A levedura Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, doença que pode levar à infecção fatal no sistema nervoso central em humanos e outros mamíferos. A forma de infecção ocorre através da inalação de esporos fúngicos pelas vias aéreas superiores e atinge os pulmões dando início à formação de sítios de deposição fúngica (criptococoma). Os níveis de oxigênio nos criptococomas são reduzidos devido à diminuição da perfusão sanguínea no local, ocasionando hipóxia (0,5-5% oxigênio) ou anóxia (0% oxigênio). Nesses sítios, o fungo não só modula seu metabolismo energético de acordo com a disponibilidade de oxigênio como também de nutrientes que o tecido dispõe. O oxigênio molecular (O2) é essencial para a produção de trifosfato de adenosina (ATP) na respiração celular e nas vias bioquímicas relacionadas à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tirosina, esteróis e ácido nicotínico para a fosforilação oxidativa e processos biossintéticos. Desse modo, o oxigênio é um elemento essencial para a manutenção do patógeno aeróbico no hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar o efeito da hipóxia sobre a expressão global das proteínas de C. gattii. Para isso, a levedura foi cultivada em YNB líquido a 37ºC em concentração de O2 ajustada para 1% (V/V). As células foram coletadas em três tempos diferentes de hipóxia (0h-T0, 24h-T24 e 48h-T48) e as proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE. Cada canaleta do gel foi dividida em 9 frações, as quais foram submetidas à tripsinização. Os peptídeos eluídos foram separados por cromatografia líquida e analisados por espectrometria de massas. Foram consideradas identificações válidas as proteínas que apresentassem pelo menos 2 peptídeos únicos, nas quais aparecessem em no mínimo 2 replicatas biológicas. Nas condições analisadas, foi possível identificar 130 proteínas, tendo sido identificadas proteínas expressas somente em uma determinada condição (43 proteínas em T0, 14 em T24 e 13 em T48). Com os resultados proteômicos analisados, pôde-se observar que houve a regulação positiva ou negativa da expressão protéica de C. gattii na situação de hipóxia. Devido ao fato da hipóxia ocorrer comumente no ambiente da infecção fúngica, o remodelamento metabólico ao qual o fungo se submete é crucial para a sua proteção e manutenção in vitro ou no hospedeiro. Em análises fenotípicas realizadas neste trabalho, verificou-se que a hipóxia pode exercer influência no crescimento fúngico e na sua melanização, porém não foi possível verificar aumento na espessura da cápsula. Adicionalmente, observou-se modificações na regulação da expressão protéica nas vias metabólicas glicolítica, pentose-fosfato, glioxalato, ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa entre outras. Essa alteração entre as via metabólicas pode ser o resultado de uma compensação pela redução do aporte de oxigênio para dentro da célula fúngica. / The yeast Cryptococcus gattii is the etiologic agent of cryptococcosis, a disease that can led to fatal infection of the central nervous system in humans and other mammals. The form of infection occurs through inhalation of fungal spores through the upper airways and reaches the lungs initiating the formation sites of fungal deposition (crytococcoma). Cryptococcomas experience low oxygen levels in the lungs causing hypoxia (0.5-5 % oxygen) or anoxia (0 % oxygen). At these sites, the fungal cells not only modulates its energy metabolism according to the availability of oxygen but also to the nutrients that the tissue has. The molecular oxygen is essential for the production of adenosine triphosphate (ATP) in cell respiration and the biochemical pathways related to the biosynthesis of unsaturated fatty acids, tyrosine, sterols and nicotinic acid for oxidative phosphorylation and biosynthetic processes.Thus, oxygen is essential for the maintenance of aerobic pathogen in host environment. So, the aim of this study is to analyze the effect of hypoxia on the global expression of proteins of C. gattii. For that reason, yeast was grown in liquid YNB 37ºC with reduced O2 levels (1% - V/V). Cells were collected at three different periods of hypoxia (0h-T0, 24h-T24, 48h-T48) and the extracted proteins were separated by SDS-PAGE. Each gel lane was divided into 10 slices and digested with trypsin. The eluted peptides were separated by HPLC and analyzed by mass spectrometry. Only proteins identifications with at least 2 unique peptides and present in at least two biological replicates were considered true identifications. In the conditions analyzed, a total of 130 proteins could be identified, with several presenting the expression in specific conditions (fourty-three proteins in T0, fourteen in T24 and thirteen in T48). With the proteomic results analyzed, it was observed that there was a positive or negative regulation of protein expression of C. gattii in the situation of hypoxia. Because of hypoxia occur commonly in the environment fungal infection, metabolic remodeling to which the fungus undergoes is crucial for their protection and maintenance in vitro or in the host. The phenotypic analyzes showed that hypoxia can exert influence on fungal growth and their melanization, but this work did not observed increase in the thickness of the capsule. In addition, we observed changes in the regulation of protein expression, pentose-phosphate, glyoxylate, tricarboxylic acid, oxidative phosphorylation and other glycolytic pathways. This change between the metabolic pathway may be the result of a compensation for reduced oxygen supply into the fungal cell.

