Submitted by JÉSSICA CRISTINA BILIZARIO NOGUEROL ANDRADE null (jessica_belizario@hotmail.com) on 2017-03-03T13:45:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Jéssica.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T17:36:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andrade_jcbn_me_bot.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T17:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrade_jcbn_me_bot.pdf: 2269215 bytes, checksum: d9bf169b1817858a769738dc3d9266f6 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Criptococose é uma micose sistêmica, cuja incidência tem aumentado nas últimas décadas. É causada pelos fungos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii que se apresentam sob a forma de levedura capsulada. Uma importante característica da infecção com as duas espécies do fungo é que enquanto o C.neoformans está associado à doença em pacientes imunossuprimidos, o C.gattii é capaz de induzir a micose em individuos imunocompetentes. O entendimento dos mecanismos envolvidos nestas diferenças tem sido um desafio para os pesquisadores da área. No que se refere à resposta imune do hospedeiro contra o Cryptococcus, está bem estabelecido que a resistência/suscetibilidade a infecção envolve a participação de diferentes subpopulações de células CD4. No entanto, os estudos sobre o papel das subpopulações TH17 e Treg são escassos. Além disso, são raros os trabalhos que de uma forma sistemática objetivaram comparar o perfil de células CD4 induzido por uma ou outra espécie do fungo. Diferencas nesse perfil poderiam explicar a indução da doença em diferentes populações. Assim, um primeiro objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de células CD4 efetoras induzido pelo C.neoformans e C.gatti . A abordagem experimental foi a incubação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro com leveduras vivas de C. neoformans e C.gattii, seguida da avaliação da expressão intracitoplasmática das citocinas IFN-(TH1), IL-4 (TH2), IL-17 (TH17) e o fator de transcrição Foxp3 (células Tregs) , por citometria de fluxo, bem como a expressão de mRNA para Foxp3 e RORyt (fator de transcrição para TH17). A análise global dos resultados mostrou que o C.neoformans não é capaz de induzir a diferenciação de TH1 e TH2, mas sim de células Treg e TH17. Por outro lado, o C.gattii induz apenas a diferenciação de células Treg. Outro aspecto da relação hospedeiro/ Cryptococcus que merece ser avaliado, refere-se ao achado de que vários microrganismos podem causar genotoxicidade em células do hospedeiro como uma forma de evasão dos mecanismos de defesa. Assim, um segundo objetivo do presente estudo foi avaliar se as diferentes espécies do Cryptococcus são capazes de induzir danos no DNA de PBMCs e se este processo está relacionado aos níveis de óxido nitrico (NO) produzidos por essas células. Detectamos que ambas as espécies são igualmente capazes de induzir genotoxicidade em PBMCs. No entanto, uma associação entre danos no DNA e altos níveis de NO foi detectada apenas em relação a C. gattii. Os resultados apontam para a possibilidade de que os pacientes com criptococose sejam mais suscetíveis ao desenvolvimento de outras doenças. / Cryptococcosis is a systemic mycosis, whose incidence has increased in the last decades. It is caused by the fungi Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii which present as capsulated yeasts. An important feature of infection with both fungus species is that while C.neoformans is associated with the disease in immunosuppressed patients, C.gattii is able to induce mycosis in immunocompetent individuals. To understanding the mechanisms involved in these differences has been a challenge for researchers. Regarding the host immune response against Cryptococcus, it is well established that resistance/ susceptibility to infection involves the participation of different subpopulations of CD4 cells. However, studies on the role of TH17 and Treg subpopulations are scarce. In addition, there are few studies that systematically aimed to compare the CD4 cell subpopulations profile induced by one or