No / A novel function of NF-KB in the development of most ectodermal appendages, including two types of murine pelage hair follicles, was detected in a mouse model with suppressed NF-KB activity (CI¿B¿¿N). However, the developmental processes regulated by NF-¿B in hair follicles has remained unknown. Furthermore, the similarity between the phenotypes of CI¿BA¿N mice and mice deficient in Eda A1 (tabby) or its receptor EdaR (downless) raised the issue of whether in vivo NF-KB regulates or is regulated by these novel TNF family members. We now demonstrate that epidermal NF-KB activity is first observed in placodes of primary guard hair follicles at day E14.5, and that in vivo NF-KB signalling is activated downstream of Eda A1 and EdaR. Importantly, ectopic signals which activate NF-KB can also stimulate guard hair placode formation, suggesting a crucial role for NF-KB in placode development. In downless and CI¿B¿¿N mice, placodes start to develop, but rapidly abort in the absence of EdaR/NF-KB signalling. We show that NF-KB activation is essential for induction of Shh and cyclin D1 expression and subsequent placode down growth. However, cyclin D1 induction appears to be indirectly regulated by NF-KB, probably via Shh and Wnt. The strongly decreased number of hair follicles observed in CI¿B¿¿N mice compared with tabby mice, indicates that additional signals, such as TROY, must regulate NF-KB activity in specific hair follicle subtypes.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25176号 / 医博第5062号 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武藤 学, 教授 萩原 正敏, 教授 永井 純正 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Confidentiel / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival. / HHV-6 est un virus herpès humain ubiquitaire. La plupart des individus deviennent séropositifs à l’âge de 2 ans. L’infection primaire par HHV-6 donne lieu à une maladie fébrile chez les enfants, appelée exanthème subitum ou la roséole. Par contre, chez l'adulte, cette infection cause des maladies de type mononucléose. L'infection reste généralement latente chez les individus sains, mais elle se réactive souvent chez les personnes immunodéprimées, par exemple, chez les personnes greffées et les patients atteints du sida. HHV-6 a été associé à plusieurs types de cancers et de désordres lymphoprolifératifs. Ce virus induit l’immunosuppression et inhibe la prolifération des lymphocytes par les mitogènes. C’est pour toutes ces raisons que nous voulions savoir si ce virus dérègle le cycle cellulaire des cellules qu’il infecte. Les travaux réalisés durant cette thèse ont porté sur les changements induits dans les cellules humaines par ce virus au cours de la progression du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'infection par HHV-6 retarde la progression du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire T humaine HSB-2, ainsi que dans les lymphocytes T primaires humains pour les accumuler dans les phases S et G2/M. Cependant, après avoir traité les cellules avec la nucléase du Micrococcus, nous avons constaté que le cycle cellulaire des cellules infectées s’accumulait plutôt dans la phase G2/M. La nucléase dégrade préférentiellement l’ADN virale. Nous avons observé une augmentation de l'activité kinase de cdc2 dans les cellules infectées malgré une baisse des niveaux de ses partenaires catalytiques, la cycline A et la cycline B. Nos études ont montré qu’il y a une diminution drastique de la protéine p21 dans les cellules infectées, en dépit de la stabilisation et de l'activation de p53 induite dans ces cellules. Ce qui laisse penser que la protéine p53 pourrait être inactive sur le plan transcriptionnel dans les cellules infectées. Cette diminution de p21 dans les cellules infectées est partiellement restaurée après incubation des cellules dans un milieu de culture contenant des inhibiteurs du protéasome. En plus, nous démontrons ici qu’une