Submitted by JÉSSICA CRISTINA BILIZARIO NOGUEROL ANDRADE null (jessica_belizario@hotmail.com) on 2017-03-03T13:45:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Jéssica.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T17:36:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andrade_jcbn_me_bot.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T17:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrade_jcbn_me_bot.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Criptococose é uma micose sistêmica, cuja incidência tem aumentado nas últimas décadas. É causada pelos fungos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii que se apresentam sob a forma de levedura capsulada. Uma importante característica da infecção com as duas espécies do fungo é que enquanto o C.neoformans está associado à doença em pacientes imunossuprimidos, o C.gattii é capaz de induzir a micose em individuos imunocompetentes. O entendimento dos mecanismos envolvidos nestas diferenças tem sido um desafio para os pesquisadores da área. No que se refere à resposta imune do hospedeiro contra o Cryptococcus, está bem estabelecido que a resistência/suscetibilidade a infecção envolve a participação de diferentes subpopulações de células CD4. No entanto, os estudos sobre o papel das subpopulações TH17 e Treg são escassos. Além disso, são raros os trabalhos que de uma forma sistemática objetivaram comparar o perfil de células CD4 induzido por uma ou outra espécie do fungo. Diferencas nesse perfil poderiam explicar a indução da doença em diferentes populações. Assim, um primeiro objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de células CD4 efetoras induzido pelo C.neoformans e C.gatti . A abordagem experimental foi a incubação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro com leveduras vivas de C. neoformans e C.gattii, seguida da avaliação da expressão intracitoplasmática das citocinas IFN-(TH1), IL-4 (TH2), IL-17 (TH17) e o fator de transcrição Foxp3 (células Tregs) , por citometria de fluxo, bem como a expressão de mRNA para Foxp3 e RORyt (fator de transcrição para TH17). A análise global dos resultados mostrou que o C.neoformans não é capaz de induzir a diferenciação de TH1 e TH2, mas sim de células Treg e TH17. Por outro lado, o C.gattii induz apenas a diferenciação de células Treg. Outro aspecto da relação hospedeiro/ Cryptococcus que merece ser avaliado, refere-se ao achado de que vários microrganismos podem causar genotoxicidade em células do hospedeiro como uma forma de evasão dos mecanismos de defesa. Assim, um segundo objetivo do presente estudo foi avaliar se as diferentes espécies do Cryptococcus são capazes de induzir danos no DNA de PBMCs e se este processo está relacionado aos níveis de óxido nitrico (NO) produzidos por essas células. Detectamos que ambas as espécies são igualmente capazes de induzir genotoxicidade em PBMCs. No entanto, uma associação entre danos no DNA e altos níveis de NO foi detectada apenas em relação a C. gattii. Os resultados apontam para a possibilidade de que os pacientes com criptococose sejam mais suscetíveis ao desenvolvimento de outras doenças. / Cryptococcosis is a systemic mycosis, whose incidence has increased in the last decades. It is caused by the fungi Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii which present as capsulated yeasts. An important feature of infection with both fungus species is that while C.neoformans is associated with the disease in immunosuppressed patients, C.gattii is able to induce mycosis in immunocompetent individuals. To understanding the mechanisms involved in these differences has been a challenge for researchers. Regarding the host immune response against Cryptococcus, it is well established that resistance/ susceptibility to infection involves the participation of different subpopulations of CD4 cells. However, studies on the role of TH17 and Treg subpopulations are scarce. In addition, there are few studies that systematically aimed to compare the CD4 cell subpopulations profile induced by one or another species of the fungus. Differences in this profile could explain the induction of the disease in different populations. Thus, a first objective of the present study was to evaluate the effector CD4 cells subpopulations profile induced by C.neoformans and C.gattii. The experimental approach was the incubation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in vitro with living yeasts of C. neoformans and C.gattii, followed by evaluation of the intracytoplasmic