another species of the fungus. Differences in this profile could explain the induction of the disease in different populations. Thus, a first objective of the present study was to evaluate the effector CD4 cells subpopulations profile induced by C.neoformans and C.gattii. The experimental approach was the incubation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in vitro with living yeasts of C. neoformans and C.gattii, followed by evaluation of the intracytoplasmic expression of the cytokines IFN-γ (TH1), IL-4 (TH2), IL-17(TH17) and Foxp3 transcription factor (Tregs cells) by flow cytometry, as well as mRNA expression for Foxp3 and RORyt (transcription factor for TH17). Overall, the analysis of the results showed that C.neoformans is not able to induce the differentiation of TH1 and TH2, but induces Treg and TH17 cells. On the other hand, C.gattii only induces Treg cells differentiation. Another aspect of the host / Cryptococcus interaction that deserves to be evaluated relates to the finding that various microorganisms may cause genotoxicity in host cells as a mechanism of evading defense mechanisms. Thus, a second objective of the present study was to evaluate if the different species of Cryptococcus are able to induce DNA damage of PBMCs and whether this process is related to the levels of nitric oxide (NO) produced by these cells. We have detected that both species are equally capable of inducing genotoxicity in PBMCs. However, an association between DNA damage and high NO levels was only detected in relation to C. gattii. The results point to the possibility that patients with cryptococcosis are more susceptible to the development of other diseases.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

A incidência de micoses tem aumentado drasticamente, representando a maioria de infecções oportunistas. As leveduras vêm se destacando pelo modo ao qual infectam o hospedeiro, por suas defesas contra o sistema imune dos hospedeiros e por serem amplamente distribuídas no ambiente. A criptococose é a terceira mais freqüente infecção em indivíduos HIV-positivos e atualmente o número de casos em pessoas ditas “aparentemente imunocompetentes” vem aumentando drasticamente. Os agentes etiológicos são ambas as leveduras Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A infecção humana se dá pela inalação de propágulos infectivos de um sítio ambiental. Nesse estudo, nós relatamos um caso de criptococose disseminada em um individuo de 66 anos, do sexo masculino, HIV-negativo, o qual residia e trabalhava em uma Madeireira na cidade de Cachoeira do Sul – RS. O diagnóstico inicial foi realizado por biópsia de um nódulo subcutâneo e posteriormente foi realizada a confirmação da disseminação da doença através de Raio-X pulmonar e Ressonância Magnética Cerebral. Com base nesse caso clinico, foi proposto isolar os agentes causais da criptococose e outras leveduras dessa Madeireira. As leveduras foram isoladas para caracterizar a microbiota leveduriforme desse local e avaliar a que outras micoses emergentes os trabalhadores dessa Madeireira estão expostos. Foram coletadas amostras de monitoramento do ar, excretas de pombos e galinhas, serragem, pó de madeira, poeira, cascas e folhas de árvores do gênero Eucaliptus. As amostras foram coletas das quatro vezes no período de um ano (2005), sendo realizadas uma coleta por estação do ano. As amostras coletadas totalizaram 40 sítios amostrais do ar interno da madeireira, 40 amostras de excretas (pombos e galinhas) e 63 amostras no interior da madeireira (serragem, pó de madeira, poeira, casca de eucalipto e folha de eucalipto). De alguns desses sítios amostrais foram obtidos três isolados de C. neoformans var. grubii, um isolado de C. gattii e 180 leveduras. Dentre as leveduras, foram identificados 7 diferentes gêneros do Filo Basidiomycota e 10 pertencentes ao Filo Ascomycota. Dentre as espécies de leveduras identificadas, algumas são patógenos, porém a maioria é saprofítica. Os gêneros prevalentes são: Candida, Cryptococcus, Debaryomyces e Pichia. Estudos no ambiente doméstico de indivíduos infectados podem sugerir medidas profiláticas pelo conhecimento dos patógenos aos quais eles estão expostos.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