protéine virale précoce, p41, s’associe et se fixe avec cdc2 et augmente son activité kinase. Tous ces résultats suggèrent que HHV-6 provoque des perturbations énormes dans la progression normale du cycle cellulaire dans les cellules T humaines. Dans ces études, nous avons démontré aussi que l’infection par HHV-6 induit l'autophagie dans les cellules HSB-2, comme il a été démontré par l’induction de LC-3 II et par la formation de vacuoles autophagiques dans les cellules qui sont infectées. Nos résultats indiquent que HHV-6 inhibe la fusion entre les vacuoles autophagiques formées et les lysosomes dans les cellules infectées modulant ainsi la réponse autophagique des cellules hôtes infectées. Nous avons trouvé aussi que l’inhibition de ce processus par un inhibiteur pharmacologique diminue la réplication virale. L'autophagie est un processus physiologique cellulaire pendant lequel les vieux constituants cellulaires (mitochondries, protéines cellulaires, etc) se dégradent. Le fait que ce processus soit modulé dans les cellules dépendantes des différentes phases du cycle cellulaire, nous a poussé à l’étudier. Enfin, nous essayons d’investiguer la réplication virale dans les cellules dépourvues de p53, le gène suppresseur de tumeur, qui contrôle la progression de cycle cellulaire. Nous avons émis l’hypothèse suivante, que ces virus peuvent mieux se répliquer dans les cellules n’exprimant pas le gène p53. En vérifiant cette hypothèse, nous avons trouvé que l'inhibition de l’expression de p53 provoquée par siRNA ou par un agent pharmacologique conduit à une mort cellulaire massive dans une lignée de cellules T humaines ayant un gène p53 de type sauvage. Nous démontrons que cette mort se produit aussi dans une autre lignée cellulaire dont le p53 est muté et qu’elle pourrait être évitée par des inhibiteurs d'autophagie ou de nécroptose. Nos observations mettent en évidence qu’un niveau d’expression basale de p53 est nécessaire à la survie cellulaire.

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire. / Progression through the cell cycle is controlled by oscillating waves of cyclins and cyclin-dependent kinases (Cdk). These kinases are regulated positively by association with cyclin regulatory subunits and negatively by binding of Cdk inhibitors. Among the latter, p27 inhibits all cyclin-Cdk complexes regardless of the cell cycle phase and acts as a primary negative regulator of cell proliferation in a variety of cell types and tissues. Intrinsically, phosphorylated p27 is ubiquitinated and degraded by the SCFSkp2-Cks1 complex. Mouse genetic studies and human clinical investigations have shown p27 as an important tumor suppressor, which gene is rarely mutated. However, p27 is frequently downregulated in human cancers due to an increased expression of nuclear Cks1 and this is usually associated with a poor prognosis. The subcellular localization of Cks1 is thus of primordial importance in the control of cell proliferation. Recent results from our laboratory have shown an interaction between Cks1 and nuclear transport proteins α1 and β3 importin. Analysis of the primary sequence of Cks1 also revealed a classic nuclear localization signal (NLS) at its C-terminal. Mutations have been done on the suspected NLS to determine whether or not Cks1’s nuclear import is regulated by this motif. A synthetic inhibitor of β importin has also been used to study the mechanism of Cks1 import. Results indicated that the C-terminal end of Cks1 is indeed a NLS since mutations of Cks1 and inhibition of β importin both lead to accumulation of Cks1 in the cytoplasm. These outcomes were helpful to better understand the mechanism regulating Cks1 localization. However, future works are required to further understand the impact of cytoplasmic sequestration of Cks1 on cancer and hopefully lead to the identification of novel pharmacological targets involved in cell proliferation.

