A levedura Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, doença que pode levar à infecção fatal no sistema nervoso central em humanos e outros mamíferos. A forma de infecção ocorre através da inalação de esporos fúngicos pelas vias aéreas superiores e atinge os pulmões dando início à formação de sítios de deposição fúngica (criptococoma). Os níveis de oxigênio nos criptococomas são reduzidos devido à diminuição da perfusão sanguínea no local, ocasionando hipóxia (0,5-5% oxigênio) ou anóxia (0% oxigênio). Nesses sítios, o fungo não só modula seu metabolismo energético de acordo com a disponibilidade de oxigênio como também de nutrientes que o tecido dispõe. O oxigênio molecular (O2) é essencial para a produção de trifosfato de adenosina (ATP) na respiração celular e nas vias bioquímicas relacionadas à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tirosina, esteróis e ácido nicotínico para a fosforilação oxidativa e processos biossintéticos. Desse modo, o oxigênio é um elemento essencial para a manutenção do patógeno aeróbico no hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar o efeito da hipóxia sobre a expressão global das proteínas de C. gattii. Para isso, a levedura foi cultivada em YNB líquido a 37ºC em concentração de O2 ajustada para 1% (V/V). As células foram coletadas em três tempos diferentes de hipóxia (0h-T0, 24h-T24 e 48h-T48) e as proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE. Cada canaleta do gel foi dividida em 9 frações, as quais foram submetidas à tripsinização. Os peptídeos eluídos foram separados por cromatografia líquida e analisados por espectrometria de massas. Foram consideradas identificações válidas as proteínas que apresentassem pelo menos 2 peptídeos únicos, nas quais aparecessem em no mínimo 2 replicatas biológicas. Nas condições analisadas, foi possível identificar 130 proteínas, tendo sido identificadas proteínas expressas somente em uma determinada condição (43 proteínas em T0, 14 em T24 e 13 em T48). Com os resultados proteômicos analisados, pôde-se observar que houve a regulação positiva ou negativa da expressão protéica de C. gattii na situação de hipóxia. Devido ao fato da hipóxia ocorrer comumente no ambiente da infecção fúngica, o remodelamento metabólico ao qual o fungo se submete é crucial para a sua proteção e manutenção in vitro ou no hospedeiro. Em análises fenotípicas realizadas neste trabalho, verificou-se que a hipóxia pode exercer influência no crescimento fúngico e na sua melanização, porém não foi possível verificar aumento na espessura da cápsula. Adicionalmente, observou-se modificações na regulação da expressão protéica nas vias metabólicas glicolítica, pentose-fosfato, glioxalato, ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa entre outras. Essa alteração entre as via metabólicas pode ser o resultado de uma compensação pela redução do aporte de oxigênio para dentro da célula fúngica. / The yeast Cryptococcus gattii is the etiologic agent of cryptococcosis, a disease that can led to fatal infection of the central nervous system in humans and other mammals. The form of infection occurs through inhalation of fungal spores through the upper airways and reaches the lungs initiating the formation sites of fungal deposition (crytococcoma). Cryptococcomas experience low oxygen levels in the lungs causing hypoxia (0.5-5 % oxygen) or anoxia (0 % oxygen). At these sites, the fungal cells not only modulates its energy metabolism according to the availability of oxygen but also to the nutrients that the tissue has. The molecular oxygen is essential for the production of adenosine triphosphate (ATP) in cell respiration and the biochemical pathways related to the biosynthesis of unsaturated fatty acids, tyrosine, sterols and nicotinic acid for oxidative phosphorylation and biosynthetic processes.Thus, oxygen is essential for the maintenance of aerobic pathogen in host environment. So, the aim of this study is to analyze the effect of hypoxia on the global expression of proteins of C. gattii. For that reason, yeast was grown in liquid YNB 37ºC with reduced O2 levels (1% - V/V). Cells were collected at three different periods of hypoxia (0h-T0, 24h-T24, 48h-T48) and the extracted proteins were separated by SDS-PAGE. Each gel lane was divided into 10 slices and digested with trypsin. The eluted peptides were separated by HPLC and analyzed by mass spectrometry. Only proteins identifications with at least 2 unique peptides and present in at least two biological replicates were considered true identifications. In the conditions analyzed, a total of 130 proteins could be identified, with several presenting the expression in specific conditions (fourty-three proteins in T0, fourteen in T24 and thirteen in T48). With the proteomic results analyzed, it was observed that there was a positive or negative regulation of protein expression of C. gattii in the situation of hypoxia. Because of hypoxia occur commonly in the environment fungal infection, metabolic remodeling to which the fungus undergoes is crucial for their protection and maintenance in vitro or in the host. The phenotypic analyzes showed that hypoxia can exert influence on fungal growth and their melanization, but this work did not observed increase in the thickness of the capsule. In addition, we observed changes in the regulation of protein expression, pentose-phosphate, glyoxylate, tricarboxylic acid, oxidative phosphorylation and other glycolytic pathways. This change between the metabolic pathway may be the result of a compensation for reduced oxygen supply into the fungal cell.

