la terminaison de la transcription, jouant ainsi un rôle central. Ici, je présente des reconstructions par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à une seule particule de NusA lié à des complexes d'élongation en présence et en absence d’ARN en épingle à cheveux dans le canal de sortie de l'ARN. Les structures révèlent quatre interactions entre NusA et RNAP qui suggèrent comment NusA stimule le repliement de l’ARN, la pause et la terminaison de la transcription. Un intermédiaire de translocation asymétrique de l'ARN et de l'ADN convertit le site actif de l'enzyme en un état inactif, fournissant une explication structurelle pour l'inhibition de la catalyse. La comparaison de RNAP à différentes étapes de la mise en pause donne un aperçu de la nature dynamique du processus et du rôle de NusA en tant que facteur de régulation. / Transcriptional pausing by RNA polymerases (RNAPs) is a key mechanism to regulate gene expression in all kingdoms of life and is a prerequisite for transcription termination. The essential bacterial transcription factor NusA stimulates both pausing and termination of transcription, thus playing a central role. Here, I present single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) reconstructions of NusA bound to paused elongation complexes with and without a pause-enhancing hairpin in the RNA exit channel. The structures reveal four interactions between NusA and RNAP that suggest how NusA stimulates RNA folding, pausing, and termination. An asymmetric translocation intermediate of RNA and DNA converts the active site of the enzyme into an inactive state, providing a structural explanation for the inhibition of catalysis. Comparing RNAP at different stages of pausing provides insights on the dynamic nature of the process and the role of NusA as a regulatory factor.

La régulation de la transcription est un processus dynamique faisant intervenir le recrutement de complexes protéiques impliqués dans le remodelage de la chromatine. Parmi eux, mon travail s’est focalisé sur le complexe NuRD (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation) et sa sous-unité de liaison à l’ADN CpG MBD3. Pour cela une approche de biologie structurale intégrative combinant la préparation biochimique, la caractérisation biophysique et l’étude structurale par cryo-EM et cristallographie aux rayons-X a été mise en place. Les caractérisations biophysiques de MBD3 ont permis de mettre en évidence son interaction avec un ADN non-modifié CpG et des cristaux diffractant jusqu’à 3.9 Å ont été obtenu. De plus la région désordonnée en aval du domaine de liaison a été identifiée et son impact dans la formation de complexe caractérisé. Des cristaux pour les différentes constructions en complexe avec l’ADN ont été obtenus et sont actuellement optimisés. Enfin l’optimisation de la purification et la préparation du complexe, ont permis la visualisation du complexe NuRD et mettent en avant pour la première fois une organisation en domaines du complexe. / Transcription regulation of chromatin is a very dynamic process regulated through the recruitment of chromatin-remodeling complexes. My work focuses on NuRD for Nucleosome remodeling and histones deacetylation complex a 1 MDa multi-subunit protein complex and its subunit MBD3 a CpG-binding protein and more precisely on an integrated biology approach of this molecular assembly and its interaction with DNA. It combines biochemical preparation, biophysical characterization, single particle cryo-eletron microscopy and x-ray crystallography. Biophysical analysis show that MBD domain of MBD3 interacts with unmodified CpG DNA, a crystal diffracting up to 3.9 Å were obtained. Moreover a C-terminal intrinsically disordered region of MBD3 were identified and despite is inherent disorder seems to increase the binding affinity of MBD3 for DNA. Crystals were obtained for both constructs in complex with DNA and are currently optimized.Cryo-EM study of NuRD complex allows us to develop and optimized purification and grids preparation for the visualization of the complex. The present results reveal a domain organization of the complex never identify before.