Un dérèglement du cycle cellulaire peut causer le cancer. Lors de la cytocinèse un anneau contractile d’actine et de myosine se forme, se contracte, et donne un anneau du midbody qui mène à l’abscision. Le processus de cytocinèse est sous le contrôle de protéines telles que la GTPase Rho qui active la cytocinèse et les cyclines-Cdks qui l'inhibent. La Drosophile possède 3 cyclines mitotiques CycA/ CycB/ CycB3 qui sont successivement dégradées en fin de mitose et permettent l'initiation de la cytocinèse. La dernière étape d’abscission est un phénomène qui reste encore peu connu. Les protéines Vps4 et CHMP4C liées à ANCHR vont, sous la dépendance de la kinase Aurora B, promouvoir l’abscision mais, suite à quelques études récentes, il semble y avoir une implication de la cycline B. Ici, le but était de tester l’implication de cette cycline dans les processus de cytocinèse et d’abscision, elle a été menée par microscopie à haute résolution en temps réel avec des cellules S2 de l’organisme Drosophila melanogaster par le suivi de protéines recombinantes fluorescentes. L’étude a été divisée en deux axes : gain et perte de fonction par l’intermédiaire respectivement de la protéine Cycline B recombinante stable, non dégradable (CycBstable-GFP) et l’inhibition par l’utilisation d’ARN double brin (ARNdb) sur l’endogène. La CycBstable-GFP a perturbé la cytocinèse en induisant plusieurs anneaux contractiles et midbodies. En revanche la réduction de l’expression de CycB n'a pas eu d’effet observable, et elle ne semble pas avoir d’action sur l’abscission malgré le recrutement de CycB-GFP au midbody tardif. En revanche la protéine Cdk1 semble avoir un rôle dans l'abscision puisque sa réduction d’expression a induit un délai. Elle a donc une implication potentielle sur la cytocinèse. / Dysregulation of the cell cycle can cause cancer. During cytokinesis a contractile ring of actin and myosin forms, contracts and gives rise to a midbody ring which controls abscission. The process of cytokinesis is controlled by proteins such as the Rho GTPase, which activates cytokinesis and cyclin-Cdks that inhibit cytokinesis. Drosophila has 3 mitotic cyclins CycA, CycB and CycB3, which are successively degraded at the end of mitosis to allow the initiation of cytokinesis. The last step of abscission is a phenomenon that is still obscure. The ESCRTIII components VPS4 and CHMP4C protein linked to ANCHR will, in an Aurora B kinasedependent manner, promote abscission with recent studies implicating Cyclin B at this stage. Here, the aim was to test the role of cyclin B in cytokinesis and abscission, using real-time, high resolution microscopy of Drosophila melanogaster S2 cells expressing recombinant fluorescent proteins. This study was divided into two parts: gain and loss of function studies respectively using stable non-degradable cyclin B (CycBstable-GFP) and inhibition by using CycB double-stranded RNA (dsRNA). The CycBstable-GFP perturbed cytokinesis by inducing multiple contractile rings and midbodies. However CycB depletion had no detectable effect on the progression of cytokinesis nor on abscission despite the recruitment of CycB-GFP to the late midbody. In contrast, the protein Cdk1 seemed to play a role in abscission, since its depletion induced a delay. It therefore has potential implications for cytokinesis.

La toxoplasmose, déterminée par le parasite Toxoplasma gondii, est l'une des infections les plus répandues au monde, en raison de la persistance à vie sous forme latente de ce parasite au sein de ces hôtes. Ce parasite fait partie des Apicomplexa et détourne les voies de signalisation de l'hôte par des mécanismes épigénétiques qui convergent vers des protéines nucléaires clés. Nous rapportons ici une nouvelle stratégie de persistance parasitaire impliquant la protéine de rhoptries ROP16 de T. gondii, sécrétée précocement lors de l'invasion, qui cible le facteur de transcription UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1) et induit un arrêt du cycle de la cellule-hôte. Ceci est induit par l'activité de la DNMT et le remodelage de la chromatine au niveau du promoteur du gène de la cycline B1 par le recrutement d’UHRF1 phosphorylé associé à un complexe protéique multienzymatique répressif. Cela conduit à la désacétylation et à la méthylation de l'histone H3 entourant le promoteur de la cycline B1 pour réduire de manière épigénétique son activité transcriptionnelle. De plus, l'infection par T. gondii provoque une hyper-méthylation de l'ADN dans la cellule hôte par la régulation positive des DNMTs. ROP16 est déjà connue pour activer et phosphoryler des facteurs de transcription de l'immunité protectrice tels que STAT 3/6/5 et le suppresseur tumoral p53 impliqué dans la progression du cycle cellulaire. De plus, ROP16 module ces voies de signalisation de l'hôte de manière souche-dépendante. Comme dans le cas de STAT3, les effets de ROP16 sur UHRF1 dépendent du