A incidência de micoses tem aumentado drasticamente, representando a maioria de infecções oportunistas. As leveduras vêm se destacando pelo modo ao qual infectam o hospedeiro, por suas defesas contra o sistema imune dos hospedeiros e por serem amplamente distribuídas no ambiente. A criptococose é a terceira mais freqüente infecção em indivíduos HIV-positivos e atualmente o número de casos em pessoas ditas “aparentemente imunocompetentes” vem aumentando drasticamente. Os agentes etiológicos são ambas as leveduras Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A infecção humana se dá pela inalação de propágulos infectivos de um sítio ambiental. Nesse estudo, nós relatamos um caso de criptococose disseminada em um individuo de 66 anos, do sexo masculino, HIV-negativo, o qual residia e trabalhava em uma Madeireira na cidade de Cachoeira do Sul – RS. O diagnóstico inicial foi realizado por biópsia de um nódulo subcutâneo e posteriormente foi realizada a confirmação da disseminação da doença através de Raio-X pulmonar e Ressonância Magnética Cerebral. Com base nesse caso clinico, foi proposto isolar os agentes causais da criptococose e outras leveduras dessa Madeireira. As leveduras foram isoladas para caracterizar a microbiota leveduriforme desse local e avaliar a que outras micoses emergentes os trabalhadores dessa Madeireira estão expostos. Foram coletadas amostras de monitoramento do ar, excretas de pombos e galinhas, serragem, pó de madeira, poeira, cascas e folhas de árvores do gênero Eucaliptus. As amostras foram coletas das quatro vezes no período de um ano (2005), sendo realizadas uma coleta por estação do ano. As amostras coletadas totalizaram 40 sítios amostrais do ar interno da madeireira, 40 amostras de excretas (pombos e galinhas) e 63 amostras no interior da madeireira (serragem, pó de madeira, poeira, casca de eucalipto e folha de eucalipto). De alguns desses sítios amostrais foram obtidos três isolados de C. neoformans var. grubii, um isolado de C. gattii e 180 leveduras. Dentre as leveduras, foram identificados 7 diferentes gêneros do Filo Basidiomycota e 10 pertencentes ao Filo Ascomycota. Dentre as espécies de leveduras identificadas, algumas são patógenos, porém a maioria é saprofítica. Os gêneros prevalentes são: Candida, Cryptococcus, Debaryomyces e Pichia. Estudos no ambiente doméstico de indivíduos infectados podem sugerir medidas profiláticas pelo conhecimento dos patógenos aos quais eles estão expostos.

Cryptococcus neoformans é uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivíduos com algum comprometimento do sistema imune. É responsável por 4,5% das infecções oportunistas que acometem pacientes portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii é um patógeno primário responsável por uma alta incidência de criptococomas no pulmão e no cérebro e que apresenta uma alta morbidez neurológica e uma resposta retardada à terapia antifúngica. O diagnóstico da criptococose é, atualmente, baseado na detecção da levedura em amostras clínicas, no cultivo com posterior identificação bioquímica e na pesquisa de antígenos circulantes. A diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratórios, é realizada utilizando o meio de cultura ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioquímicas utilizadas atualmente para a identificação das espécies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessário para a identificação das espécies. A metodologia também se mostrou mais específica na identificação das espécies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em ágar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi também realizado o primeiro estudo epidemiológico do perfil de pacientes com meningite criptocócica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS no período de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes é do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etária entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).