Os micronutrientes ferro e cobre possuem uma ampla distribuição na natureza e são utilizados por quase todos os organismos vivos. Em se tratando de patógenos, os mecanismos utilizados para a manutenção da homeostase desses metais possuem ligação com a expressão dos fatores de virulência e, por consequencia, auxiliam no estabelecimento do patógeno no hospedeiro e início da doença. Cryptococcus gattii é uma levedura encapsulada, que causa criptococose em indivíduos imunocompetentes e em animais. Essa espécie é responsável por um surto de criptococose nas ilhas Vancouver, Canadá, com altos índices de mortalidade e morbilidade registrados do ano de 1999 até o presente. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo o esclarecimento dos papéis envolvendo a homeostase de ferro e cobre no patógeno C. gattii. Para isto, foi realizada uma análise proteômica global e comparativa em células de C. gattii cultivadas sob presença/limitação de ferro e/ou cobre. Essa análise foi feita utilizando a metolodogia de identificação multidimensional de proteínas (MudPIT), associada ou não com géis bidimensionais (2D-GE). Nossos resultados demonstraram que o fungo C. gattii sofre alterações metabólicas, principalmente envolvendo funções mitocondriais, na ausência dos micronutrientes ferro ou cobre. As análises também mostraram que o fungo responde a privação desses micronutrientes por um aumento na atividade de proteases, o que poderia vir a ser uma regulação pós-traducional utilizada por esse patógeno para manter a homeostase desses metais. Adicionalmente, funções específicas desempenhadas pelo fungo na ausência de ferro ou cobre também foram identificadas. / Iron and copper have a ubiquitous distribution in living organisms; the competition for such between the host and pathogen is related with disease establishment. Cryptococcus gattii is an encapsulated yeast that causes cryptococcosis in immunocompetent individuals and animals. This pathogen is responsible for an ongoing outbreak in Vancouver Island, Canada, which has substancial mortality and morbidity rates. In this context, the aim of this work was to clarify the mechanisms involved in the maintenance of iron and copper homeostasis in C. gattii. To accomplish that, a global and comparative proteomic analyses were performed in C. gattii cells grown in replete/depleted iron and/or copper conditions. For these analysis was used the multidimensional protein identification technology (MudPIT) associated, or not, with twodimensional gels (2D-GE). Our results demonstrated metabolic alterations in response to iron and copper deprivation in C. gattii, mainly associated with mitochondrial functions. The results also showed a high protease activity in cells of C. gattii grown in iron and copper deprivation in comparison with control. This might be a posttranslational regulation developed by C. gattii to maintain metal homeostasis. In addition, specific functions related to iron and to copper control were identified.

