Epilepsy is a chronic neurological disease characterized by recurrent, unprovoked seizures. Evidence suggests that inflammation plays a role in the pathophysiology of seizures. Although cysteinyl leukotrienes (CysLTs) have been implicated in seizures, no study has investigated whether blocking of CysLT1 receptors potentiates the anticonvulsant action of classic antiepileptic drugs, as well as the expression of CysLT receptors is altered by inflammation. In this study we showed that the inverse agonist of CysLT1 receptor, montelukast, synergistically increases the anticonvulsant action of phenobarbital against seizures induced in a model of acute injection of pentylenetetrazole (PTZ). Furthermore, it is shown that LTD4 (leukotriene D4) prevents the effect of montelukast. Isobolographic analysis revealed an ED50 mix value for a fixed-ratio combination (1:1 proportion) of montelukast plus phenobarbital of 0.06 ± 0.02 μmol, whereas the calculated ED50 add value was 0.49 ± 0.03 μmol. The interaction index was 0.12, indicating a synergistic interaction. Montelukast significantly decreased the antiseizure DE50 for phenobarbital (0.74 and 0.04 μmol in the absence and presence of montelukast, respectively) and, consequently, phenobarbital-induced sedation at equieffective doses. We also investigated whether the CysLT1 inverse agonist montelukast and a classical anticonvulsant, phenobarbital, decrease seizures in PTZ-kindled mice and CysLT receptor expression. Montelukast (10 mg/kg, s.c.) and phenobarbital (20 mg/kg, s.c.) increased the latency to generalized seizures in kindled mice. Montelukast increased CysLT1 immunoreactivity only in non-kindled PTZ-challenged mice. Interestingly, PTZ challenge decreased CysLT2 immunoreactivity only in kindled mice. CysLT1 antagonists seem to emerge as promising adjunct therapeutic agents in the treatment of refractory seizures. Notwithstanding, additional studies are necessary to evaluate the clinical implications of this work. / A epilepsia é uma doença que se manifesta por crises epilépticas recorrentes, não provocadas. Evidências sugerem que a inflamação desempenha um papel na patofisiologia destas crises. Embora os leucotrienos cisteínicos (CysLTs) tenham sido implicados no desenvolvimento de crises convulsivas, nenhum estudo investigou se o bloqueio dos receptores CysLT1 potencializa a ação anticonvulsivante de antiepilépticos clássicos, assim como se a expressão dos receptores de CysLT é alterada por inflamação. Neste estudo mostramos que o agonista inverso de CysLT1, montelucaste, sinergicamente aumenta a ação anticonvulsivante do fenobarbital contra crises convulsivas induzidas em um modelo de injeção aguda de pentilenotetrazol (PTZ). Além disso, é mostrado que o LTD4 (leucotrieno D4) previne o efeito do montelucaste. A análise isobolográfica revelou que o valor de DE50 mix, calculado experimentalmente para uma combinação de proporção 1: 1 de montelucaste e fenobarbital foi de 0,06 ± 0,02 umol, ao passo que o valor de DE50 add, calculado foi de 0,49 ± 0,03 umol. O índice de interação encontrado foi de 0,12, indicando uma interação sinérgica. A associação dos fármacos diminuiu significativamente o DE50 para o efeito anticonvulsivante do fenobarbital de 0,74 para 0,04 umol (na ausência e na presença de montelucaste, respectivamente) e, consequentemente, a sedação induzida por fenobarbital em doses equieficazes. Posteriormente foi avaliado se o montelucaste e o fenobarbital diminuem as crises convulsivas em animais previamente abrasados, assim como se o tratamento farmacológico ou o abrasamento alteram a expressão de receptores CysLTs. O montelucaste (10 mg/kg; s.c.) e o fenobarbital (20 mg/kg, s.c.) aumentaram a latência para crises convulsivas generalizadas em camundongos abrasados. O montelucaste aumentou a imunorreatividade do receptor CysLT1 em camundongos não abrasados e que foram desafiados por PTZ que não foram abrasados. Entretanto, o desafio de PTZ diminuiu a imunorreatividade do receptor CysLT2 apenas em camundongos abrasados. Antagonistas do receptor CysLT1 parecem emergir como agentes terapêuticos adjuntos promissores no tratamento de crises refratárias. Não obstante, estudos adicionais são necessários para avaliar as implicações clínicas deste trabalho.