Nos últimos anos tem ocorrido um aumento de infecções fúngicas, devido à elevação do número de pacientes imunossuprimidos, principalmente pelo surgimento da epidemia da AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome). O uso aumentado de antifúngicos tem levado ao surgimento de cepas resistentes a estes agentes, já verificado com o azólico fluconazol, o agente antifúngico mais utilizado na terapia de manutenção de pacientes com AIDS, que desenvolvem criptococose. Neste trabalho, foram determinadas as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) de fluconazol para isolados clínicos de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, utilizando-se o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), o método padrão para testar susceptibilidade antifúngica de leveduras. Foram testados 173 isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii, sendo que as CIMs para fluconazol variaram de 0,125 a 16 μg/mL, com uma CIM50% de 2 e uma CIM90% de 4 μg/mL. Todos os isolados foram considerados sensíveis a fluconazol. Também foi realizado um teste de indução de resistência a fluconazol, por exposição de um isolado sensível, a concentrações crescentes da droga, para verificar se apenas a exposição, levaria ao desenvolvimento de resistência. No entanto, verificou-se apenas uma resistência transitória, em uma das subpopulações, sendo que o fenótipo de sensibilidade foi restaurado. Os dados obtidos neste trabalho estão em concordância com estudos nacionais e internacionais, que também utilizaram o teste padrão de microdiluição em caldo. A resistência entre isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii ainda tem se mostrado rara em termos mundiais comparada a resistência adquirida por outras leveduras. No entanto, devido aos relatos de desenvolvimento de resistência durante a terapia de manutenção da criptococose, é importante alertar quanto à possibilidade do surgimento e da propagação de cepas resistentes. / In the last years have occurred an increase of fungal infections due to rise of number of immunocompromised patients, particularly by appearance of the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). The incresing use of antifungal agents has determined the appearance of resistants strains to this agents, already verified with the fluconazole azole, the antifungal agent more used in the maintenance therapy of AIDS patients that developing criptococosis. In this work were determined the Minimuns Inibitories Concentrations (MICs) of fluconazole to Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii clinical isolates, using the National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) broth microdilution method. This is the test standard to test antifungal susceptibility to yeasts. Were tested 173 clinical isolates of C. neoformans and C. gattii. The MICs to fluconazole ranged of 0.125 to 16 μg/mL and the MIC50% was 2 and MIC90% was 4μg/mL. All isolates were considered susceptibles to fluconazole. A test of fluconazole resistance inducing was carry out by exposure to drug incresing concentrations of one susceptible isolate, to verify if only the exposure can to result in the resistance development. However occurred only a temporary resistance in one of the subpopulations, since the susceptibility profile was restored. The data obtained in this work are in agreement with national and international studies that also used the standard broth microdilution method. The resistance between C. neoformans and C. gattii clinical isolates has been rare in the world when compared with others yeasts. Nonetheless due to references to resistance development during the maintenance therapy of cryptococosis, it’s important to remain alert as for possibility of appearance and spread of resistants strains.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-06T00:07:57Z No. of bitstreams: 1 manoel_gf_lourenco_ioc_bp_0041_2008.pdf: 1698623 bytes, checksum: 26dac485e0b5d05c5bbc0ba69007c66a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-06T00:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 manoel_gf_lourenco_ioc_bp_0041_2008.pdf: 1698623 bytes, checksum: 26dac485e0b5d05c5bbc0ba69007c66a (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O envolvimentonto do sistema nervoso central com meningites tem sido tradicionalmente relatado em ambas as infecções por C. neoformans e C. gattii, com ou sem sinais clínicos ou radiológicos de lesão pulmonar. Quase todas as formas disseminadas por cepas de C. neoformans ocorreram em indivíduos imunocomprometidos, exceto em poucos casos com fatores predisponentes, sugerindo a