As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose. A infecção se desenvolve via inalação e disseminação até o sistema nervoso central, causando lesões pulmonares e meningoencefalite, a principal causa de morte da criptococose. Estes fungos patogênicos causam aproximadamente um milhão de casos por ano, principalmente entre pacientes imunocomprometidos, resultando em aproximadamente 625.000 mortes. O tratamento da criptococose emprega altas doses dos fármacos anfotericina B e 5-flucitosina, seguido de longa monoterapia com fluconazol. Este tratamento é caracterizado pela nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Além destes efeitos tóxicos, o surgimento de linhagens resistentes a estes compostos leva à necessidade de novas estratégias terapêuticas, dentre as quais podem ser citadas moléculas obtidas de fontes vegetais. O composto natural plumieridina, extraído de Allamanda polyantha (uma planta nativa brasileira), possui atividade antifúngica. Com o objetivo de elucidar as bases moleculares desta atividade, uma biblioteca de mutantes de C. gattii obtida por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi triada utilizando distintas concentrações deste composto, tendo como referencial o valor de MIC para a linhagem selvagem de C. gattii. Foram encontrados dez mutantes sensíveis e um mutante resistente a plumieridina e os fatores de virulência clássicos foram avaliados. A identificação dos genes inativados pelo T-DNA revelou o possível envolvimento de algumas proteínas no mecanismo molecular de plumieridina, tais como lisofosfolipídeo aciltransferase, transportador de colina, protease rhomboide, transportador de arsenito ATPase, proteína BAG e subunidade N6 do complexo regulatório 26S proteasoma. Estas proteínas estão relacionadas com diferentes processos biológicos ligados a via de sinalização Unfolded Protein Response (UPR). Esses resultados indicam um complexo processo celular desencadeado por estresse de retículo endoplasmático, afetando indiretamente várias vias, o que sugere um novo mecanismo de ação para um fármaco antifúngico em potencial. / The basidiomycete yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis. The infection proceeds via inhalation and dissemination of yeast cells to the central nervous system, causing lung injury and meningoencephalitis, which is the major cause of death on cryptococcosis. These fungal pathogens cause one million cases per year among immunocompromised patients mainly, resulting in nearly 625,000 deaths. The treatment of cryptococcosis uses high doses of amphotericin B and 5-flucytoseine, followed by long fluconazole monotherapy. This regime is characterized by nephrotoxicity and hepatotoxicity. In addition to these toxic effects, the emergence of strains resistant to these compounds leads to the need of new therapeutic strategies, among which molecules obtained from plant sources. The natural compound plumieridine, extract from Allamanda polyantha (a Brazillian native plant), has antifungal activity. In order to elucidate the molecular basis of plumieridine antifungal activity, a C. gattii mutant library obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was screened using distinct plumieridine concentrations based on MIC value for C. gattii wild type. One resistant and ten susceptible mutants were found and the classical virulence factors were evaluated. The genome-wide screening revealed the possible involvement of some proteins in molecular mechanisms of plumieridine, such as lysophospholipid acyltransferase, choline transporter, rhomboid protease, arsenite transporting ATPase, BAG Protein and 26S proteasome regulatory subunit N6. These proteins are related with different biological process linked to Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway. This result suggests a complex cell process triggered by endoplasmic reticulum stress with many pathways indirectly affected by plumieridine, displaying a novel mechanism of action in a potential antifungal agent.

Processos celulares, incluindo crescimento celular, transporte de organelas, endocitose, exocitose e citocinese requerem um citoesqueleto intacto. A tropomiosina (Tpm1) é uma proteína dimérica de citoesqueleto altamente conservada, que forma polímeros que se associam aos filamentos de F-actina em células musculares e não musculares. Essa ligação estabiliza os filamentos de actina evitando a despolimerização por outros fatores. Assim, a tropomiosina desempenha um papel fundamental na integridade celular e também permite que processos como secreção, localização e função de muitas proteínas sejam exercidas, de acordo com a demanda celular exigida em diferentes situações. Em leveduras, Tpm1 participa da manutenção destes processos, assim como na integridade celular e morfologia da célula. Neste estudo, uma análise do gene que codifica para tropomiosina e a funcionalidade do produto codificado por ele foi realizada para a levedura Cryptococcus gattii. Foi realizada a construção de uma linhagem mutante de tropomiosina, que revelou que Tpm1 está envolvida na formação da cápsula polissacarídica, morfologia e virulência do fungo. Mutação no gene de Tpm1 leva a alterações no citoesqueleto celular, crescimento e morfologia, e, defeitos de citocinese. Estes resultados indicam um papel crucial para Tpm1 na formação de cápsula polissacarídica, morfologia e virulência de C. gattii. / Cellular processes including cell growth, organelle transport, endocytosis, exocytosis and cytokinesis require an intact cytoskeleton. Tropomyosin (Tpm1) is a dimeric protein of the highly conserved cytoskeleton forming polymers which are associated with the F-actin filaments in muscle and non-muscle cells. This binding stabilizes actin filaments preventing depolymerization by other factors. Thus, tropomyosin plays a key role in cellular integrity and also allows processes such as secretion, localization and function of many proteins to be performed according to the required cellular demand in different situations. In yeasts, Tpm1 participates in the integrity of these processes, cell integrity and cell morphology. Tropomyosin also plays an important role in the secretion, localization, and function of many proteins, in fungi. In this study we performed a construction of a Cryptococcus gattii tropomyosin mutant strain, which revealed that disruption of C. gattii tropomyosin gene leads to changes in cytoeskeleton, abnormal growth and morphology, defective cell separation, assembly of the polysaccharide capsule and virulence. Taken together, these results indicate a central role for Tpm1 in the assembly of the polysaccharide capsule, morphology and virulence of C. gattii.