Um das Verhalten von Actiniden im Menschen (Stoffwechsel), in geologischen und in biologischen Systemen vorherzusagen, ist es erforderlich deren Speziation genau zu kennen. Zur Bestimmung dieser wird das chemische Verhalten des Urans hinsichtlich Komplexbildungsreaktionen und Redoxreaktionen in Modellsystemen untersucht. Anhand der gewonnenen thermodynamischen Konstanten und dem Redoxverhalten können Risikoabschätzungen für das jeweilige untersuchte System getroffen werden. Das umweltrelevante Uran(IV)-Uran(VI)-Redoxsystem besitzt mit der metastabilen fünfwertigen Oxidationsstufe einen zumeist kurzlebigen Zwischenzustand. Innerhalb dieser Arbeit gelang es erstmalig die Uran(V)-Fluoreszenz mittels laserspektroskopischer Methoden nach zu weisen. Beispielsweise konnte das Bandenmaximum von aquatischem Uranyl(V) im perchlorhaltigem Medium (λex = 255 nm) mit 440 nm, bei einer Fluoreszenzlebensdauer von 1,10 ± 0,02 µs bestimmt werden. Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung eines aquatischen [U(V)O2(CO3)3]5--Komplexes (λex= 255 nm und 408 nm) zeigte bei Raumtemperatur keine Fluoreszenz. Durch Anwendung der Tieftemperaturtechnik wurden bekannte Quencheffekte des Carbonats unterdrückt, so dass bei beiden Anregungswellenlängen ein für Uran(V) typisches Fluoreszenzspektrum im Bereich von 375 nm bis 450 nm, mit Bandenmaxima bei 401,5 nm (λex = 255 nm) und 413,0 nm (λex = 408 nm) detektiert werden konnte. Darüber hinaus konnte bei 153 K (λex = 255 nm) eine Fluoreszenzlebensdauer von 120 ± 0,1 µs bestimmt werden. Untersetzt wurden diese fluoreszenzspektroskopischen Nachweise durch mikroskopische Studien verschiedener Uran(IV)-Festphasen (Uraninit…UO2, Uran(IV) Tetrachlorid…UCl4) und einer sulfathaltigen Uran(IV)-Lösung (UIVSO4). Diese wurden durch kontinuierliche Sauerstoffzufuhr zu Uran(VI) oxidiert. Die ablaufende Oxidation wurde mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM) verfolgt, wobei die Proben mit einer Wellenlänge von 408 nm zur Fluoreszenz angeregt wurden. Die auftretenden Bandenmaxima bei 445,5 nm (UO2), bei 445,5 nm (UCl4) und bei 440,0 nm (UIVSO4) konnten eindeutig der Uran(V)-Fluoreszenz zugeordnet werden. Zur Bestimmung thermodynamischer Konstanten mit Hilfe der Tieftemperaturfluoreszenz wurde zunächst der Einfluss der Temperatur auf das Fluoreszenzverhalten des freien Uranyl(VI)-Ions näher betrachtet. Es zeigte sich, dass mit Erwärmung der Probe (T>298 K) die Fluoreszenzlebensdauer von 1,88 µs (298 K) deutlich absinkt. Die Fluoreszenzintensität verringerte sich dabei um 2,3 % pro 1 K zwischen 273 K und 313 K. Im Gegensatz dazu, steigt die Fluoreszenzlebensdauer um das 150-fache auf 257,9 µs bei einer Verminderung der Temperatur (T <298 K) auf 153 K. Das weitere Absenken der Temperatur (T <153 K) zeigte keinen Einfluss auf die Fluoreszenzlebensdauer. Die Lage der Hauptemissionsbanden des freien Uranyl(VI)-Ions (488,0 nm, 509,4 nm, 532,4 nm, 558,0 nm, 586,0 nm) zeigte bei diesen Untersuchungen keine temperaturabhängige Verschiebung. Die Validierung der Tieftemperaturtechnik zur Bestimmung thermodynamischer Konstanten mittels zeitaufgelöster laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie erfolgte anhand des Uran(VI)-Citrat-Systems. Im Gegensatz zu bisherigen fluoreszenzspektroskopischen Betrachtungen bei Raumtemperatur wurde das Fluoreszenzsignal bei tiefen Temperaturen mit einsetzender Komplexierung nicht gequencht, woraus die Ausprägung einer gut interpretierbaren Fluoreszenz resultierte. Die Analyse der spektralen Daten mit SPECFIT ergaben mit log β101 = 7,24 ± 0,16 für den [UO2(Cit)]--Komplex und log β202 = 18,90 ± 0,26 für den [(UO2)2(Cit)2]2 -Komplex exakt die in der Literatur angegebenen Stabilitätskonstanten. Zudem konnten Einzelkomponentenspektren mit Bandenmaxima bei 475,3 nm, 591,8 nm, 513,5 nm, 537,0 nm und 561,9 nm für den 1:0:1-Komplex