polymorphisme d'un seul acide aminé du domaine kinase de ROP16. Ce travail montre que Toxoplasma module un nouvel initiateur épigénétique, UHRF1, via un événement précoce initié par la kinase parasitaire ROP16. / Toxoplasmosis, caused by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, is one of the most common infections in the world due to the lifelong persistence of this parasite in a latent stage in its hosts. T. gondii hijacks host signaling pathways through epigenetic mechanisms which converge on key nuclear proteins. Here we report a new parasite persistence strategy involving Toxoplasma rhoptry protein ROP16 secreted early during invasion, which targets the transcription factor UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1), and leads to host cell cycle arrest. This is mediated by DNMT activity and chromatin remodeling at the cyclin B1 gene promoter through recruitment of phosphorylated UHRF1 associated with a repressive multienzymatic protein complex. This leads to deacetylation and methylation of histone H3 surrounding the cyclin B1 gene promoter to epigenetically silence its transcriptional activity. Moreover, T. gondii infection causes DNA hypermethylation in its host cell, by upregulation of DNMTs. ROP16 is already known to activate and phosphorylate protective immunity transcription factors such as STAT 3/6/5 and the tumor suppressor p53 involved in cell cycle progression. Moreover, ROP16 modulates host signaling pathways in a strain-dependent manner. Like in the case of STAT3, the strain-dependent effects of ROP16 on UHRF1 can be attributed to a single amino-acid polymorphism in ROP16. This study demonstrates that Toxoplasma hijacks a new epigenetic initiator, UHRF1, through an early event initiated by the ROP16 parasite kinase.

Avaliamos neste estudo as expressões da ciclina D1 e da proteína p21, pela técnica de Imuno-histoquímica, para detectar a presença destas proteínas nos núcleos das células do câncer de mama localmente avançado, com o objetivo de correlacionar a concentração destas proteínas com aresposta preditiva ao tratamento quimioterápico neo-adjuvante, utilizandoo esquema docetaxel associado à epirrubicina. A avaliação foi feita previamente e após a realização da quimioterapia neo-adjuvante. A avaliação pré-quimioterápica teve a finalidade de estabelecer um papel preditivo quanto à resposta ao tratamento primário. A avaliação pós-quimioterápica teve a finalidade de explorar a relação entre a persistência da proteína com intervalo livre de doença e sobrevida global. Foram selecionados 72 casos de 162 tumores localmente avançados de mama atendidos no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2005, tratados por quimioterapia primária no Ambulatório de Mastologiado Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. Conclusão: a ciclina D1 está relacionada com tumores menores, bem diferenciados e hormônio-sensíveis. Já a proteína p21 está relaciona a tumores pequenos, com estádios iniciais menores, de baixo grau histológico e hormônio-sensíveis. A expressão da ciclina D1 no tumor pré-tratamento quimioterápico não foi capaz de predizer resposta à quimioterapia neo-adjuvante. No entanto, a presença da ciclina D1 e no tumor residual e da p21tanto no tumor pré-tratamento quanto no tumor residual, sugerem melhora no intervalo livre de doença e na sobrevida global. / We evaluate in this study the expressions of the cyclin D1 and the protein p21, with the technique of Immunohistochemistry, todetect the presence of these proteins in the cells of the local advanced breast cancer. The objective was correlate the concentration of these proteins with predictive response to the neo-adjuvant chemotherapy, using docetaxel associated with epirrubicina. The evaluation was performed before and after the neo-adjuvant chemotherapy. The evaluation before the neo-adjuvant treatment had the purpose to establish a predictive value of these proteins with primary treatment response. The evaluations after neo-adjuvant treatment had the purpose to explore the relation between the persistence of these proteins with disease-free survival and overall survival. We selected 72 of 162 cases of local advanced breast cancer who had treated for primary chemotherapy in Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto in the period of January of 1998 to December of 2005. Conclusion: Our study concluded that the cyclin D1 is related with small tumors and well differentiated and hormone-sensitive tumors. The protein p21 is relates with small tumors, initial stage tumors, low grade tumors and hormone-sensitive tumors. The expression of cyclin D1 in the tumor before the treatment failed to predict response to the neo-adjuvant chemotherapy. However, the presence of the cyclin D1 in the residual tumor andthe protein p21 before the treatment and in the residual tumors suggest improvement in the disease- free survival and overall survival.