A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4%, em cultura de macrófagos da linhagem RAW 264.7, cultura primária de células da linhagem osteoblástica e em tecido subcutâneo de camundongos. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana desses materiais. Em cultura de macrófagos RAW 264.7 foram avaliados os seguintes aspectos: a viabilidade celular (Ensaio de MTT), propriedades imunoestimuladoras (dosagem de óxido nítrico) e propriedades antiinflamatórias (dosagem de óxido nítrico, TNF-&alpha; e IL-1&alpha;). Em cultura primária de células da linhagem osteoblástica foram avaliados viabilidade celular (períodos de 3, 7 e 10 dias), conteúdo de proteína total (Método de Lowry modificado nos períodos de 7 e 10 dias), atividade da fosfatase alcalina (liberação de timolftaleína nos períodos de 7 e 10 dias e in situ pelo método do Fast red), proteínas da matriz não-colágena (marcação por Imunofluorescência Indireta e Fluorescência Direta por meio da utilização da faloidina e DAPI, nos períodos de 3, 7 e 14 dias) e formações nodulares de matriz mineralizada (marcação pelo vermelho de Alizarina nos períodos de 3, 7 e 14 dias). A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar, sobre 2 microrganismos indicadores (Enterococcus faecalis e Kocuria rhizophila). A biocompatibilidade após implantanção de tubos de polietileno contendo as pastas no tecido subcutâneo de camundongos isogênicos Balb/c. Os dados numéricos foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, com nível de significância de 5%. Os resultados referentes à exposição das células da linhagem RAW 264.7 de macrófagos evidenciou baixa atividade imunoestimuladora da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina 0,4%, nas diferentes concentrações avaliadas. Por outro lado, pôde-se observar atividade antiinflamatória, com inibição na liberação de óxido nítrico e das citocinas (TNF-&alpha; e IL1-&alpha;), quando da utilização da associação hidróxido de cálcio e clorexidina na concentração de 25&micro;g/ml. Resultados semelhantes ao controle foram observados após a avaliação da pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®), associada ou não ao digluconato de clorexidina a 0,4% em cultura primária de células da linhagem osteoblástica uma vez que os dados numéricos do conteúdo de proteína total, da quantidade de fosfatase alcalina e das formações nodulares de matriz mineralizada não foram estatisticamente diferentes (p>0,05). Em relação à caracterização morfológica das culturas primárias os resultados obtidos foram semelhantes quando comparou-se a pasta Calen®, associada ou não à clorexidina a 0,4%. Em relação à atividade antimicrobiana, a associação hidróxido de cálcio e clorexidina promoveu a formação de maiores halos de inibição (em mm), em relação ao Enterococcus faecalis, embora sem diferença estatística significante com os demais grupos avaliados (p>0,05). No tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos, a análise microscópica demonstrou ser esta associação biocompatível, com tecido circunjacente e reacional, apresentando fibrosamento discreto e semelhante ao tecido conjuntivo fibroso normal, aos 63 dias de avaliação, sem diferença estatística com grupo controle (p>0,05). Com base nas metodologias empregadas e nos resultados obtidos pode-se concluir que a adição da clorexidina não apresentou benefícios adicionais à pasta à base de hidróxido de cálcio. / The aim of this study was to evaluate the calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage, and mice subcutaneous tissue. Besides we evaluated the antimicrobial activity of those materials. In RAW 264.7 macrophages culture the followed aspects were evaluated: cellular viability (MTT assay), immunestimulatory (nitric oxide detection) and anti-inflammatory (nitric oxide, TNF-&alpha; and IL-1-&alpha; detection) properties. In primary cell culture of osteoblastic lineage we evaluated the cellular viability for 3, 7 and 10 days, total protein content (Lowry modified method for 7 and 10 days), alkalinic phosphatase activity (thymolphthalein liberation for 7 and 10 days, and in situ by Fast red method), extracellular matrix noncollagen protein (stained by indirect immunofluorescence and direct fluorescence by phalloidin and DAPI for 3, 7 and 14 days), and mineralized matrix nodular formation (stained by Alizarin red for 3, 7 and 14 days). Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion test with Enterococcus faecalis and Kocuria rhizophila as indicators, and the biocompatibility after polyethylene tubes with the paste implanted into Balb/c mice subcutaneous tissue. The data were statistically analyzed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn\'s post test, considering a level of significance of 5%. The results of macrophage RAW 264.7 cells lineage exposition showed low stimullatory activity for the different concentrations evaluated of calcium hydroxide-based paste (Calen®), associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. On the other hand, we could observe anti-inflammatory activity with inhibition of nitric oxide and cytokines quantification (TNF--&alpha; e IL1--&alpha;), after the use of 25-&micro;g/ml calcium hydroxide associated to chlorhexidine (25-&micro;g/ml). Same results to the control were observed after evaluation of Calen® paste associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate, in culture of RAW 264.7 macrophages lineage, primary culture of osteoblastic lineage because the data of total protein content, alkaline phosphatase, and mineralized matrix nodular formation were not statistically different (p>0.05). In relation to the morphological characterization of primary culture, the results obtained were the same after comparison of Calen® paste, associated or not to 0.4% chlorexidine digluconate. About antimicrobial activity, the association Calcium hydroxide and chlorhexidine promoted formation of largest inhibition halo (in mm) for Enterococcus faecalis, but with no statistically significant with others evaluated groups (p>0.05). The microscopic analysis in mice conjunctive subcutaneous tissue demonstrated biocompatibility of that association with the around and reactional tissue, sowing a discret fibrosis, as well as the normal conjunctive fibrous tissue after 63 days of evaluation with no statistically difference with the control group (p>0.05). Based on the methodology used, and the results obtained in this work, we could conclude that the addition of chlorexidine showed no additional benefits to the calcium hydroxide-based paste.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:56:55Z : No. of bitstreams: 1 souza_ppc_me_arafo.pdf: 243435 bytes, checksum: 28d373d64f165dedc9e32182238f196c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo geral utilizar células da linhagem MDPC-23 em testes de citotoxicidade de materiais e na investigação dos efeitos de proteínas bioativas no estímulo da síntese de componentes da matriz dentinária. Os objetivos específicos foram avaliar o efeito citotóxico de soluções utilizadas na lavagem de paredes cavitárias e de materiais dentários recomendados para aplicação em dentina sobre células de linhagem odontoblástica MDPC-23. Também foi intuito avaliar o efeito do concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelho sobre a expressão de genes específicos. Este trabalho, apresentado na forma de três artigos científicos, utilizou a técnica de MTT para avaliar o efeito citotóxico de soluções de CLX em variadas concentrações sobre as células MDPC-23. Esta técnica foi utilizada também para a investigação do efeito citotóxico de três diferentes cimentos