expression of the cytokines IFN-γ (TH1), IL-4 (TH2), IL-17(TH17) and Foxp3 transcription factor (Tregs cells) by flow cytometry, as well as mRNA expression for Foxp3 and RORyt (transcription factor for TH17). Overall, the analysis of the results showed that C.neoformans is not able to induce the differentiation of TH1 and TH2, but induces Treg and TH17 cells. On the other hand, C.gattii only induces Treg cells differentiation. Another aspect of the host / Cryptococcus interaction that deserves to be evaluated relates to the finding that various microorganisms may cause genotoxicity in host cells as a mechanism of evading defense mechanisms. Thus, a second objective of the present study was to evaluate if the different species of Cryptococcus are able to induce DNA damage of PBMCs and whether this process is related to the levels of nitric oxide (NO) produced by these cells. We have detected that both species are equally capable of inducing genotoxicity in PBMCs. However, an association between DNA damage and high NO levels was only detected in relation to C. gattii. The results point to the possibility that patients with cryptococcosis are more susceptible to the development of other diseases.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A Criptococose é uma micose sistêmica, cuja incidência tem aumentado nas últimas décadas. É causada pelos fungos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii que se apresentam sob a forma de levedura capsulada. Uma importante característica da infecção com as duas espécies do fungo é que enquanto o C.neoformans está associado à doença em pacientes imunossuprimidos, o C.gattii é capaz de induzir a micose em individuos imunocompetentes. O entendimento dos mecanismos envolvidos nestas diferenças tem sido um desafio para os pesquisadores da área. No que se refere à resposta imune do hospedeiro contra o Cryptococcus, está bem estabelecido que a resistência/suscetibilidade a infecção envolve a participação de diferentes subpopulações de células CD4. No entanto, os estudos sobre o papel das subpopulações TH17 e Treg são escassos. Além disso, são raros os trabalhos que de uma forma sistemática objetivaram comparar o perfil de células CD4 induzido por uma ou outra espécie do fungo. Diferencas nesse perfil poderiam explicar a indução da doença em diferentes populações. Assim, um primeiro objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de células CD4 efetoras induzido pelo C.neoformans e C.gatti . A abordagem experimental foi a incubação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro com leveduras vivas de C. neoformans e C.gattii, seguida da avaliação da expressão intracitoplasmática das citocinas IFN-(TH1), IL-4 (TH2), IL-17 (TH17) e o fator de transcrição ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

As infecções fúngicas invasivas são um problema global em saúde pública que acometem milhões de vidas anualmente. Entre os principais gêneros causadores dessas doenças, a espécie Cryptococcus gattii destaca-se por acometer indivíduos imunocompetentes e imunossuprimidos. Esse patógeno atua no bloqueio da diferenciação das células T helper (Th) 1 (Th1) e 17 (Th17) através da atenuação da resposta pró-inflamatória no tecido pulmonar. Em vista da capacidade imunomoduladora de ArtinM em induzir uma resposta imunológica Th1 e Th17 através da indução da produção de IL-12 por células apresentadoras de antígenos (APCs), e pelo efeito da lectina em células T CD4+, esse efeito imunomodulador de ArtinM promoveu o controle da infecção por P. brasiliensis e C. albicans. Dessa forma, investigamos os efeitos da administração profilática ou terapêutica de ArtinM no controle da infecção experimental por C. gattii. Constatamos que a infecção por C. gattii rapidamente progride no tecido pulmonar, assim como há uma disseminação completa para o coração, fígado, rim, baço, cérebro e sangue após 21 dias de infeção. Na análise do pulmão, o perfil citocínico apresentou baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias, e observamos um aumento na expressão relativa dos marcadores de polarização para o perfil M2 (Arginase-1 e YM-1), em todo período analisado. Visto a capacidade reguladora do C. gattii sobre o sistema imunitário do hospedeiro, avaliamos o efeito da administração profilática de ArtinM sobre o curso dessa infecção. Ao longo de 42 dias de infecção, o grupo tratado com ArtinM apresentou uma redução da carga fúngica pulmonar nos dias 28 e 35 pós-infecção, e os níveis de IFN-?, IL-17 e