und 483,6 nm, 502,7 nm, 524,5 nm, 548,1 nm und 574,0 nm für den 2:0:2-Komplex und Fluoreszenzlebensdauern von 79 ± 15 µs (1:0:1) und 10 ± 3 µs (2:0:2) bestimmt werden. Zur Modellkomplexierung des Uran-Citrat-Systems wurde in dieser Arbeit auch das Komplexbildungsverhalten von U(IV) in Gegenwart von Citronensäure untersucht. Hierbei wurden über den gesamten pH-Wertbereich gelöste Uran-Citrat-Spezies spektroskopisch nachgewiesen und die Stabilitätskonstanten sowie die Einzelkomponentenspektren für die neu gebildeten Uran(IV) und (VI)-Spezies bestimmt. Für die neu gebildeten Citrat-Komplexe des sechswertigen Urans wurden Komplexbildungskonstanten von log β203 = 22,67 ± 0,34 ([(UO2)2(Cit)3]5-) und log β103 = 12,35 ± 0,22 ([UO2(Cit)3]7-) und für die Komplexe des vierwertigen Urans von log β1-21 = -9,74 ± 0,23 ([U(OH)2Cit]-) und log β1 31 = -20,36 ± 0,22 ([U(OH)3Cit]2-) bestimmt. Untersuchungen zum Redoxverhalten von Uran in Gegenwart von Citronensäure zeigten unter aeroben und anaeroben Versuchsbedingungen eine photochemische Reduktion vom U(VI) zu U(IV), welche spektroskopisch nachgewiesen werden konnte. Dabei zeigt speziell die Reaktion unter oxidierenden Bedingungen, welchen großen Einfluss vor allem organischen Liganden auf das chemische Verhalten des Urans haben können. Sowohl die Reduktion unter O2- als auch die unter N2-Atmosphäre, weisen ein Maximum bei einem pH Wert von 3,5 bis 4 auf. Unter anaeroben Bedingungen reduziert die Citronensäure mit ca. 66 %, 14 % mehr Uran(VI) zu Uran(IV) als unter anaeroben Bedingungen mit ca. 52 %. Ab einem pH-Wert von 7 konnte eine Reduktion nur unter sauerstofffreien Bedingungen festgestellt werden. Die Wechselwirkung von U(VI) in Gegenwart von Glucose wurde hinsichtlich Reduktion und Komplexierung des Uran(VI) betrachtet. Mit Hilfe der zeitaufgelösten laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie bei tiefen Temperaturen wurde dabei ein Uranyl(VI)-Glucose-Komplex nachgewiesen. Die Komplexierung wurde lediglich bei pH 5 beobachtet und weist eine Komplexbildungskonstante von log βI=0,1 M = 15,25 ± 0,96 für den [UO2(C6H12O6)]2+-Komplex auf. Mit einer Fluoreszenzlebensdauer von 20,9 ± 2,9 µs und den Hauptemissionsbanden bei 499,0nm, 512,1 nm, 525,2 nm, 541,7 nm und 559,3 nm konnte der Uranyl(VI)-Glucose-Komplex fluoreszenzspektroskopisch charakterisiert werden. Unter reduzierenden Bedingungen wurde, ab pH-Wert 4 eine auftretende Umwandlung vom sechswertigen zum vierwertigen Uran durch Glucose in Gegenwart von Licht beobachtet. Der Anteil an gebildetem Uran(IV) steigt asymptotischen bis zu einem pH-Wert von 9, wo das Maximum mit 16 % bestimmt wurde. Als Reaktionsprodukt der Redoxreaktion wurde eine Uran(VI)-Uran(IV)-Mischphase mit der Summenformel [UIV(UVIO2)5(OH)2]12+ identifiziert. Mit Hilfe der cryo-TRLFS wurde, durch Verminderung von Quencheffekten die Uranspeziation in natürlichen Medien (Urin, Mineralwasser) direkt bestimmt. Proben mit Uran Konzentrationen von < 0,1 µg/L konnten dadurch analysiert werden. In handelsüblichen Mineralwässern wurde die zu erwartende Komplexierung durch Carbonat nachgewiesen. Im Urin zeigte sich in Abhängigkeit vom pH-Wert eine unterschiedliche Uranspeziation. Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung wies bei niedrigerem pH Wert (pH<6) eine Mischung aus Citrat- und Phosphat-Komplexierung des U(VI) und bei höheren pH-Wert (pH>6) eine deutliche Beteilung von Carbonat an der Komplexierung auf. Diese Ergebnisse stehen in sehr guter Übereinstimmung mit theoretischen Modellrechnungen zur Uranspeziation im Urin. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass für eine zuverlässigere Prognose des Urantransportes in Geo- und Biosphäre in Zukunft nicht nur Betrachtungen zur Komplexchemie, sondern auch zum Redoxverhalten des Urans nötig sind, um die Mobilität in der Natur richtig abschätzen zu können.

