A imunidade nutricional é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro. A mesma é caracterizada pela privação de nutrientes durante interação patógeno e hospedeiro, mostrando-se essencial tanto para eliminar quanto para conter a disseminação de micro-organismos patogênicos. Dentre os nutrientes sequestrados pelo hospedeiro, está o metal zinco, é um micronutriente essencial para o metabolismo de todos os seres vivos. Em contrapartida, micro-organismos patogênicos desenvolveram mecanismos para capturar esse metal. O nosso modelo de estudo, a levedura encapsulada Cryptococcus gattii, é um dos principais agentes causadores da criptococose. A doença inicia pela inalação de propágulos fúngicos, os quais irão depositar-se no interior dos alvéolos pulmonares onde irão encontrar células fagocíticas, representando a primeira linha de defesa do hospedeiro e onde possivelmente seja empregada a imunidade nutricional para conter a disseminação desta levedura. No presente trabalho, objetivamos avaliar o papel da biodisponibilidade de zinco na virulência de C. gattii. No primeiro capítulo, descrevemos a caracterização da função de dois transportadores de zinco da família ZIP em C. gattii. O transportador de zinco Zip1 é o principal envolvido na captação de zinco, já que linhagens mutantes para o seu gene codificador, assim como a linhagem duplo mutante zip1Δzip2Δ, apresentaram baixo nível de zinco intracelular, crescimento reduzido quando na condição de privação de zinco e altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando cultivados na condição de privação do metal. Tais características não foram observadas na linhagem zip2Δ. Ensaios de virulência demonstraram que zip1Δ e zip1Δzip2Δ são mais susceptíveis à fagocitose por macrófagos, ao passo que ensaios de infecção em modelo murino demonstraram que apenas a linhagem duplo mutante possui virulência atenuada. Tais dados evidenciam que a homeostase de zinco, mais especificamente o transporte, é essencial para a patogenicidade de C. gattii. No segundo capítulo do presente trabalho, abordamos homeostase de zinco durante a interação C. gattii com macrófagos. Por meio de analises de microscopia, demonstramos que leveduras contidas em fagossomos apresentam eventos de aumento transitório na concentração de zinco, o que parece estar diretamente envolvido com a permeabilização dos fagossomos. Adicionalmente, determinamos que macrófagos infectados com C. gattii apresentam uma compartimentalização de zinco, provavelmente no complexo de Golgi, dessa maneira reduzindo a disponibilidade do metal em fagossomos infectados. Concluindo, o presente trabalho demonstrou que o metal zinco é essencial para a patogenicidade de C. gattii, e que transportadores do metal estão diretamente envolvidos com a virulência deste patógeno. Além disto, levantamos importantes dados quanto à imunidade nutricional de macrófagos contra C. gattii, sugerindo que um processo de privação de zinco é realizado por parte do macrófago. / Nutritional immunity is an important defence mechanism used by host. It is characterised by nutrients deprivation during host-pathogen interaction and has important role in growth hampering and microbe killing. Among the nutrients sequestered by host is the metal zinc, which plays essential role in cell metabolism of all living organisms. However, microorganisms developed diverse mechanisms for zinc acquisition. Our model of study is the intracellular fungal pathogen Cryptococcus gattii, one of the main agents of cryptococcal disease. The disease starts with inhalation of fungal propagules, which will deposit inside the lug alveoli and being in contact with phagocytes, representing the first line of host defence. In such host cells, nutritional immunity occur in order to hamper cryptococcal growth. In the present work, we sought to determine the role of zinc availability on the C. gattii virulence. In the first chapter, we describe the functional characterization of two of zinc transporters in C. gattii of the ZIP family. Zip1 transporter is the pivotal zinc transporter in C. gattii, as mutant strains zip1Δ and double mutant strain zip1Δ zip2Δ had lower intracellular content, reduced growth under zinc limitation and higher reactive oxygen species than wild type strain. Such characteristics were not observed in zip2Δ strain. Virulence tests demonstrated that zip1Δ and zip1Δzip2Δ are more susceptible to macrophage phagocytosis, and murine infection assay showed that only double knockout strain had alterations in virulence. Such data lead us to conclude that zinc, acquired by zinc transporters, is essential for C. gattii pathogenicity. In the second chapter, we demonstrated important data about zinc homeostasis during C. gattii and macrophage interaction. Microscopy analysis demonstrated that internalised yeasts cells have events of temporary increase on zinc concentration. These events are directly associated with phagosomal permeabilisation. Moreover, C. gattii infected macrophages have a zinc content compartmentalisation, most probably in the Golgi apparatus. Thus, we conclude that zinc is essential for C. gattii virulence and zinc transporters play an important role on its pathogenicity. In addition, we described important data about zinc nutritional immunity during macrophage and C. gattii interaction.