O fungo patogênico Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococcose, uma doença fatal que envolve a formação de criptococomas nos pulmões e cérebro em hospedeiros imunocompetentes. O monitoramento da patogênese de C. gattii e sua colonização nos diferentes órgãos em modelos animais geralmente são analisados pelo método laborioso e impreciso de contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Neste trabalho foi desenvolvido um modelo prático de monitoramento da infecção e da eficácia de tratamentos antifúngicos, através da construção de uma linhagem de C. gattii expressando constitutivamente o gene repórter mCherry e da avaliação por imagem baseada em fluorescência. Após a infecção intranasal de camundongos e do tratamento com anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLC) durante 4 a 7 dias, pulmões, rins, baço e o cérebro foram removidos e examinados em IVIS Lumina, e a infecção foi monitorada pelo método tradicional de contagem de UFC. As análises por imagem demonstraram a predileção de C. gattii pelo trato respiratório, com presença reduzida no sistema nervoso central. Estas observações foram consistentes com as obtidas pela determinação de UFC. As análises por imagem e a determinação por UFC corroboraram os resultados relativos aos efeitos do tratamento com FLC. Entretanto, os dados foram significativamente diferentes quando AMB foi utilizada. Os resultados obtidos sugerem esta técnica como um potencial método para a investigação da dinâmica da infecção e da sua resposta a tratamentos terapêuticos. / The pathogenic fungus Cryptococcus gattii is one of the etiological agents of human cryptococcosis, which may evolve to the formation of cryptococcomas in the lungs and brain of immunocompetent hosts. Monitoring the progression of pathogenesis and organ colonization in animal models is important in the study of infectious microorganisms. However, this monitoring usually involves laborious and imprecise methods, such as colony forming unit (CFU) determination. Here, we propose the use of a practical model to monitor C. gattii infections in mice and to evaluate antifungal treatment. Our approach involved the infection of mice with a C. gattii strain that constitutively expresses the mCherry reporter gene, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. gattii strain and treated with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLC) for 4 or 7 days. The lungs, kidney, spleen, and brain were excised and examined in an IVIS Lumina instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analyses showed that C. gattii primarily colonizes the respiratory tract, with reduced dissemination to the central nervous system. This observation was consistent with the results of CFU determination. The evaluation of the effects of fluconazole treatment in infected mice revealed that both imaging and CFU methods produced similar results. However, the results of the two methods were considerably different when the effects of AMB were evaluated. Our results support the use of imaging-based techniques to monitor infections caused by C. gattii in mice, as well as the response of animal hosts to treatment with antifungals.