Une approche de biologie structurale intégrative a été mise à profit pour l'étude de l’organisation structurale du complexe NuRD. Mon travail s'est focalisé essentiellement sur trois sous-unités du complexe: MBD3, RbAp46 et RbAp48. J'ai mis en place les protocoles de production et de purification de ces différentes sous-unités, et les ai caractérisé biophysiquement par diverses méthodes. Nous avons ensuite entrepris des études de liaisons sur des nucléosomes reconstitués au laboratoire. Pour MBD3, l'optimisation du complexe nous a permis d'obtenir des cristaux diffractant jusqu'à 7 A de résolution. Parallèlement, une reconstruction 3D préliminaire à partir de données de cryo-microscopie électronique a pu être obtenue à 25A de résolution. Pour RbAp46/48, nous avons pu montrer que ces protéines formaient un complexe stable avec le nucléosome, pavant la voie pour leur future étude structurale par cryo-microscopie électronique ou cristallographie aux rayons-X. / An integrative structural biology approach has been used to study the structural organization of the NuRD complex.My work focused especially on three subunits of this complex: MBD3, RbAp46 and RbAp48. I set up the preparation of the individual subunits and characterized them by various biophysical methods. We next carried out binding assays with homemade human nucleosomes. For MBD3, optimization of the complex led to crystals diffracting up to 7 Å. In parallel, a preliminary 3-D reconstruction at 25 Å resolution has been solved in cryo-EM. For RbAp46/48, crystal we were able to show that these proteins form stable complexes with the nucleosome, paving the way for future structural analysis by cryo-EM or X-ray crystallography.

Le ribosome est une machinerie cellulaire importante impliquée dans la synthèse protéique de toute cellule vivante. Par conséquent, le ribosome est l'une des principales cibles des antibiotiques naturels, qui sont capables de tuer les cellules bactériennes en bloquant la synthèse protéique. Toutefois, certaines bactéries sont résistantes à ces antibiotiques en raison de petites modifications au niveau de leurs ribosomes. Entre autres, Staphylococcus aureus (S. aureus) est un agent pathogène responsable de nombreuses infections graves chez l’Homme. Les structures cristallines d'antibiotiques en complexe avec des ribosomes de bactéries non-résistantes, non-pathogènes, Gram négatives ont fourni un aperçu sans précédent des mécanismes d'action de ces antibiotiques. Cependant, aucune structure de ribosome de bactéries pathogènes, hautement résistantes, Gram positives telles que S. aureus n’a encore été identifiée.Dans cette étude, nous présentons la première structure de ribosome de S. aureus à haute résolution (3.9 Å) résolue par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nous mettons en évidence plusieurs caractéristiques de l'organisation des ribosomes spécifiques des bactéries Gram-positives. Nous décrivons également le protocole de purification et de cristallisation du ribosome de S. aureus pour de futures études de cryo-ME et de cristallographie aux rayons X.Tous les résultats obtenus dans ces travaux, faciliteront la description à l’échelle atomique du ribosome de S. aureus et ses complexes fonctionnels’ ’dans un futur proche. La combinaison des méthodes de cristallographie aux rayons X et de cryo-ME aidera à atteindre cet objectif. Les résultats obtenus serviront de base pour le développement de nouveaux composés contre la bactérie pathogène et extrêmement résistante qu’est S. aureus. / The ribosome is a large cellular machinery that performs the protein synthesis in every living cell. Therefore, the ribosome is one of the major targets of naturally produced antibiotics, which can kill bacterial cells by blocking protein synthesis. However, some bacteria are resistant to these antibiotics due to small modifications of their ribosomes. Among them, Staphylococcus aureus (S. aureus) is a severe pathogen that causes numerous infections in humans. The crystal structures of complexes of antibiotics with ribosomes from Gram-negative non-pathogenic non-resistant bacteria have provided unparalleled insight into mechanisms of antibiotics action. However, the structure of the ribosome from Gram-positive pathogenic and highly resistant bacteria such as S. aureus was still unidentified.In this study we present the first high resolution structure of the ribosome from S. aureus solved at 3.9 Å by cryo-electron microscopy (cryo-EM). We demonstrate several features of the ribosome organization which are unique for Gram-positive bacteria. We also describe the protocol of purification and crystallization of S. aureus ribosome for future cryo-EM and X-ray crystallography studies.All the results obtained in this work will help to describe S. aureus ribosome and its functional complexes at the atomic level in the nearest future. The combination of X-ray crystallography and cryo-EM methods will help to achieve this aim. The obtained results will provide a foundation for the development of new compounds against the pathogenic and extremely resistant bacteria S. aureus.