A expressão de determinantes de virulência por um patógeno é amplamente controlada pelo ambiente encontrado no hospedeiro. Neste contexto, a descrição de genes essenciais para o processo de interação patógeno-hospedeiro é fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos de virulência utilizados durante a infecção. Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que causa meningite em pacientes imunocomprometidos. A pandemia de AIDS contribuiu significativamente para o aumento das pesquisas científicas relacionadas à biologia de C. neoformans. Estudos funcionais de três genes deste patógeno, VCX1, GAT1, e GRASP, envolvidos, respectivamente, no transporte de cálcio (Ca2+), no metabolismo de nitrogênio e no processo de secreção não convencional são apresentados e discutidos na presente Tese. A habilidade de desevolvimento a 37°C é um fator de virulência essencial de C. neoformans, o qual é controlado por uma via de sinalização regulada por Ca2+ e calcineurina. O gene VCX1 de C. neoformans codifica um transportador de cálcio vacuolar, requerido para o desenvolvimento intracelular em macrófagos e para a virulência em camundongos. O fator de transcrição Gat1 de C. neoformans regula a expressão de genes sensíveis ao processo de repressão catabólica por nitrogênio (NCR). Genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, metabolismo de ferro, integridade da parede celular e síntese da cápsula também são regulados por Gat1. Entretanto, este fator de transcrição não é necessário para a sobrevivência durante a interação com macrófagos e para a virulência em modelo de infecção experimental. Uma estratégia de virulência essencial de C. neoformans é a secreção de glicuronoxilomanana (GXM), um polissacarídeo capsular com propriedades imuno-modulatórias. Nossos resultados demonstram que GRASP (golgi reassembly and stacking protein) está envolvida na secreção de GXM, formação da cápsula e virulência em C. neoformans. É importante ressaltar que o transportador de cálcio Vcx1 e o fator de transcrição Gat1 também participam do processo de secreção deste polissacarídeo, o que representa a sua complexidade em C. neoformans. / The expression of pathogen virulence determinants is highly controlled by the host milieu. In this context, the description of crucial genes for hostpathogen interaction is fundamental to better understand the virulence mechanisms utilized during infection. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast, that causes a life-threatening meningoencephalitis in immunocompromised individuals. The AIDS pandemic has contributed significantly to the increase of scientific research concerning the C. neoformans biology. Functional analyses of three genes, VCX1, GAT1, and GRASP, related to calcium (Ca2+) transport, nitrogen metabolism and unconventional secretion in C. neoformans, respectively, are presented and discussed in this thesis. The ability to survive and proliferate at the human body temperature is an essential virulence attribute of this pathogen. This trait is controlled in part by the Ca2+- calcineurin pathway, which senses and utilizes cytosolic calcium for signaling. C. neoformans VCX1 gene encodes a vacuolar calcium exchanger, which is required for intracellular growth in macrophages and for full virulence in mice. The C. neoformans transcription factor Gat1 regulates the expression of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis are also Gat1-regulated in C. neoformans. However, Gat1 is not required for survival during macrophage infection and for virulence in a mice model of cryptococcosis. One essential virulence strategy of C. neoformans is the release of glucuronoxylomannan (GXM), a capsular immune-modulatory polysaccharide. Our results demonstrate that GRASP, a golgi reassembly and stacking protein, is involved in GXM secretion, capsule formation and virulence in C. neoformans. Interestingly, the vacuolar calcium exchanger Vcx1 and the transcription factor Gat1 are also involved in GXM secretion, which represents the complexity of this important process in C. neoformans.