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética que possui uma cápsula polissacarídica robusta e é um dos agentes etiológicos da criptococose. A linhagem R265 de C. gattii foi responsável pelo surto de criptococose na Ilha de Vancouver e há vários estudos indicando sua dispersão e ocupação de novos nichos ecológicos. Fatores de virulência bem caracterizados deste patógeno incluem: a capacidade de sintetizar o pigmento antioxidante melanina, a produção de uma cápsula polissacarídica antifagocíticas e a capacidade de sobreviver e proliferar a 37°C. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi identificar proteínas envolvidas na resposta da linhagem R265 de C. gattii à variação de temperatura experimentada quando o fungo deixa o ambiente para sobreviver no hospedeiro, usando análise in vitro e proteômica comparativa. Nossos dados demonstram que as proteínas com expressão aumentada a 25°C atuam principalmente em processos metabólicos de proteínas, carboidratos, lípidios, ácidos orgânicos e aminoácidos e que as proteínas com expressão aumentada a 37°C, em sua maior parte, participam de processos que incluem fosforilação, metilação, processos catabólicos de corpos cetônicos, GTP e ATP e processos metabólicos de nucleosidios. A diferença mais notável entre as condições testadas é a predominância, no desenvolvimento de C. gattii a 25°C, de proteínas envolvidas em processos de oxirredução e a presença de um número considerável de proteínas envolvidas na resposta ao stress e em processos catabólicos no desenvolvimento a 37°C. Em suma, o presente estudo é a primeira análise proteômica a fornecer informação sobre proteínas reguladas pela variação de temperatura e a primeira descrição da resposta da linhagem hipervirulenta R265 de C. gattii à esta condição. As proteínas identificadas podem ser alvos para novos estudos na identificação de proteínas-chave para o desenvolvimento do fungo a 37°C e para a pesquisa de biomarcadores que podem contribuir para o tratamento e prevenção da criptococose causada por este patógeno. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast which has a robust polysaccharide capsule and is one of the etiological agents of cryptococcosis. The R265 strain of C. gattii was responsible for the Vancouver Island outbreak and there are various studies including their dispersal and occupation of new ecological niches. Well-characterized virulence factors of this pathogen include: the ability to synthesize the antioxidant pigment melanin; the production of an antiphagocytic polysaccharide capsule; and the ability to survive and proliferate at 37°C. In this sense, the objective of this study was identified proteins involved in the response of C. gattii strain R265 to the temperature variation experimented when the fungi leaves the environment to survive in the host, using in vitro analysis and comparative proteomics. Our data demonstrated that the proteins up-regulated at 25°C act mainly in protein, carbohydrate, lipid, organic acid and amino acid metabolic processes and proteins up-regulated at 37°C participate mostly in processes that include phosphorylation, methylation, ketone body, GTP and ATP catabolic process and nucleoside metabolic process. The most striking difference between the conditions tested is the prevalence of proteins involved in oxidation-reduction in C. gattii growth at 25°C and the presence of a relevant number of proteins involved in stress response and catabolic process in C. gattii growth at 37°C. In brief, this study is the first proteomic analysis to provided information about proteins regulated by the infection temperature and the first description of the response of C. gattii high virulent strain R265 to this condition. The proteins identified could be targets to further studies for the identification of key proteins for the development at 37°C and to the search for biomarkers that can contribute to the treatment and prevention of cryptococcosis caused by this pathogen.

Processos celulares, incluindo crescimento celular, transporte de organelas, endocitose, exocitose e citocinese requerem um citoesqueleto intacto. A tropomiosina (Tpm1) é uma proteína dimérica de citoesqueleto altamente conservada, que forma polímeros que se associam aos filamentos de F-actina em células musculares e não musculares. Essa ligação estabiliza os filamentos de actina evitando a despolimerização por outros fatores. Assim, a tropomiosina desempenha um papel fundamental na integridade celular e também permite que processos como secreção, localização e função de muitas proteínas sejam exercidas, de acordo com a demanda celular exigida em diferentes situações. Em leveduras, Tpm1 participa da manutenção destes processos, assim como na integridade celular e morfologia da célula. Neste estudo, uma análise do gene que codifica para tropomiosina e a funcionalidade do produto codificado por ele foi realizada para a levedura Cryptococcus gattii. Foi realizada a construção de uma linhagem mutante de tropomiosina, que revelou que Tpm1 está envolvida na formação da cápsula polissacarídica, morfologia e virulência do fungo. Mutação no gene de Tpm1 leva a alterações no citoesqueleto celular, crescimento e morfologia, e, defeitos de citocinese. Estes resultados indicam um papel crucial para Tpm1 na formação de cápsula polissacarídica, morfologia e virulência de C. gattii. / Cellular processes including cell growth, organelle transport, endocytosis, exocytosis and cytokinesis require an intact cytoskeleton. Tropomyosin (Tpm1) is a dimeric protein of the highly conserved cytoskeleton forming polymers which are associated with the F-actin filaments in muscle and non-muscle cells. This binding stabilizes actin filaments preventing depolymerization by other factors. Thus, tropomyosin plays a key role in cellular integrity and also allows processes such as secretion, localization and function of many proteins to be performed according to the required cellular demand in different situations. In yeasts, Tpm1 participates in the integrity of these processes, cell integrity and cell morphology. Tropomyosin also plays an important role in the secretion, localization, and function of many proteins, in fungi. In this study we performed a construction of a Cryptococcus gattii tropomyosin mutant strain, which revealed that disruption of C. gattii tropomyosin gene leads to changes in cytoeskeleton, abnormal growth and morphology, defective cell separation, assembly of the polysaccharide capsule and virulence. Taken together, these results indicate a central role for Tpm1 in the assembly of the polysaccharide capsule, morphology and virulence of C. gattii.