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética causadora da criptococose, doença que acomete diferentes órgãos de pacientes imunocompetentes, entre eles, pulmões, pele e sistema nervoso central. Durante o processo infeccioso, o fungo expressa diversos fatores de virulência, como a produção de melanina e cápsula polissacarídica, além de possuir a capacidade de replicar-se no interior de macrófagos. Em contrapartida, as células do hospedeiro também possuem estratégias para conter a disseminação do patógeno, uma delas é a imunidade nutricional, na qual ocorre redução da disponibilidade de nutrientes no sítio de infecção. A disponibilidade de zinco é um fator crucial para o desenvolvimento de uma infecção fúngica, mesmo assim, pouco se sabe sobre o metabolismo desse metal na espécie C. gattii. No presente trabalho, primeiramente, descrevemos o fator de transcrição Zap1 em C. gattii, a partir da análise in silico foi identificado um ortólogo do gene regulador da homeostase de zinco ZAP1 de Saccharomyces cerevisiae do genoma de C. gattii. Foram realizadas análises de expressão, demonstrando que o gene selecionado possui sua expressão aumentada na condição de privação de zinco, comprovando assim, sua relação com a homeostase desse metal. Para caracterizar funcionalmente a proteína Zap1, linhagens mutante e mutante complementada para o gene ZAP1 foram construídas e caracterizadas. A diminuição dos níveis de transcritos dos genes codificadores para os transportadores de zinco da família ZIP na linhagem mutante, concluímos que Zap1 regula positivamente a expressão desses genes. Na caracterização fenotípica, a linhagem mutante zap1Δ demonstrou maior sensibilidade à condição de privação de zinco do que a linhagem selvagem e mutante complementada, além de demonstrar altos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs) e maior sensibilidade as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) características que explicam a menor virulência da linhagem mutante quando comparada com a linhagem selvagem. Por meio da análise do transcriptoma demonstramos que Zap1 regula a expressão de genes envolvidos no metabolismo de zinco, estresse oxidativo e de genes codificadores para proteínas ligadoras de zinco. Secundariamente, na caracterização inicial de sistemas de aquisição de zinco em C. gattii, foram realizadas análises por PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos genes que codificam para transportadores de zinco da família ZIP. Um aumento significativo nos níveis de transcritos referentes ao gene ZIP3 (CNBG_5361), foi observado quando C. gattii foi cultivado em meio definido contendo o quelante de ferro BPDS ou o quelante de zinco TPEN, quando comparados à condição controle. Este fato sugere que o transportador Zip3 pode apresentar baixa seletividade, podendo transportar outros metais, em contraste aos transportadores Zip1 e Zip2, cuja modulação da expressão por BPDS foi menos acentuada. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast that causes cryptococcosis, a lifethreatening disease that can affect different organs of immunocompetent hosts, including, lungs, skin and central nervous system. During the infection process, the fungus express several virulence factors, such as melanin production and polysaccharide capsule, besides the ability to replicate inside macrophages. In contrast, the host cells express strategies to stop the spread of the pathogen, one of them is nutritional immunity, reducing nutrient availability in the infection site. Zinc availability is a crucial factor for fungal infection development, nevertheless, little is known about zinc metabolism in C. gattii. In the present work, firstly, we described Zap1 transcription factor in C. gattii. In silico analyses identified a Saccharomyces cerevisiae ZAP1 ortholog in C. gattii genome. Expression analyses demonstrated that, ZAP1 is positively regulated in zinc deprivation condition, confirming that the selected gene is involved in zinc metabolism. With the purpose to characterize the role of Zap1 in zinc metabolism, mutant and complemented strains were constructed and characterized. Expression analyses demonstrated that genes codifying for ZIP family of zinc transporter are up regulated by Zap1. On phenotypic characterization, mutant strain demonstrated higher sensibility to zinc deprivation condition when compared to wild type or complemented strain. Moreover, mutant strain demonstrated higher levels of reactive oxygen species (ROS) and higher sensibility to reactive nitrogen species (RNS). Transcriptomic analyses demonstrated that Zap1 regulates the expression of genes involved on zinc homeostasis, oxidative stress and genes codifying for zinc-binding proteins. Taken together, these results, explain the low virulence of mutant strain when compared to wild type and complemented strain. On the second part, on initial characterization of ZIP family of zinc transporters, relative transcript levels of ZIP family codifying genes was measured on different conditions. ZIP3 (CNBG_5361) demonstrated higher transcript levels when C. gattii cells were cultured on iron deprivation condition, for that, iron chelating agent (BPDS) was add to the medium. These results suggest that, Zip3 may present low selectivity, and may carry other metal, in contrast to Zip1 and Zip2, that expression modulation by BPDS was less pronounced.