La cryo-microscopie électronique a connu une révolution majeure ces dernières années, liée à des évolutions technologiques importantes, tant au niveau des microscopes, que des caméras ou des logiciels de traitement d’images. Ainsi, avec l’arrivée de microscopes électroniques plus stables mécaniquement et électroniquement, il est possible d’enregistrer plusieurs milliers d’images de façon automatique en quelques jours, et par conséquent d’obtenir un jeu initial d’images conséquent des particules des complexes protéiques étudiés. Sauf que maintenant, il ne s’agit plus d’image au sens strict, mais de film. En effet, les nouvelles caméras, dites à détection directe d’électrons, permettent de décomposer l’image en plusieurs fractions d’images au cours de l’exposition, et ce, avec une sensibilité dix fois supérieure par rapport à celle des anciennes caméras. L’analyse de ces fractions d’images a permis de montrer que les particules protéiques, bien que piégées dans une mince pellicule de glace, bougeaient sous l’effet du faisceau d’électrons. L’alignement des fractions et leur sommation permettent ainsi de corriger ces mouvements, améliorant la qualité du signal contenu dans chaque image. Ainsi, alors que pendant des dizaines d’années, les informations structurales extraites des images des microscopes électroniques étaient limitées à la moyenne résolution, c’est à dire entre 5 et 15 Å de résolution, nous voyons apparaître depuis ces deux-trois dernières années, de très nombreuses cartes de densités électroniques de complexes protéiques issues de la microscopie électronique, à des résolutions inférieures à 4 Å, permettant de construire des modèles atomiques à l’aide d’outils jusqu’alors réservés à la cristallographie aux rayons X. C’est dans ce contexte, que j’ai étudié par cryo-microscopie électronique et traitement d’images, l’organisation structurale de trois virus de plante :- Le virus de la mosaïque de l’arabette (ArMV), un Nepovirus uniquement transmis par le nématode Xiphinema diversicaudatum, qui est responsable de la maladie du court-noué de la vigne. -Le virus de la tâche de la fève (BBSV), un Comovirus transmis par les coléoptères, responsable de la dégénération chez les légumineuses.- Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), un Caulimovirus servant de virus modèle pour l’étude de la transmission des virus non circulants.Les virus sont des parasites endocellulaires obligatoires, dont l’efficacité dépend de leur capacité de réplication au sein de la cellule infectée et de leur transmission vers de nouveaux hôtes. En raison de l’immobilité des plantes, les phytovirus font souvent appel à des vecteurs pour la transmission plante à plante, qui sont principalement des insectes, des nématodes, des champignons ou des acariens. Les phytovirus sont généralement responsables d’une baisse importante de croissance de la plante et des fruits, voire de la mort de l’hôte infecté. Les dégâts ainsi causés engendrent des pertes de rendement dans les cultures partout dans le monde, se traduisant par d’énormes pertes économiques pour les cultivateurs. Ce travail de thèse présente les structures atomiques de l’ArMV et du BBSV obtenues par cryo-microscopie électronique, ainsi que les premiers résultats obtenus sur la structure de la capside du CaMV, et sa protéine de transmission P2. / A revolution has taken over the world of cryo-electron microscopy for the last years, by dint of a major breakthrough both in technology, with the rise of new microscopes and cameras, and in image processing. With the advent of high-end microscopes, mechanically and electronically more stable, one can expect to record an initial data set of thousand images in few days, thanks to automated acquisition. Besides, the new direct electron detectors can not only record images, but also movies with a better sensitivity than the one we used to have. The movie processing revealed the existence of a beam-induced motion occurring during acquisition. The correction of the motion through frame alignment improves significantly the quality of data. Thus, cryo-electron microscopy was only limited to a middle resolution range (5 to 15 Å) until two or three years ago, when several density maps above 4 Å started to appear, allowing the building of atomic model using tools that were only restricted to X-ray crystallography.In this context, I have studied the structural organization of three plant viruses, using cryo-electron microscopy and image processing:- Arabis Mosaic Virus (ArMV), it’s a Nepovirus only transmitted by the nematode Xiphinema diversicaudatum, responsible for disease of vineyards.- Broad Bean Stain Virus (BBSV), it’s a Comovirus transmitted by beetles, responsible for the degeneration of leguminous plants.- Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), it’s a Caulimovirus used as model to characterize the transmission of non circulative viruses.Viruses are obligate intracellular parasites, which efficiency is directly related to its replicative capacity inside the infected cell, and its transmission to new hosts. Due to the immobility of plants, plant viruses often use vectors for the transmission plant to plant, which are mainly insects, nematodes, fungi or mites. Plant viruses are generally responsible for a significant decrease in plant and fruit growth, and even the death of the plant. The plant viruses are devasting fields worldwide, causing huge loss in crop yield each year. This study highlights the atomic structures of ArMV and BBSV, as well as the first data about the CaMV capsid and its transmission protein.