O fungo patogênico Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococcose, uma doença fatal que envolve a formação de criptococomas nos pulmões e cérebro em hospedeiros imunocompetentes. O monitoramento da patogênese de C. gattii e sua colonização nos diferentes órgãos em modelos animais geralmente são analisados pelo método laborioso e impreciso de contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Neste trabalho foi desenvolvido um modelo prático de monitoramento da infecção e da eficácia de tratamentos antifúngicos, através da construção de uma linhagem de C. gattii expressando constitutivamente o gene repórter mCherry e da avaliação por imagem baseada em fluorescência. Após a infecção intranasal de camundongos e do tratamento com anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLC) durante 4 a 7 dias, pulmões, rins, baço e o cérebro foram removidos e examinados em IVIS Lumina, e a infecção foi monitorada pelo método tradicional de contagem de UFC. As análises por imagem demonstraram a predileção de C. gattii pelo trato respiratório, com presença reduzida no sistema nervoso central. Estas observações foram consistentes com as obtidas pela determinação de UFC. As análises por imagem e a determinação por UFC corroboraram os resultados relativos aos efeitos do tratamento com FLC. Entretanto, os dados foram significativamente diferentes quando AMB foi utilizada. Os resultados obtidos sugerem esta técnica como um potencial método para a investigação da dinâmica da infecção e da sua resposta a tratamentos terapêuticos. / The pathogenic fungus Cryptococcus gattii is one of the etiological agents of human cryptococcosis, which may evolve to the formation of cryptococcomas in the lungs and brain of immunocompetent hosts. Monitoring the progression of pathogenesis and organ colonization in animal models is important in the study of infectious microorganisms. However, this monitoring usually involves laborious and imprecise methods, such as colony forming unit (CFU) determination. Here, we propose the use of a practical model to monitor C. gattii infections in mice and to evaluate antifungal treatment. Our approach involved the infection of mice with a C. gattii strain that constitutively expresses the mCherry reporter gene, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. gattii strain and treated with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLC) for 4 or 7 days. The lungs, kidney, spleen, and brain were excised and examined in an IVIS Lumina instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analyses showed that C. gattii primarily colonizes the respiratory tract, with reduced dissemination to the central nervous system. This observation was consistent with the results of CFU determination. The evaluation of the effects of fluconazole treatment in infected mice revealed that both imaging and CFU methods produced similar results. However, the results of the two methods were considerably different when the effects of AMB were evaluated. Our results support the use of imaging-based techniques to monitor infections caused by C. gattii in mice, as well as the response of animal hosts to treatment with antifungals.