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-13T15:57:01Z No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / O advento de pacientes portadores do HIV e de pacientes imunocomprometidos provocou um aumento na incidência de micoses fúngicas, como a criptococcose. Existem várias classes de antifúngicos disponíveis comercialmente para o tratamento dessas infecções que são utilizadas de acordo com a patologia e o patógeno. No entanto, são relatados casos de resistência a essas drogas e existe uma grande preocupação em relação aos efeitos adversos que elas podem causar nos pacientes. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas poderia ser uma solução para a problemática atual das drogas disponíveis e isso requer o estudo de novos alvos moleculares. O gene ERG6 codifica a enzima esterol C-24 metiltransferase que atua na conversão de zimosterol em fecosterol. Constitui uma etapa que ocorre em fungos para a biossíntese do ergosterol, mas não ocorre nos hospedeiros animais, que possuem enzimas específicas para a conversão do zimosterol até colesterol. No presente trabalho, a função do gene ERG6 foi investigada e caracterizada no fungo Cryptococcus neoformans demonstrando que a ausência desse gene gera diversas alterações fenotípicas, tais como sensibilidade ao estresse osmótico, ao estresse oxidativo e maior susceptibilidade a diferentes drogas antifúngicas. Além disso, foi ainda observado que a capacidade de crescer em meios contento diferentes estressores de parede se mostra alterada. Em relação aos fatores de virulência conhecidos para C. neoformans, o fungo foi incapaz de crescer a temperatura de 37°C, porém não teve sua produção de cápsula ou melanina afetadas. No entanto, em testes para observação da sua capacidade de virulência in vitro utilizando macrófagos e in vivo com lagartas da espécie Galleria mellonella mostraram uma redução na virulência em mutantes de ERG6. Por fim a análise dos esteróis de membrana mostrou que ocorre uma alteração em toda a composição de esteróis da membrana celular. Dessa forma, por ser uma enzima encontrada principalmente em fungos, a Erg6 pode ser um alvo molecular potencial para drogas antifúngicas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The advent of HIV patients and immunocompromised patients caused an increase in the incidence of fungal mycoses, such as cryptococcosis. There are several antifungal agents commercially available for the treatment of such infections that are chosen based on the disease and the pathogen. However, cases of resistance are reported to these drugs and there is great concern about the adverse effects that they can cause on patients. In this context, the development of new antifungal drugs could be a solution to the current problem of the available drugs and it requires the study of potential molecular targets. The gene ERG6 encodes the sterol C-24 methyltransferase, an enzyme that acts on the conversion zimosterol in fecosterol. This is a step that occurs in fungi in the ergosterol biosynthesis, but does not occur in the animal hosts which have specific enzymes for the conversion of zymosterol to cholesterol. In this study, gene function of ERG6 was investigated and characterized in the Cryptococcus neoformans demonstrating the absence of this gene generates several phenotypic changes, such as sensitivity to osmotic stress, oxidative stress and increased susceptibility to different antifungal drugs. Furthermore, it was also observed that the ability to grow on media with different cell wall stressors was also altered. It was observed that the lack of ERG6 greatly affects the permeabillity of the membrane resulting in osmotic and oxidative stress sensitivity and changing antifungal drugs susceptibility. Furthermore, it was also observed that the ability to grow in medium with cell wall stressor was altered. About the virulence factor, C. neoformans was unable to grow at 37°C, but it had not affected the production of melanin or capsule. However, virulence tests in vitro with macrophages and in vivo with Galleria mellonella caterpillars showed a decrease in the virulence of ERG6 mutants. Finally, the membrane sterols analysis demonstrated a change in the membrane sterol composition. Thus, being an enzyme found especially fungi, the Erg6 may be a potential molecular target for antifungal drugs.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética causadora da criptococose, doença que acomete diferentes órgãos de pacientes imunocompetentes, entre eles, pulmões, pele e sistema nervoso central. Durante o processo infeccioso, o fungo expressa diversos fatores de virulência, como a produção de melanina e cápsula polissacarídica, além de possuir a capacidade de replicar-se no interior de macrófagos. Em contrapartida, as células do hospedeiro também possuem estratégias para conter a disseminação do patógeno, uma delas é a imunidade nutricional, na qual ocorre redução da disponibilidade de nutrientes no sítio de infecção. A disponibilidade de zinco é um fator crucial para o desenvolvimento de uma infecção fúngica, mesmo assim, pouco se sabe sobre o metabolismo desse metal na espécie C. gattii. No presente trabalho, primeiramente, descrevemos o fator de transcrição Zap1 em C. gattii, a partir da análise in silico foi identificado um ortólogo do gene regulador da homeostase de zinco ZAP1 de Saccharomyces cerevisiae do genoma de C. gattii. Foram realizadas análises de expressão, demonstrando que o gene selecionado possui sua expressão aumentada na condição de privação de zinco, comprovando assim, sua relação com a homeostase desse metal. Para caracterizar funcionalmente a proteína Zap1, linhagens mutante e mutante