existência de alguns mecanismos de escape. Em contraste criptococose por C. gattii, quase sempre afeta indivíduos sem prejuízo imune identificável, e comumente apresenta lesões pulmonares e do sistema nervoso central associado à meningite. Como os mecanismos envolvidos nos estágios precoces da infecção pulmonar por espécies de Cryptococcus ainda são poucos conhecidos, foram acompanhados separadamente o processo de internalizaçao, de duas cepas de C. neoformans e C. gattii, nos pulmões de camundongos imunocompetentes, descrevendo esta penetração e comparando possíveis diferenças. Materiais e Métodos: Camundongos Swiss Webster foram instilados intratraquealmente com: a) 10 5 leveduras de C. neoformas em 50µL de salina (30 animais); b) 10 5 leveduras de C. gattii em 50µL de salina (30 animais); ou c) 50µL de salina sem leveduras de Cryptococcus (10 animais). Após a instilação o abdômen dos camundongos foi comprimido e liberado para promover uma inalação profunda. Os animais foram mortos 2, 12, 24, 48 e 72h após a instilação.A cada período os animais foram submetidos a eutanásia por injeção intraperitonial de 1.0 mL de pentobarbital sódico a 2,5%. Resultados e Discussão: A histopatologia entre os pulmões de camundongos infectados por C. neoformans ou C. gattii revelaram peculiaridades importantes. Uma das diferenças principais foi a expressão precoce da cápsula de polissacarídeo por C. neoformans em comparação com C. gattii. Pór causa da expressão precoce da sua cápsula de polissacarídeo, C. neoformans é maior em tamanho, o que pode contribuir para seu escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro e, maior persistência no trato respiratório. Este mecanismo de escape e a conseqüente dificuldade para difusão resultam numa grande reação inflamatória local acompanhada de brotamento precoce. Conclusões: a invasão pulmonar e os mecanismos de disseminação de Cryptococcus no trato respiratório em estágios precoces da infecção experimental não dependeram diretamente da participação de células mononucleares e neutrofilicas. Este processo aconteceu, pela interação física entre os fungos e o epitélio respiratório, contudo sendo desconhecido os mecanismos intrínsecos / The envolvimentonto central nervous system with meningitis has traditionally been reported in both infections C. and C. neoformans gattii, with or without clinical or radiological signs of lung injury. Almost all forms disseminated by strains of C. neoformans occurred in immunocompromised individuals, except in a few cases with predisposing factors, suggesting the existence of some escape mechanisms. In contrast cryptococcosis by C. gattii, often affects individuals without identifiable immune injury, and commonly shows pulmonary lesions and central nervous system associated with meningitis. As the mechanisms involved in the early stages of pulmonary infection by Cryptococcus species are still little known, were tracked separately the process of internalization of two strains of C. and C. neoformans gattii, the lungs of immunocompetent mice, describing and comparing this penetration possible differences. Materials and Methods: Swiss Webster mice were intratracheally instilled with: a) 10 5 yeasts of C. 50μL neoformas in saline (30 animals), b) 10 5 yeasts C. gattii in 50μL of saline (30 animals), or c) 50μL of saline without yeast Cryptococcus (10 animals). After instillation, the abdomen of the mice was compressed and released to promote a deep inhalation. Animals were sacrificed 2, 12, 24, 48 and 72h after instilação.A each period the animals were euthanized by intraperitoneal injection of 1.0 mL of 2.5% sodium pentobarbital. Results and Discussion: The histopathology of the lungs of mice infected with C. or C. neoformans gattii revealed important peculiarities. One of the main differences is the early expression of capsule polysaccharide by C. in comparison to C. neoformans gattii. Because of their expression of early polysaccharide capsule, C. neoformans is larger in size, which may contribute to their escape from host defense mechanisms, and greater persistence in the respiratory tract. This escape mechanism and the consequent difficulty for the diffusion result in significant local inflammatory reaction accompanied by sprouting early. Conclusions: Lung invasion and the mechanisms of dissemination of Cryptococcus in the respiratory tract in the early stages of experimental infection did not directly dependent on the participation of mononuclear cells and neutrophilic. This process took place, the physical interaction between fungi and respiratory epithelium, but the mechanisms are unknown intrinsic