O complexo Cryptococcus possui 37 espécies descritas, das quais se destacam C. neoformans e C. gattii devido a sua capacidade de causar doença tanto em humanos como animais. A fim de se prevenir de organismos patogênicos, o hospedeiro pode reduzir a disponibilidade de nutrientes em um processo conhecido como imunidade nutricional. Além disso, é bem descrito o papel central de metais essenciais em relação à expressão dos fatores de virulência nas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus. MicroRNAs (miRNAs) são importantes mediadores da expressão gênica em resposta a estresses, incluindo privação de metais ou toxicidade causada pelos mesmos. Entretanto, pouco é conhecido sobre expressão de miRNAs ou miRNAs-like em C. gattii. Portanto, o objetivo desde trabalho foi determinar o perfil miRNAs ou miRNAs-like produzidos por C. gattii durante privação de ferro e privação de zinco. Células de C. gattii R265 foram cultivadas em três condições: privação de zinco, privação de ferro e condição controle. As sequências dos pequenos RNAs foram obtidas por RNA-Seq. A fim de identificar miRNAs em C. gattii, as sequências não redundantes foram alinhadas às sequências dos genomas das linhagens de C. gattii R265 e WM276. Foi realizada a predição de miRNAs ou microRNA-like com ferramentas de bioinformática que resultou em 31 possíveis miRNAs na linhagem R265 e 26 na linhagem WM276, respectivamente. Análises in silico da expressão diferencial dos miRNAs mostraram que a maioria está presente nas três condições, ao passo que apenas dois estão presentes apenas nas condições de privação de metais. Desta forma, estes miRNAs-like podem estar exercendo algum papel importante na homeostase de metais em resposta a condições que mimetizam o ambiente de infecção. Visto que a linhagem R265 de C. gattii não possui um gene codificador da proteína Argonauta, a qual desempenha um papel central na via de RNA de interferência (RNAi), esta via possivelmente não seria responsável pelo silenciamento de outros genes. Levanta-se a hipótese que estes miRNAs-like poderiam ser exportados da célula e, então, modular a expressão gênica no hospedeiro. Esta análise foi iniciada pela avaliação de possíveis alvos expressos pelos genomas de camundongo e humano. Alguns destes alvos mostraram relação com a resposta imune nos hospedeiros. Esta identificação deve esclarecer o papel desenvolvido por miRNAs na regulação da expressão gênica na interação patógeno-hospedeiro. / The Cryptococcus complex has 37 species described, from which C. neoformans and C. gattii stand out for their ability to cause disease in humans and animals. To prevent infection with pathogenic microorganisms, host may reduce the availability of nutrients in a process known as nutritional immunity. Furthermore, it is well described that essential metals have central roles related to the regulation of expression of virulence factors in pathogenic Cryptococcus species. MicroRNAs (miRNAs) are important mediators of gene expression in response to several stresses, including metal deprivation or toxicity. However, little is known about microRNAs or miRNAs-like expression in C. gattii. Therefore, the aim of this work was to profile miRNAs produced by C. gattii during iron and zinc deprivation. C. gattii R265 cells were incubated in three conditions: zinc deprivation, iron deprivation and control condition. The sequences of small RNAs were obtained by RNA-Seq. To identify miRNAs or miRNAs-like in C. gattii, non-redundant reads were aligned to sequences of C. gattii R265 and WM276 strains genomes. MiRNAs prediction was and resulted in 31 possible miRNAs in R265 strain and 26 in WM276 strain, respectively. In silico analysis of miRNAs differential expression showed that the majority of them are present in the three conditions, while two are present only in metal deprivation. Thereby, these miRNAs-like may be exerting some important role at metal homeostasis in response to infection environment mimicry conditions. As the C. gattii R265 strain does not have an Argonaut encoding gene, the protein that plays a central role in the RNA interference (RNAi) pathway, we assumed that probably this pathway would not be responsible for silencing of others genes. We hypothesized that these miRNAs-like could be exported and modulate the gene expression in host cells. This analysis was initialized by evaluating the potential targets expressed by human and mouse genome. Some of these targets were related to immune response in the host. This identification should clarify the role played by miRNAs in the regulation of gene expression in the host-pathogen interaction.