Macromolecular assemblies such as the ribosome, spliceosome, polymerases are imperative for cellular functions. The current understanding of these important machineries and many other assemblies at the molecular level is poor. The lack of structural data for many macromolecular assemblies further causes a bottleneck in understanding the cellular processes and the various disease manifestations. Hence, it is essential to characterize the structures and molecular architectures of these macromolecular assemblies. Though the number of 3-D structures for individual proteins structures or domains in the Protein Data Bank (PDB) is growing, the number of structures deposited for macromolecular assemblies is relatively poor. Hence, apart from the use of experimental techniques for characterizing macromolecular assembly structures, the use of computational techniques would help in supplementing the growth of macromolecular assembly structures. This thesis deals with the use of integrative approaches where computational methods are combined with experimental data to model and understand the mechanistic features of macromolecular assemblies with a special focus on a sub-complex of the spliceosome machinery. Chapter 1 of this thesis provides an introduction to protein-protein interactions and macromolecular assemblies. Further, the modelling of macromolecular assemblies using integrative methods are discussed, with a subsequent introduction to the spliceosome machinery. In chapter 2, modelling studies were performed on the proteins involved in the general amino acid control mechanism, which is triggered in yeast under amino acid starvation conditions. The proteins involved in the study were Gcn1, a ribosome binding protein and the RWD-domain containing proteins Gcn2, Yih1, Gir2 and Mtc5. From laboratory experiments it is known that in order for Gcn2 activation, an eIF2α kinase, its RWD-domain has to bind to Gcn1 and the residue Arg-2259 is important for this interaction. As the 3-D structure for the Gcn1 region containing Arg-2259 is not currently available, its 3-D structure was inferred using fold recognition and comparative modelling techniques. Further, in order to understand the Gcn2 RWD domain-Gcn1 molecular interaction, a complex structure was inferred by using a restrained protein-protein docking procedure. As the proteins, Yih1 and Gir2 are known to bind to Gcn1 using their RWD-domains, first the structures of the RWD-domain containing proteins including Mtc5 were inferred using a Gcn2 RWD domain NMR structure. Additionally, the Gcn1-Gcn2 complex was used to build a set of complexes to explain the binding of other RWD domain containing proteins Yih1, Gir2 and Mtc5. The important molecular interactions were obtained on analysing the interacting residues in these complexes. Thus, the Gcn1-Gcn2 interaction at the molecular level has been proposed for the first time. Future experiments guided by the protein-protein complex models and the proposed set of mutations should provide an understanding about the critical molecular interactions involved in the general amino acid control mechanism. Chapter 3 describes an integrative approach that was used to decipher a pseudo-atomic model of the closed form of human SF3b complex. SF3b is a multi-protein complex containing seven components – p14, SF3b49, SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b14b and SF3b10. It recognizes the branch point adenosine in the pre-mRNA as part of U2 snRNP or U11/U12 di-snRNP in the spliceosome. Although, the cryo-EM map for human SF3b complex has been available for more than a decade, the structure and relative spatial arrangement of all components in the complex are not yet known. The integrative modelling approach used here involved utilizing structural data in the form of available X-ray and NMR structures, fold recognition and comparative modelling as well as currently available experimental datasets, along with the available cryo-EM density map to provide a model with high structural coverage. Hence, the molecular architecture of closed form human SF3b complex was derived that can now provide insights into the functioning of SF3b in splicing. This might also help the future high resolution structure determination efforts of the entire human spliceosome machinery In chapter 4, the molecular architecture of the closed form of SF3b complex obtained from the use of integrative modelling approach (Chapter 3) is extensively discussed. The structure-function relationships for some of the SF3b components based on the pseudo-atomic model has also been provided. In addition, the extreme flexibility associated with some of the SF3b components based on dynamics analysis has also been examined. Further, using an existing U11/U12 di-snRNP cryo-EM map and the closed form SF3b complex pseudo-atomic model, an open form of the SF3b complex was modelled and the