Made available in DSpace on 2014-08-11T12:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf: 1163368 bytes, checksum: f202e217c54ce0cedbcb4c79e65c8190 (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf.txt: 105699 bytes, checksum: d49cfc5d18502e60aefc9acd95bd3a8b (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf.jpg: 1571 bytes, checksum: d645520da44b852110b75eff2c71cf71 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Cryptococcus neoformans (C. n) e Cryptococcus gattii (C. g) são agentes da criptococose. A carência de publicações sobre teste de suscetibilidade de C. n e principalmente de C. g é evidente. A maioria de isolados clínicos de C. g mostra-se suscetível in vitro a fluconazol e itraconazol; no entanto o surgimento de resistência a drogas antifúngicas incentivou os testes de suscetibilidade in vitro. Como conseqüência, Clinical and Laboratory Standadards Institute \2013 CLSI, anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standards \2013 NCCLS, publicaram metodologia padronizada M27-A2 para alcançar reprodutibilidade e permitir a comparação de resultados de suscetibilidade entre laboratórios, porém alguns problemas como o tempo de incubação e o padrão de leitura levaram à busca de técnicas alternativas, tais como a citometria de fluxo. O objetivo deste trabalho é padronizar a técnica de citometria de fluxo para o teste de suscetibilidade in vitro de C.n e C.g. visando a redução do tempo de incubação, a utilização de leitura automatizada e a obtenção de resultados rápidos e reprodutíveis A concentração inibitória mínima (CIM) de 20 isolados de C.n e 21 de C.g foi determinada por citometria de fluxo e os resultados comparados com o protocolo padrão proposto pelo CLSI/M27A-2. Após duas horas de incubação com anfotericina B utilizando FUN-1, C. gattii resultou em 100% de concordância entre as duas técnicas para diluição de 2\03BCg/mL e 95,2% para 1\03BCg/mL e C. neoformans resultou em 100% de concordância para 1 e 2\03BCg/mL. Para azólicos e flucitosina, foram obtidos resultados reprodutíveis com o fluorocromo Acridine Orange após 18 horas de incubação, que resultou em 78% de concordância entre as duas técnicas para fluconazol, 85% para itraconazol e 97% para flucitosina. Em ambas as metodologias, C. gattii foi menos suscetível do que C. neoformans frente ao itraconazol e flucitosina (p<0,05). A citometria de fluxo é uma ferramenta útil, com potencial para testes in vitro e determinação da CIM dos antifúngicos estudados, com apreciável redução do tempo mínimo para obtenção de resultados / Cr yptococcus neoformans ( C.n ) and Cryptococcus gattii ( C.g ) are the agents of cryptococcosis. The lack of publications on susceptibility tests of C.n and especially C.g is evident. Most clinical isolates of C.g proved to be susceptible in vitro to fluconazol e and itraconazole and yet the emergence of resistance to antifungal drugs encouraged susceptibility testing in vitro . As a consequence, Clinical and Laboratory Standadards Institute – CLSI ( National Committee for Clinical Laboratory Standards – NCCLS ) pub lished standardized methodology to achieve reproducibility and allow comparison of susceptibility results between laboratories (M27 - A2 document) , however some problems of methodology, like incubation time and standard reading, led to the search for alterna tive techniques, such as flow cytometry. The objective of this work is to standardize the technique of flow cytometry to test the in vitro susceptibility of C . n and C . g in order to reduce the incubation time, use of automated reading and obtain fast and re producible results . The minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 isolates of C.n and 21 of C.g was determined by flow cytometry and the results compared with the standard protocol proposed by CLSI/M27A - 2. Flow citometry showed 100% agreement with CLSI/ M27A - 2 results for 2 μ g/mL and 95.2% for 1 μ g/mL dilution when C.g isolates were tested, and 100% agreement for 1 and 2 μ g/ml dilution when C.n were tested after two hours of incubation with amphotericin B using FUN - 1 . Reproducible results were obtained with fluorochrome Acridin e Orange for azoles and flucytosine after 18 hours incubation, resulting in 78% agreement for fluconazole, 85% for itraconazole and 97% for flucytosine. C.g was less susceptible than C.n against itraconazole and flucytosine (p <0.05) in both methodologies. Flow cytometry is a useful tool, with potential for in vitro susceptibility test s of the antifungal agents studied, with appreciable reduction in the minimum time for achieving results.