A levedura Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, doença que pode levar à infecção fatal no sistema nervoso central em humanos e outros mamíferos. A forma de infecção ocorre através da inalação de esporos fúngicos pelas vias aéreas superiores e atinge os pulmões dando início à formação de sítios de deposição fúngica (criptococoma). Os níveis de oxigênio nos criptococomas são reduzidos devido à diminuição da perfusão sanguínea no local, ocasionando hipóxia (0,5-5% oxigênio) ou anóxia (0% oxigênio). Nesses sítios, o fungo não só modula seu metabolismo energético de acordo com a disponibilidade de oxigênio como também de nutrientes que o tecido dispõe. O oxigênio molecular (O2) é essencial para a produção de trifosfato de adenosina (ATP) na respiração celular e nas vias bioquímicas relacionadas à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tirosina, esteróis e ácido nicotínico para a fosforilação oxidativa e processos biossintéticos. Desse modo, o oxigênio é um elemento essencial para a manutenção do patógeno aeróbico no hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar o efeito da hipóxia sobre a expressão global das proteínas de C. gattii. Para isso, a levedura foi cultivada em YNB líquido a 37ºC em concentração de O2 ajustada para 1% (V/V). As células foram coletadas em três tempos diferentes de hipóxia (0h-T0, 24h-T24 e 48h-T48) e as proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE. Cada canaleta do gel foi dividida em 9 frações, as quais foram submetidas à tripsinização. Os peptídeos eluídos foram separados por cromatografia líquida e analisados por espectrometria de massas. Foram consideradas identificações válidas as proteínas que apresentassem pelo menos 2 peptídeos únicos, nas quais aparecessem em no mínimo 2 replicatas biológicas. Nas condições analisadas, foi possível identificar 130 proteínas, tendo sido identificadas proteínas expressas somente em uma determinada condição (43 proteínas em T0, 14 em T24 e 13 em T48). Com os resultados proteômicos analisados, pôde-se observar que houve a regulação positiva ou negativa da expressão protéica de C. gattii na situação de hipóxia. Devido ao fato da hipóxia ocorrer comumente no ambiente da infecção fúngica, o remodelamento metabólico ao qual o fungo se submete é crucial para a sua proteção e manutenção in vitro ou no hospedeiro. Em análises fenotípicas realizadas neste trabalho, verificou-se que a hipóxia pode exercer influência no crescimento fúngico e na sua melanização, porém não foi possível verificar aumento na espessura da cápsula. Adicionalmente, observou-se modificações na regulação da expressão protéica nas vias metabólicas glicolítica, pentose-fosfato, glioxalato, ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa entre outras. Essa alteração entre as via metabólicas pode ser o resultado de uma compensação pela redução do aporte de oxigênio para dentro da célula fúngica. / The yeast Cryptococcus gattii is the etiologic agent of cryptococcosis, a disease that can led to fatal infection of the central nervous system in humans and other mammals. The form of infection occurs through inhalation of fungal spores through the upper airways and reaches the lungs initiating the formation sites of fungal deposition (crytococcoma). Cryptococcomas experience low oxygen levels in the lungs causing hypoxia (0.5-5 % oxygen) or anoxia (0 % oxygen). At these sites, the fungal cells not only modulates its energy metabolism according to the availability of oxygen but also to the nutrients that the tissue has. The molecular oxygen is essential for the production of adenosine triphosphate (ATP) in cell respiration and the biochemical pathways related to the biosynthesis of unsaturated fatty acids, tyrosine, sterols and nicotinic acid for oxidative phosphorylation and biosynthetic processes.Thus, oxygen is essential for the maintenance of aerobic pathogen in host environment. So, the aim of this study is to analyze the effect of hypoxia on the global expression of proteins of C. gattii. For that reason, yeast was grown in liquid YNB 37ºC with reduced O2 levels (1% - V/V). Cells were collected at three different periods of hypoxia (0h-T0, 24h-T24, 48h-T48) and the extracted proteins were separated by SDS-PAGE. Each gel lane was divided into 10 slices and digested with trypsin. The eluted peptides were separated by HPLC and analyzed by mass spectrometry. Only proteins identifications with at least 2 unique peptides and present in at least two biological replicates were considered true identifications. In the conditions analyzed, a total of 130 proteins could be identified, with several presenting the expression in specific conditions (fourty-three proteins in T0, fourteen in T24 and thirteen in T48). With the proteomic results analyzed, it was observed that there was a positive or negative regulation of protein expression of C. gattii in the situation of hypoxia. Because of hypoxia occur commonly in the environment fungal infection, metabolic remodeling to which the fungus undergoes is crucial for their protection and maintenance in vitro or in the host. The phenotypic analyzes showed that hypoxia can exert influence on fungal growth and their melanization, but this work did not observed increase in the thickness of the capsule. In addition, we observed changes in the regulation of protein expression, pentose-phosphate, glyoxylate, tricarboxylic acid, oxidative phosphorylation and other glycolytic pathways. This change between the metabolic pathway may be the result of a compensation for reduced oxygen supply into the fungal cell.