component structures were fit into it. Hence, it was found that the transition between closed and open forms is primarily caused by a flap containing the HEAT repeat protein, SF3b155. This Protein is also known to harbour cancer causing mutations and has the potential to affect the Closed to open transition as well as SF3b complex structure and stability. Thus, this provides a framework for the future understanding of the closed to open transition in SF3b functioning within the spliceosome. Chapter 5 builds upon the integrative modelling approach (Chapter 3) that proposed the molecular architecture of the closed form of human SF3b complex and an open form of SF3b that was derived due to a flap opening of the closed form and which might help in accommodating RNA and other trans-acting factors within the U11/U12 di-snRNP (Chapter 4). In the current chapter, the SF3b open form and its interaction with the RNA elements is studied. The 5' end of U12 snRNA and its interaction with pre-mRNA in branch point duplex was modelled guided by the open form of SF3b that provided the necessary structural constraints and the RNA model is topologically consistent with the existing biochemical data. Further, utilizing the SF3b opens form-RNA model and the existing experimental knowledge, an extensive discussion has been provided on how the architecture of SF3b acts as a scaffold for U12 snRNA: pre-mRNA branch point duplex formation as well as its potential implications for branch point adenosine recognition fidelity. Moreover, the reasons for SF3b to be defined as a “fuzzy” complex - a complex with highly flexible folded regions along with intrinsically disordered regions is also discussed. Hence, the current work adds to the excellent developments made previously and deepens the understanding of the structure-function relationship of the human SF3b complex in the context of the spliceosome machinery. In chapter 6, a methodology has been proposed for the use of evolutionary conservation of protein-protein interfacial residues in multiple protein cryo-EM density based fitting of the protein components in the low-resolution density maps of multi-protein assemblies. First, the methodology was tested on a dataset of simulated density maps generated at four different resolutions -10, 15, 20 and 25 Å. On utilizing the evolutionary conservation scores obtained from multiple sequence alignments to score the fitted complexes, it was found that there was a decrease in the conservation scores when compared to that of the crystal structures, which were used to generate the simulated density maps. Further, the assessment of the multiple protein density fitting technique to align the actual protein-protein interface residues correctly using a performance metric called F-measure showed there was a decrease in performance as the resolutions became poorer. Hence, based on evolutionary conservations scores as well as F-measure the decrease in conservation scores or performance was found to be mainly due to the errors associated with the fitting process. Subsequently, a refinement methodology was designed involving the use of conservation scores, which improved the accuracy of the fitted models and the same, was observed in an experimental cryo-EM density test case of RyR1-FKBP12 complex. Hence, the conservation information acts as an effective filter to distinguish the incorrectly fitted structures and improves the accuracy of the fitting of the protein structures in the density maps. Thus, one can incorporate the conserved surface residues information in the current density fitting tools to reduce ambiguity and improve the accuracy of the macromolecular assembly structures determined using cryo-EM. In the concluding chapter 7, the learnings on the structural and mechanistic features of protein assemblies obtained from the use of computational techniques and integration of experimental datasets is discussed. In chapter 2, the modelling of a binary macromolecular complex such as the Gcn1-Gcn2 complex was performed using computational structure prediction strategies to understand the molecular basis of its interaction. Due to the potential inaccuracies which can exist in computational modelling, the chapters 3 to 5 dealt with the use of integrative approaches, primarily guided by the cryo-EM map, in order to decipher the molecular architecture of the human SF3b complex in the closed and open forms as well as its contribution for branch point adenosine recognition. Based on the extensive experience gained in modelling of assemblies using cryo-EM data in the previous chapters, a new method has been proposed on the use of evolutionary conservation information to improve the accuracy of cryo-EM density based fitting. Hence, these studies have provided strategies for modelling macromolecular assemblies as well as a deeper understanding of its mechanistic features.