TNF-? aumentaram significativamente no grupo ArtinM. Esse efeito imunomodulador da administração profilática de ArtinM sobre o modelo de infecção experimental por C. gattii levou-nos a avaliar o efeito da administração terapêutica de ArtinM no curso dessa infecção. Essa nova proposta de aplicação de ArtinM resultou na redução da carga fúngica pulmonar de C. gattii após 21 dias de infecção, comparado com o grupo controle. A administração terapêutica de ArtinM foi capaz de elevar o número absoluto de neutrófilos e linfócitos no sangue periférico dos animais infectados, porém os níveis de citocinas não diferiram entre os grupos ArtinM e controle. Além disso, o grupo tratado com ArtinM apresentou menor frequência de células T CD4+ no baço. Diante do efeito imunomodulador a administração profilática ou terapêutica de ArtinM que promoveu um controle parcial da infecção por C. gattii, partimos para a associação desse agente imunomodulador com o antifúngicoR e s u m o | viii Fluconazol. Verificamos que os animais tratados com ArtinM em associação com fluconazol também apresentaram uma redução da carga fúngica pulmonar em comparação ao grupo controle, indicando que ArtinM é passível de ser associada com a terapia convencional antifúngica. Portanto, nossos dados evidenciaram que a atividade imunomodulatória de ArtinM, através da administração profilática ou terapêutica, foi evidenciada no curso da infecção por C. gattii e favoreceu a imunidade do hospedeiro promovendo uma redução parcial da carga fúngica pulmonar / Invasive fungal diseases are a global public health problem, that affects millions of individuals each year. Among the species that cause these diseases, Cryptococcus gattii is a major because affects immunosuppressed and immunocompetent individuals. C. gattii regulates the differentiation of helper (Th) T cells 1 (Th1) and 17 (Th17) by attenuating the proinflammatory response in the lungs. We know that the immunomodulatory capacity of ArtinM to induce the Th1 and Th17 immune response through IL-12 production by antigen presenting cells (APCs) and the CD4+ T cells activation by direct effect of ArtinM, these activities of ArtinM promoted the control of P. brasiliensis and C. albicans infection. Thus, we investigated the effects of prophylactic or therapeutic administration of ArtinM in the control of C. gattii infection. We found that C. gattii infection rapidly increase in the lungs and disseminate to the heart, liver, kidney, spleen, brain and blood after 21 days of infection. In the lung analysis, the cytokine profile showed low levels of proinflammatory cytokines and we observed an increase in the relative expression of the polarization markers for the M2 macrophages (Arginase-1 and YM-1) for all period. Given the regulatory ability of C. gattii on the host immune response, we evaluated the effect of prophylactic administration of ArtinM on the course of C. gattii infection. During 42 days of infection, the ArtinM-treated group had a reduction in the pulmonary fungal burden on days 28 and 35 post-infection, and levels of IFN-?, IL-17 and TNF-? were significantly increased in the ArtinM group. This immunomodulatory effect of prophylactic administration of ArtinM on the C. gattii infection led us to evaluate the effect of the therapeutic administration of ArtinM on the course of this infection. This new strategy for the ArtinM administration promoted a reduction in the lung fungal burden of C. gattii after 21 days of infection compared to control group. Therapeutic administration of ArtinM was able to increase the absolute number of neutrophils and lymphocytes in the peripheral blood of infected mice, but the cytokine levels did not differ between the ArtinM and control groups. In addition, the ArtinM-treated group showed decrease of the CD4+ T cell frequency in the spleen. Considering the immunomodulatory effect, the prophylactic or therapeutic administration of ArtinM promoted a partial control of C. gattii infection, and instigate us to investigate the association of ArtinM and Fluconazole. We found that the treatment with ArtinM in combination with fluconazole also promoted a reduction in the pulmonary fungal burden, which suggested that ArtinM works well inA b s t r a c t | xi association with antifungal drugs. Therefore, our data showed that the immunomodulatory activity of ArtinM, via prophylactic or therapeutic administration, was evidenced in the course of C. gattii infection and contributed the host immune response to reduce the lung fungal burden