Resumo: Mutantes foram obtidos através de tratamento mutagênico dos esporos de S. clavuligerus ATCC 27064 com metil-metanosulfonato. Um total de 822 colônias, obtidas por repiques sucessivos, foram selecionadas em testes qualitativos e/ou quantitativos. O melhor mutante S. clavuligerus 45.41, mostrou-se de duas a quatro vezes mais produtivo que a linhagem selvagem, e manteve-se estável após 35 repiques sucessivos ao longo deste estudo. O comportamento das linhagens foi investigado pela adição de diferentes diaminas ao meio de cultivo, uma a uma, na ausência de lisina. Também se investigou duas fontes distintas de C, além de compostos como o ácido 2,6- diaminopimélico. Um planejamento de dois fatores (cadaverina e lisina), três níveis, baseado no ponto central, faces centradas, indicou que a adição de lisina aumenta a produção de CefC para ambas as linhagens. O efeito positivo da cadaverina foi observado principalmente na linhagem mutante 45.41. Resultados obtidos em processo de batelada, em biorreator de bancada confirmaram as diferenças observadas entre as linhagens nos cultivos em frascos agitados. Procedimento de mutagênese clássica foi utilizado em conjunto com critérios bem definidos para se estabelecer um meio de cultura apropriado, com o objetivo de alcançar um aumento significativo da produção de CefC. Este é o primeiro estudo utilizando um mutante de S. clavuligerus obtido por mutagênese clássica, cuja produção de CefC é de três vezes maior que a da linhagem selvagem, em meios contendo diaminas / Abstract: Mutants were obtained by treating S. clavuligerus ATCC 27064 spores with methyl-methanesulfonate. A total of 822 colonies, obtained by successive sampling, were selected by qualitative and/or quantitative tests. The best mutant, S. clavuligerus 45.41, was two to four times more productive than the wild-type strain, and remained stable even after 35 successive samplings throughout the study. Strains behavior was investigated by adding different diamines in media, one by one, in the absence of lysine. Also investigated two different sources of C, and compounds such as 2,6-diaminopimelic acid. The two-factor (cadaverine and lysine), three-level, central composite-based, face-centered experimental design indicates that adding lysine increases CephC production for both strains alike. The positive effect of cadaverine was observed mainly in the Mutant 45.41 strain. Results obtained in batch-processes in a bench-scale bioreactor confirmed differences among strains observed in shaken flasks cultures. Classical mutagenesis procedures in conjunction with the adoption of well-defined criteria to establish an appropriate culture medium promoted a significant improvement in CephC production. It is the first study indicating an increase in CephC production in media containing diamines employing a mutant of S. clavuligerus obtained by classical mutagenesis / Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Pedro de Oliva Neto / Banca: Cecilia Laluce / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Banca: Cristina Paiva de Sousa / Doutor

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:05:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Messas_AnaLuizaFanchini_M.pdf: 999204 bytes, checksum: 0d58e169b0435d28b5a6d07b71f613c0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O ácido fítico é a principal fonte de armazenamento de fósforo em cereais e legumes, sendo que sua forma sal é denominada fitato. O fitato não é digerido pelo trato gastrointestinal de animais monogástricos e, na alimentação humana, o fitato é considerado um fator antinutricional devido à sua capacidade quelante para vários metais e por ligar-se às proteínas, conseqüentemente diminuindo a biodisponibilidade de proteínas e de minerais nutricionalmente importantes, como o zinco, ferro, cálcio, entre outros. Uma das estratégias mais efetivas para a redução do conteúdo de fitato em rações animais e alimentos tem sido a utilização de enzimas exógenas degradadoras de fitato, as fitases. Sendo assim, durante os últimos 20 anos intensificaram-se os estudos em busca de novas fontes desta enzima. A fitase está amplamente distribuída na natureza, sendo encontrada em animais, plantas e micro-organismos. A enzima presente em plantas é menos resistente ao tratamento térmico e é menos estável às condições fisiológicas do trato gastrointestinal, já a de microorganismos pode resistir a altas temperaturas, dependendo da linhagem. Neste estudo, realizou-se a produção, otimização do meio e das condições de cultivo e caracterização de