As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose. A infecção se desenvolve via inalação e disseminação até o sistema nervoso central, causando lesões pulmonares e meningoencefalite, a principal causa de morte da criptococose. Estes fungos patogênicos causam aproximadamente um milhão de casos por ano, principalmente entre pacientes imunocomprometidos, resultando em aproximadamente 625.000 mortes. O tratamento da criptococose emprega altas doses dos fármacos anfotericina B e 5-flucitosina, seguido de longa monoterapia com fluconazol. Este tratamento é caracterizado pela nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Além destes efeitos tóxicos, o surgimento de linhagens resistentes a estes compostos leva à necessidade de novas estratégias terapêuticas, dentre as quais podem ser citadas moléculas obtidas de fontes vegetais. O composto natural plumieridina, extraído de Allamanda polyantha (uma planta nativa brasileira), possui atividade antifúngica. Com o objetivo de elucidar as bases moleculares desta atividade, uma biblioteca de mutantes de C. gattii obtida por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi triada utilizando distintas concentrações deste composto, tendo como referencial o valor de MIC para a linhagem selvagem de C. gattii. Foram encontrados dez mutantes sensíveis e um mutante resistente a plumieridina e os fatores de virulência clássicos foram avaliados. A identificação dos genes inativados pelo T-DNA revelou o possível envolvimento de algumas proteínas no mecanismo molecular de plumieridina, tais como lisofosfolipídeo aciltransferase, transportador de colina, protease rhomboide, transportador de arsenito ATPase, proteína BAG e subunidade N6 do complexo regulatório 26S proteasoma. Estas proteínas estão relacionadas com diferentes processos biológicos ligados a via de sinalização Unfolded Protein Response (UPR). Esses resultados indicam um complexo processo celular desencadeado por estresse de retículo endoplasmático, afetando indiretamente várias vias, o que sugere um novo mecanismo de ação para um fármaco antifúngico em potencial. / The basidiomycete yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis. The infection proceeds via inhalation and dissemination of yeast cells to the central nervous system, causing lung injury and meningoencephalitis, which is the major cause of death on cryptococcosis. These fungal pathogens cause one million cases per year among immunocompromised patients mainly, resulting in nearly 625,000 deaths. The treatment of cryptococcosis uses high doses of amphotericin B and 5-flucytoseine, followed by long fluconazole monotherapy. This regime is characterized by nephrotoxicity and hepatotoxicity. In addition to these toxic effects, the emergence of strains resistant to these compounds leads to the need of new therapeutic strategies, among which molecules obtained from plant sources. The natural compound plumieridine, extract from Allamanda polyantha (a Brazillian native plant), has antifungal activity. In order to elucidate the molecular basis of plumieridine antifungal activity, a C. gattii mutant library obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was screened using distinct plumieridine concentrations based on MIC value for C. gattii wild type. One resistant and ten susceptible mutants were found and the classical virulence factors were evaluated. The genome-wide screening revealed the possible involvement of some proteins in molecular mechanisms of plumieridine, such as lysophospholipid acyltransferase, choline transporter, rhomboid protease, arsenite transporting ATPase, BAG Protein and 26S proteasome regulatory subunit N6. These proteins are related with different biological process linked to Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway. This result suggests a complex cell process triggered by endoplasmic reticulum stress with many pathways indirectly affected by plumieridine, displaying a novel mechanism of action in a potential antifungal agent.

Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.

Os micronutrientes ferro e cobre possuem uma ampla distribuição na natureza e são utilizados por quase todos os organismos vivos. Em se tratando de patógenos, os mecanismos utilizados para a manutenção da homeostase desses metais possuem ligação com a expressão dos fatores de virulência e, por consequencia, auxiliam no estabelecimento do patógeno no hospedeiro e início da doença. Cryptococcus gattii é uma levedura encapsulada, que causa criptococose em indivíduos imunocompetentes e em animais. Essa espécie é responsável por um surto de criptococose nas ilhas Vancouver, Canadá, com altos índices de mortalidade e morbilidade registrados do ano de 1999 até o presente. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo o esclarecimento dos papéis envolvendo a homeostase de ferro e cobre no patógeno C. gattii. Para isto, foi realizada uma análise proteômica global e comparativa em células de C. gattii cultivadas sob presença/limitação de ferro e/ou cobre. Essa análise foi feita utilizando a metolodogia de identificação multidimensional de proteínas (MudPIT), associada ou não com géis bidimensionais (2D-GE). Nossos resultados demonstraram que o fungo C. gattii sofre alterações metabólicas, principalmente envolvendo funções mitocondriais, na ausência dos micronutrientes ferro ou cobre. As análises também mostraram que o fungo responde a privação desses micronutrientes por um aumento na atividade de proteases, o que poderia vir a ser uma regulação pós-traducional utilizada por esse patógeno para manter a homeostase desses metais. Adicionalmente, funções específicas desempenhadas pelo fungo na ausência de ferro ou cobre também foram identificadas. / Iron and copper have a ubiquitous distribution in living organisms; the competition for such between the host and pathogen is related with disease establishment. Cryptococcus gattii is an encapsulated yeast that causes cryptococcosis in immunocompetent individuals and animals. This pathogen is responsible for an ongoing outbreak in Vancouver Island, Canada, which has substancial mortality and morbidity rates. In this context, the aim of this work was to clarify the mechanisms involved in the maintenance of iron and copper homeostasis in C. gattii. To accomplish that, a global and comparative proteomic analyses were performed in C. gattii cells grown in replete/depleted iron and/or copper conditions. For these analysis was used the multidimensional protein identification technology (MudPIT) associated, or not, with twodimensional gels (2D-GE). Our results demonstrated metabolic alterations in response to iron and copper deprivation in C. gattii, mainly associated with mitochondrial functions. The results also showed a high protease activity in cells of C. gattii grown in iron and copper deprivation in comparison with control. This might be a posttranslational regulation developed by C. gattii to maintain metal homeostasis. In addition, specific functions related to iron and to copper control were identified.