de ionômero de vidro modificados por resina: Vitrebond (VB); Vitremer (VM); e RelyX Luting Cement (RX), associada ao teste de implantação destes materiais resinosos no tecido conjuntivo subcutâneo de ratos. A expressão dos genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina nas células expostas ao concentrado de proteínas extraídas da dentina de coelhos foi avaliada por RT-PCR. Os resultados demonstraram que a CLX é citotóxica às células da linhagem MDPC-23 de maneira dose-dependente. Também foi demonstrado que os cimentos de ionômero de vidro são biocompatíveis ao tecido conjuntivo subcutâneo de ratos, apesar de apresentarem diferentes graus de citotoxicidade sobre as células odontoblastóides. As proteínas bioativas extraídas da dentina de coelhos apresentaram efeito estimulatório na expressão de genes que codificam para colágeno tipo-1 e fibronectina. Pode-se concluir que as células MDPC-23 são um modelo que pode ser utilizado nos testes de... . / The general aim of this in vitro and in vivo study was to evaluate the cytotoxicity of rinsing solutions and dental materials as well as to determine the expression of genes related with the dentinogenesis. The specific objectives were to evaluate the cytotoxicity effects of rinsing solutions used to clean cavity walls and dental materials used to restore dental cavities. The effects of EDTA soluble dentin proteins (members of TGF-â superfamily) on specific gene espression was also evaluated. For this porpose three scientific papers were prepared: 1) MTT assay was employed to investigate the cytotoxic effects of different concentrations of chlorhexidine to MDPC-23 cells as well as to; 2) to determine the cytotoxicity of three different resin-modified glass-ionomer cements (RMGIC): Vitrebond (VB); Vitremer (VM); and RelyX Luting Cement (VM). The results of this in vitro study was compared to the in vivo study in which RMGICs were implanted into the connective tissue of rats; 3) Type-1 collagen and fibronectin gene expression on cells exposed to EDTAsoluble dentin proteins was assessed by means of semi-quantitative RT-PCR. The results demonstrated that chlorhexidine is cytotoxic to MDPC-23 cells in a dose-dependent way. It was also demonstrated that RMGICs are biocompatible following implantation into surgical pockets prepared in the dorsal connective tissue of rats in spite of the different degrees of in vitro cytotoxicity presented by these materials to MDPC-23 cells. The stimulatory effects of the bioactive molecules on the expression of the genes that encodes to type-1 collagen and fibronectin was clearly demonstrated. Based on the experimental conditions, it was concluded that MDPC-23 cells are suitable model to be used on cytotoxicity tests of dental materials and rinsing solutions as well as to evaluate the dentinogenesis mechanisms.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

O Sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante modulador de processos inflamatórios e imunológicos, incluindo a doença periodontal (DP). Estudos sugerem neste sistema um eixo alternativo (ECA-2 /ANG(1-7) /MAS) que atuaria como um contra-regulador de efeitos mediados pelo clássico eixo (ECA /ANGII /AT1). Sabe-se que bactérias periodontopatogênicas, como a Porphyromonas gingivalis (Pg), possuem componentes bioativos de membrana (ex. lipopolissacarídeos-LPS) capazes de induzir uma forte resposta imune no hospedeiro devido à liberação de citocinas nas células, entre elas Interleucina (IL)- 1&#x3B2;. Neste contexto, fibroblastos são as células mais abundantes nos tecidos periodontais e possuem em sua superfície celular receptores necessários para o reconhecimento da invasão bacteriana, ativando cascatas intracelulares, que levam à produção de citocinas. O objetivo deste estudo foi verificar se os eixos ECA/ ANGII/ AT1 e ECA-2/ ANG(1-7)/ MAS contribuem para a produção e/ ou regulação de citocinas inflamatórias (CI) por fibroblastos de gengiva humana (HGF) e ligamento periodontal humano (HPLF) estimulados por IL-1&#x3B2;. Após o pré-tratamento com Losartan e Ang (1-7) ou silenciamento mediado por RNA de interferência (RNAi) de AT1, HGF e HPLF foram estimulados por IL-1&#x3B2; por 3 horas (RNAm) ou 24 horas (proteína). Expressão de RNAm para AT1, MAS, ECA, ECA-2, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-&#x3B2;, CXCL12, RANK-L e OPG foram avaliados por RT-qPCR e das proteínas IL-6, IL-8, ECA e ECA-2 por ELISA. Foi realizado também Western Blot para detecção de AT1 e ECA nos extratos celulares e dosagem de nitrito no sobrenadante das culturas. Ambos os subtipos de fibroblastos mostraram aumento da expressão de RNAm para AT1, IL-1&#x3B2;, IL-6, IL-8, TNF-&#x3B1; e OPG, quando estimulados por IL-1&#x3B2;. No entanto, apenas em HPLF foi observado aumento para MAS, ECA e TGF-&#x3B2;. Losartan e Ang (1-7) não modularam o transcrito, a secreção de CI e nem a produção de nitrito no sobrenadante das culturas, tanto em HGF como em HPLF. O silenciamento do receptor AT1 reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 induzida por IL-1&#x3B2; em cultura de HGF e HPLF e aumentou a expressão gênica de OPG somente em HGF. Estes resultados sugerem que o silenciamento de AT1, mas não o bloqueio farmacológico deste receptor pelo antagonista Losartan, em HGF e HPLF, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal. / The renin-angiotensin system (RAS) has been reported as an important modulator of inflammatory and immune responses, including periodontal disease (PD). Studies suggest an alternative axis as part of this system (ACE-2 / ANG (1-7) / MAS) that would act as counter-regulatory to the classical axis (ECA / ANGII / AT1). It is known that periodontal bacteria such as Porphyromonas gingivalis (Pg) have bioactive components in their membrane (such as lipopolysaccharide-LPS) capable of inducing a strong immune response in the host due to the release of cytokines in cells, including interleukin (IL) - 1&#x3B2;. In this regard, fibroblasts are the most abundant cells in periodontal tissues and receptors needed for the recognition of bacterial invasion by activating intracellular cascades that lead to cytokine production. The aim of this study was to determine whether the axes ACE / ANGII / AT1 and ACE-2 / ANG (1-7) / MAS contribute to the production and / or regulation of inflammatory cytokines (IC) by fibroblasts of human gingiva (HGF) and human periodontal ligament (HPLF) stimulated IL-1&#x3B2;. After pre-treatment with Losartan, Ang (1-7) or silencing mediated by RNA interference (RNAi) of AT1, HGF and HPLF were stimulated by IL-1&#x3B2; for 3 hours (RNAm) or 24 hours (protein). Expression mRNA for AT1, MAS, ACE, ACE-2, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-&#x3B2;, CXCL12, RANK-L and OPG was assessed by RT- qPCR and proteins IL-6, IL-8, ACE and ACE-2 by ELISA. Western Blot for the detection of AT1 and ECA and dosage of nitrite was also performed. Experiments stimulated by IL-1&#x3B2; showed a positive control for gene expression AT1, IL-1&#x3B2;, IL-6, IL-8, TNF-&#x3B1; and OPG in HGF and HPLF and MAS, ACE and TGF-&#x3B2; only HPLF. Losartan and Ang (1-7) did not modulate the transcription and secretion of IC and no nitrite production in the culture supernatant of HGF and HPLF. The silencing AT1 reduced IL-6 secretion and IL-8 induced by IL- &#x3B2; in cultured HGF and HPLF and increased OPG gene expression only HGF. These results suggest that silencing AT1, but not pharmacological blockade of this receptor by Losartan in HPLF and HGF, can control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to the pathogenesis of periodontal disease.

Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

A osteoporose, uma doença óssea progressiva, é considerada um grave problema de saúde pública, sendo uma das condições mais importantes associadas ao envelhecimento e que afeta milhões de pessoas no mundo. Esta doença multifatorial é caracterizada pela densidade óssea reduzida e deterioração da microarquitetura óssea. O objetivo deste trabalho foi investigar as mudanças comportamentais em células mesenquimais da medula óssea e células osteoblásticas da calvária de ratas induzidas à osteoporose. Após aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais, 18 ratas Wistar foram utilizadas e divididas em grupos controle e ovariectomizadas. Após 150 dias, as ratas de ambos os grupos foram sacrificadas para coleta dos fêmures e fragmentos da calvária. As células recolhidas a partir da medula óssea e calvária foram cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação e viabilidade celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão gênica por meio de PCR em tempo real. Os dados foram submetidos ao testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, com nível de significância de 5%. As células da medula óssea do grupo controle (MC) mostraram uma diminuição significativa na proliferação quando comparado com as células do grupo controle da calvária (CC) em todos os períodos (p < 0,05). Por outro lado, as células da medula óssea de ratas com osteoporose (MO) revelaram um aumento significativo na taxa de proliferação após 7 e 10 dias (p < 0,01) em comparação às células da calvária de ratas ovariectomizadas (CO). A viabilidade celular foi maior em todos os períodos estudados dos grupos CC e CO em relação aos grupos MC e MO (p < 0,05). A atividade de fosfatase alcalina não foi significativamente diferente após 7 dias de cultura entre os grupos estudados; por outro lado, após 10 e 14 dias, observou-se uma diminuição da sua atividade no grupo MC quando comparado ao grupo CC (p < 0,01). Nas ratas com osteoporose, as células da medula óssea mostraram um aumento desta atividade quando comparada às células de calvária (p < 0,01). A análise dos nódulos mineralizados após 14 e 21 dias revelou que os grupos controle CC e MC não apresentaram diferenças significativas, ao passo que no grupo MO observou-se um aumento da mineralização quando comparado ao grupo CO nos mesmos períodos experimentais. Os resultados obtidos na análise de expressão gênica mostraram que para os genes Runx2, Oc, Alpl, Rank-l e Er&alpha; a expressão no grupo MO foi maior que no grupo MC (p < 0,05), enquanto que para as células da calvária, CC teve maior expressão gênica que CO (p < 0,05). Os genes Opg e Er&beta; apresentaram variações de acordo com o grupo avaliado. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que existam alterações no metabolismo das células progenitoras e células diferenciadas após a indução da osteoporose e que as células da medula óssea apresentam um aumento da sua função como uma resposta compensatória neste modelo animal ovariectomizado. / Osteoporosis, a progressive bone disease, is considered a serious public health problem, being one of the most important conditions associated with aging, affecting millions of people worldwide. This multifactorial disease is characterized by reduced bone density and deterioration of bone microarchitecture. The objective of this work was to investigate the behavioral changes in mesenchymal cells from bone marrow and osteoblastic cells from calvaria bone of female rats induced to osteoporosis. After institutional review board approval, 18 Wistar female rats were used and divided into control and ovariectomized groups. After 150 days, the rats of both groups were sacrificed for collection of femurs and calvariae fragments. The cells collected from bone marrow and calvaria were cultured in 24-well plates (n=5) for the assessment of cell proliferation and viability, alkaline phosphatase (ALP) activity and detection and quantification of mineralized nodules. The data were submitted to Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests, with significance level set at 5%. The cells from bone marrow control group (MC) showed a significantly decrease in proliferation when compared to the cells from calvaria bone control group (CC) in all periods evaluated (p < 0,05). On the other hand, bone marrow cells from osteoporotic rats (MO) revealed a significant increase in their proliferation rate after 7 and 10 days (p < 0,01) compared to calvaria cells from ovariectomized rats (CO). Cell viability was higher in all investigated periods of CC and CO groups compared to MC and MO groups (p < 0,05). Alkaline phosphatase activity was not significantly different after 7 days of culture among the studied groups; in spite of that, after 10 and 14 days, there was a decrease in its activity in MC group when compared to CC (p < 0,01). In the osteoporotic rats, bone marrow cells showed an increase in this activity when compared to calvaria cells (p < 0,01). The analysis of mineralized nodules after 14 and 21 days revealed that control groups (CC and MC) did not have significant differences, whereas it was observed in MO group an increase in the mineralization when compared to CO in the same experimental periods. The data obtained in the analysis of gene expression showed that for Runx2, Oc, Alpl, Rank-l and Er&alpha; genes, the expression in MO group was higher than in MC (p < 0,05), whereas for the calvaria cells, CC group had higher gene expression than CO group (p < 0,05). The Opg and Er&beta; genes showed variations according to the evaluated group. Thus, it is suggested that there are changes in the metabolism of progenitor and differentiated cells after osteoporosis induction and that bone marrow cells present an enhancement of their function as a compensatory response in this ovariectomized rat model.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma. / The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.