complementada para o gene ZAP1 foram construídas e caracterizadas. A diminuição dos níveis de transcritos dos genes codificadores para os transportadores de zinco da família ZIP na linhagem mutante, concluímos que Zap1 regula positivamente a expressão desses genes. Na caracterização fenotípica, a linhagem mutante zap1Δ demonstrou maior sensibilidade à condição de privação de zinco do que a linhagem selvagem e mutante complementada, além de demonstrar altos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs) e maior sensibilidade as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) características que explicam a menor virulência da linhagem mutante quando comparada com a linhagem selvagem. Por meio da análise do transcriptoma demonstramos que Zap1 regula a expressão de genes envolvidos no metabolismo de zinco, estresse oxidativo e de genes codificadores para proteínas ligadoras de zinco. Secundariamente, na caracterização inicial de sistemas de aquisição de zinco em C. gattii, foram realizadas análises por PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos genes que codificam para transportadores de zinco da família ZIP. Um aumento significativo nos níveis de transcritos referentes ao gene ZIP3 (CNBG_5361), foi observado quando C. gattii foi cultivado em meio definido contendo o quelante de ferro BPDS ou o quelante de zinco TPEN, quando comparados à condição controle. Este fato sugere que o transportador Zip3 pode apresentar baixa seletividade, podendo transportar outros metais, em contraste aos transportadores Zip1 e Zip2, cuja modulação da expressão por BPDS foi menos acentuada. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast that causes cryptococcosis, a lifethreatening disease that can affect different organs of immunocompetent hosts, including, lungs, skin and central nervous system. During the infection process, the fungus express several virulence factors, such as melanin production and polysaccharide capsule, besides the ability to replicate inside macrophages. In contrast, the host cells express strategies to stop the spread of the pathogen, one of them is nutritional immunity, reducing nutrient availability in the infection site. Zinc availability is a crucial factor for fungal infection development, nevertheless, little is known about zinc metabolism in C. gattii. In the present work, firstly, we described Zap1 transcription factor in C. gattii. In silico analyses identified a Saccharomyces cerevisiae ZAP1 ortholog in C. gattii genome. Expression analyses demonstrated that, ZAP1 is positively regulated in zinc deprivation condition, confirming that the selected gene is involved in zinc metabolism. With the purpose to characterize the role of Zap1 in zinc metabolism, mutant and complemented strains were constructed and characterized. Expression analyses demonstrated that genes codifying for ZIP family of zinc transporter are up regulated by Zap1. On phenotypic characterization, mutant strain demonstrated higher sensibility to zinc deprivation condition when compared to wild type or complemented strain. Moreover, mutant strain demonstrated higher levels of reactive oxygen species (ROS) and higher sensibility to reactive nitrogen species (RNS). Transcriptomic analyses demonstrated that Zap1 regulates the expression of genes involved on zinc homeostasis, oxidative stress and genes codifying for zinc-binding proteins. Taken together, these results, explain the low virulence of mutant strain when compared to wild type and complemented strain. On the second part, on initial characterization of ZIP family of zinc transporters, relative transcript levels of ZIP family codifying genes was measured on different conditions. ZIP3 (CNBG_5361) demonstrated higher transcript levels when C. gattii cells were cultured on iron deprivation condition, for that, iron chelating agent (BPDS) was add to the medium. These results suggest that, Zip3 may present low selectivity, and may carry other metal, in contrast to Zip1 and Zip2, that expression modulation by BPDS was less pronounced.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

BACKGROUND:Cryptococcus gattii has been the cause of an ongoing outbreak starting in 1999 on Vancouver Island, British Columbia and spreading to mainland Canada and the US Pacific Northwest. In the course of the outbreak, C. gattii has been identified outside of its previously documented climate, habitat, and host disease. Genotyping of C. gattii is essential to understand the ecological and geographical expansion of this emerging pathogen.METHODS:We developed and validated a mismatch amplification mutation assay (MAMA) real-time PCR panel for genotyping C. gattii molecular types VGI-VGIV and VGII subtypes a,b,c. Subtype assays were designed based on whole-genome sequence of 20 C. gattii strains. Publically available multilocus sequence typing (MLST) data from a study of 202 strains was used for the molecular type (VGI-VGIV) assay design. All assays were validated across DNA from 112 strains of diverse international origin and sample types, including animal, environmental and human.RESULTS:Validation revealed each assay on the panel is 100% sensitive, specific and concordant with MLST. The assay panel can detect down to 0.5 picograms of template DNA.CONCLUSIONS:The (MAMA) real-time PCR panel for C. gattii accurately typed a collection of 112 diverse strains and demonstrated high sensitivity. This is a time and cost efficient method of genotyping C. gattii best suited for application in large-scale epidemiological studies.