Resumo não disponível.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A criptococose à a infecÃÃo causada a partir da inalaÃÃo de leveduras do gÃnero Cryptococcus. A doenÃa costuma acometer mais freqÃentemente pacientes com alguma imunodepressÃo e evoluir de forma subaguda ou crÃnica. Tem predileÃÃo por sistema nervoso central, manifestando-se como meningite, mas tambÃm pode apresentar-se como doenÃa pulmonar ou de forma disseminada, com envolvimento de outros ÃrgÃos. A atividade proteolÃtica em leveduras do gÃnero Cryptococcus tem sido associada a sua patogenicidade. A atividade da enzima fosfolipase tambÃm se faz importante para este gÃnero, uma vez que està relacionada à nutriÃÃo e à capacidade invasiva do microrganismo. Outro mecanismo de virulÃncia de maior relevÃncia para a patogenicidade de Cryptococcus spp. à a cÃpsula polissacarÃdica presente em sua superfÃcie, responsÃvel principal pelo escape aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Esta pesquisa teve como objetivo traÃar um perfil clÃnico, epidemiolÃgico e laboratorial dos pacientes com criptococose entre os anos de 1985 e 2010, bem como investigar os efeitos dos inibidores de protease Saquinavir, Darunavir, Ritonavir e Indinavir sobre o crescimento, espessura da cÃpsula, atividade de protease e expressÃo de fosfolipase em cepas de Cryptococcus neoformans isoladas de humanos. A comparaÃÃo entre grupo soropositivo para o HIV com grupo soronegativo mostrou que o primeiro apresenta maiores mÃdias de idade e maior freqÃÃncia de sexo masculino acometido; por outro lado, o grupo soropositivo demonstra menores proteinorraquia e celularidade no lÃquor, bem como menores valores de leucometria e plaquetometria em sangue perifÃrico. ApÃs a realizaÃÃo do teste de sensibilidade por microdiluiÃÃo em caldo, os fungos foram expostos a trÃs concentraÃÃes distintas dos fÃrmacos e avaliados com relaÃÃo à expressÃo das duas enzimas e espessura da cÃpsula. Os resultados mostraram inibiÃÃo significativa (p<0,05) da atividade de protease pelo menos na maior concentraÃÃo testada para todas as drogas, bem como estreitamento da cÃpsula em algumas combinaÃÃes de drogas e cepas. Por outro lado, quanto à atividade de fosfolipase, observou-se um aumento na expressÃo dessa enzima, especialmente nas concentraÃÃes mais elevadas das quatro drogas. Conclui-se, portanto, que apesar de estes antirretrovirais nÃo inibirem o crescimento de Cryptococcus neoformans, sÃo capazes de alterar mecanismos de virulÃncia destas leveduras.

Cryptococcus neoformans é uma levedura basidiomicética e patógeno humano oportunista, que causa infecção tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes. A habilidade de sobrevivência e proliferação na temperatura do corpo humano é um fator de virulência essencial deste microrganismo. Análise da Diferença Representacional (RDA) foi aplicada com o intuito de delinear o perfil de expressão gênica durante desenvolvimento de C. neoformans a 37ºC ou 25ºC. Análises de 300 seqüências de cDNA permitiram a identificação de proteínas que podem ser críticas para processos de interação patógeno-hospedeiro. Produtos gênicos envolvidos em integridade da parede celular, resposta ao estresse, filamentação e metabolismo oxidativo são induzidos a 37ºC. Genes relacionados à silenciamento de cromatina e transporte de fosfolipídios possuem maior expressão em cultivo de C. neoformans a 25ºC. A metodologia de RDA mostrou-se viável no intuito de identificar genes regulados pela temperatura neste organismo, os quais podem representar alvos potenciais para estudos de inibição do desenvolvimento de C. neoformans no hospedeiro.

Resumo não disponível.

Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.