fitase produzida pela bactéria Burkholderia sp. Foi definido como o meio de cultivo otimizado para a produção de fitase de Burkholderia sp. em frascos agitados em 72 horas de fermentação: fitato de sódio 0,075%, sacarose 0,16%, peptona bacteriológica 0,2%, MgSO4.7H2O 0,05%, KCl 0,05%, FeSO4.7H2O 0,0001%, MnSO4.H2O 0,00075% e CaCl2 0,01%. Foi possível aumentar a produção de fitase em 110% (1,01 U/mL para 2,12 U/mL). As condições de cultivo (agitação e temperatura) otimizadas para produção de fitase em frascos agitados foram 37°C e 250 rpm, após 48 horas de fermentação. Na caracterização bioquímica, a fitase apresentou pH ótimo em 5,5 e pH de estabilidade na faixa de 3 a 7, após 1 hora de incubação à 50°C. Apresentou temperatura ótima à 60ºC e mostrou-se estável após 1 hora de tratamento em temperaturas entre 25 e 50°C, demonstrando 40% de redução da atividade após 1 hora de tratamento à 60ºC. No estudo do efeito de íons, utilizando a concentração de 10 mM para os sais testados, os resultados mais expressivos foram o aumento da atividade de fitase em 41% com a adição de íons Ba2+ e a redução da atividade de fitase em 98% e 96%, respectivamente, com a adição de íons Fe2+ e Zn2+, inibindo quase totalmente a enzima. Para a concentração de 1 mM dos sais, a adição dos íons Mn2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+ e Fe3+ causou reduções significativas de atividade de fitase, em 61%, 45%, 45%, 31% e 30%, respectivamente. A fitase produzida por Burkholderia sp. apresentou valores de Km e Vmax de 0,02 mM e 6,20 'mol Pi/min/mg, respectivamente / Abstract: Phytic acid is the main source of phosphorus storage in cereals and legumes, and its salt is known as phytate. Phytate is not digested by the gastrointestinal tract of monogastric animals and, in food for human consumption, phytate is considered an antinutritional factor because of its ability in chelating various metals and binding to proteins, thereby reducing the bioavailability of proteins and nutritionally important minerals as zinc, iron, calcium, and others. One of the most effective strategies for reducing phytate content in animal feed and food for human consumption has been the use of exogenous enzymes that degrade phytate, the phytases. Thus, during the last 20 years, the studies to discover new sources of this enzyme have been intensified. Phytase is widely distributed in nature, being found in animals, plants and microorganisms. The enzyme present in plants is less resistant to heat treatment and is less stable under physiological conditions of the gastrointestinal tract, since the microorganisms can withstand high temperatures, depending on the strain. In this study, it was made the production, the optimization of the medium of culture and growing conditions and characterization of phytase produced by the bacteria Burkholderia sp. It was defined as the culture medium optimized for the production of phytase of Burkholderia sp. in shaken flasks, in 72 hours of fermentation: sodium phytate 0.075%, sucrose 0.16%, bacteriological peptone 0.2%, MgSO4.7H2O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4.7H2O 0.0001%, MnSO4.H2O 0.00075% e CaCl2 0.01%. It was possible to increase the production of phytase in 110% (1.01 U/mL to 2.12 U/mL). The growing conditions (rotation and temperature) optimized for production of phytase in shaken flasks were 250 rpm and 37°C, after 48 hours of fermentation in shaker. In biochemical characterization, phytase showed pH optimum at 5.5 and estability in the pH range of 3 to 7, after 1 hour of incubation at 50°C. Phytase showed optimum temperature at 60°C and remained stable after 1 hour of treatment at temperatures between 25°C and 50°C, showing 40% of reduction of the activity after 1 hour of treatment at 60°C. In the study of the effect of ions, using the concentration of 10 mM for the salts tested, the most importants results were the increase of the activity of phytase in 41% with the addition of Ba2+ and the decrease of the activity of phytase in 98% and 96%, respectively, with the addition of Fe2+ and Zn2+, almost completely inhibiting the enzyme. For the concentration of 1 mM of the salts, the addition of Mn2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+ and Fe3+ caused significant reductions in activity of phytase, in 61%, 45%, 45%, 31% and 30%, respectively. Phytase produced by Burkholderia sp. presented values of Km and Vmax of 0.02 mM e 6.20 'mol Pi/min/mg, respectively / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

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