Eine Hauptanwendung der Einzelpartikel-Analyse in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Charakterisierung der dreidimensionalen Struktur makromolekularer Komplexe. Dazu werden zehntausende Bilder verwendet, die verrauschte zweidimensionale Projektionen des Partikels zeigen. Im ersten Schritt werden ein niedrig aufgelöstetes Anfangsmodell rekonstruiert sowie die unbekannten Bildorientierungen geschätzt. Dies ist ein schwieriges inverses Problem mit vielen Unbekannten, einschließlich einer unbekannten Orientierung für jedes Projektionsbild. Ein gutes Anfangsmodell ist entscheidend für den Erfolg des anschließenden Verfeinerungsschrittes. Meine Dissertation stellt zwei neue Algorithmen zur Rekonstruktion eines Anfangsmodells in der Kryo-Elektronenmikroskopie vor, welche auf einer groben Darstellung der Elektronendichte basieren. Die beiden wesentlichen Beiträge meiner Arbeit sind zum einen das Modell, welches die Elektronendichte darstellt, und zum anderen die neuen Rekonstruktionsalgorithmen. Der erste Hauptbeitrag liegt in der Verwendung Gaußscher Mischverteilungen zur Darstellung von Elektrondichten im Rekonstruktionsschritt. Ich verwende kugelförmige Mischungskomponenten mit unbekannten Positionen, Ausdehnungen und Gewichtungen. Diese Darstellung hat viele Vorteile im Vergleich zu einer gitterbasierten Elektronendichte, die andere Rekonstruktionsalgorithmen üblicherweise verwenden. Zum Beispiel benötigt sie wesentlich weniger Parameter, was zu schnelleren und robusteren Algorithmen führt. Der zweite Hauptbeitrag ist die Entwicklung von Markovketten-Monte-Carlo-Verfahren im Rahmen eines Bayes'schen Ansatzes zur Schätzung der Modellparameter. Der erste Algorithmus kann aus dem Gibbs-Sampling, welches Gaußsche Mischverteilungen an Punktwolken anpasst, abgeleitet werden. Dieser Algorithmus wird hier so erweitert, dass er auch mit Bildern, Projektionen sowie unbekannten Drehungen und Verschiebungen funktioniert. Der zweite Algorithmus wählt einen anderen Zugang. Das Vorwärtsmodell nimmt nun Gaußsche Fehler an. Sampling-Algorithmen wie Hamiltonian Monte Carlo (HMC) erlauben es, die Positionen der Mischungskomponenten und die Bildorientierungen zu schätzen. Meine Dissertation zeigt umfassende numerische Experimente mit simulierten und echten Daten, die die vorgestellten Algorithmen in der Praxis testen und mit anderen Rekonstruktionsverfahren vergleichen.

Die Frage nach der Möglichkeit von Leben auf anderen Planeten, vor allem auf dem Mars, steht in einem engen Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von flüssigem Wasser. Dies ist bei den vorherrschenden klimatischen Bedingungen, vor allem der tiefen Temperatur, nur mittels einer Gefrierpunktserniedrigung durch Salze erklärbar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich daher mit Phasengleichgewichten verschiedener Salz-Wasser-Systeme bei tiefen Temperaturen. Dabei wurden nach einer Sammlung von Literaturdaten und einer Ermittlung der Lücken innerhalb dieser verschiedene Systeme nach Mars-Relevanz, sowie chemischer Systematik ausgewählt und experimentell untersucht. Insgesamt wurden dabei 22 binäre Phasendiagramme von Salz-Wasser-Systemen betrachtet und 29 festen Phasen mittels Röntgen-Einkristallstrukturanalyse aufgeklärt. Aus diesen Strukturen wurde ein Modell zur Beschreibung einer zweiten Hydratationssphäre über eine Wechselwirkungsbilanz abgeleitet und an den verfügbaren Strukturen geprüft.

Electron crystallography of two-dimensional crystals is a structure-determination method well suited to the study of membrane protein structure-function. Two-dimensional crystals consist of ordered arrays of protein within reconstituted lipid bilayers, an arrangement that mimics the natural membrane environment. In this work we describe our recent progress in the use of this method with three different proteins, each providing a window into a separate paradigm in the electron crystallographic pipeline. Specific crystallization conditions for human leukotriene C₄ synthase (LTC₄S) have previously been determined, but our continued refinement of purification and crystallization has identified a number of additional parameters that greatly affect crystal size and quality, and we have developed a protocol to rapidly and reproducibly grow large, non-mosaic crystals of LTC₄S. The human gamma-glutamyl carboxylase (GGCX) has also been crystallized, but is sensitive to cryo-EM sample preparation conditions and we present here the successful reproduction of crystallization and refinement of cryo-EM sample preparation conditions. Lastly, we describe our crystallization screens with the Vibrio cholerae sodium-pumping NADH:ubiquinone reductase complex (Na⁺-NQR), and identify the factors critical to membrane reconstitution of the complex, a necessary first step towards crystallization. We also describe a semi-quantitative crystal screening protocol we have developed that provides quick and accurate method to assess two- dimensional crystallization trials, and discuss some general observations in optimization of membrane protein purification and two-dimensional crystallization for electron crystallography.