Dans cette étude, nous avons démontré par des essais de type Pull-Down la capacité de la queue C-terminale du CysLT1 d'interagir in vitro avec les importines [alpha]1, [alpha]4 et [alpha]5. Cette interaction est comparable à celle du NLS de l'antigène grand T du SV40 et du NLS de la nucléoplasmine de Xenopus laevis avec les mêmes importines. Nos études démontrent aussi que les déterminants structuraux de l'interaction ne sont pas limités seulment au NLS: des mutations dirigées contre les résidus-clé qui forment le NLS n'ont pas empêché l'interaction entre la queue C-terminale et les importines. Nos résultats suggèrent que d'autres résidus que ceux qui forment le NLS potentiel sont impliqués dans la liaison avec les importines. Nous avons démontré pour la première fois la phosphorylation in vitro de la queue C-terminale du CysLT1 par la PKA, et que cette phosphorylation peut moduler la capacité d'interaction avec l'importine [alpha]4. Nos travaux visaient aussi l'étude de l'expression cellulaire du récepteur CysLT1 et de son comportement suite à une stimulation au LTD[indice inférieur 4] .--Résumé abrégé par UMI.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Growing evidence has shown that leukotrienes are important contributors in the pathophysiology of several SNC inflammatory diseases where excitotoxicity is involved, including traumatic brain injury, encephalitis, Parkinson's disease, ischemia, epilepsy and neuropathic pain. However little is known about the molecular mechanism by which leukotrienes facilitate excitatory activity in the brain. Thus, in this study we investigated the effect of antagonists for cysteinyl leukotrienes receptors (CysLT) on PTZ-induced seizure in mice. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelukast (0.03 and 0.3 μmol) and pranlukast (1 and 3 μmol), increased the latency to generalized seizures and decreased the mean amplitude of EEG recordings during seizures. LTD4 (0.2 and 2 pmol) reverted the anticonvulsant effect of montelukast (0.3 μmol). Montelukast (0.03 and 0.3 μmol) prevented PTZ-induced BBB disruption, an effect that was reversed by LTD4 (6 pmol). In addition, doses of LTD4 (0.2 and 2 pmol) which reversed the effect of montelukast in crisis did not alter the protective effect of montelukast on the barrier, dissociating the anticonvulsant of protective effect on BBB. The confocal microscopy analysis revealed that 1. PTZ increased the number of CD45+ and IgG cells in cerebral cortex, indicating BBB leakage with leukocyte infiltration; 2. while LTD4 (6 pmol) potentiated, montelukast decreased the effect of PTZ on leukocyte migration. Considering that increase levels of leukotrienes and decrease in Na+,K+-ATPase are common findings in several excitotoxic conditions, including epileptic seizures, we also investigated the effects of LTD4 on the activity of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices. LTD4 10 and 100 nM decreases Na+,K+-ATPase activity alpha 2, 3 and alpha 1 subunits, respectively, in mice hippocampal slices. The inhibitory effect of LTD4 on Na+,K+-ATPase activity was not observed in hippocampal homogenates, indicating that it requires intact cells. Moreover, we showed that LTD4-induced decrease Na+,K+-ATPase activity was reversed by CysLT1R inverse agonis, montelukast (1 μM). In addition, we also showed that possibly the PKC activation pathway is involved in LTD4-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices, since PKC inhibitor, GF 109203X (0,3 μM), prevent this effect. Finally, but not least important, we have demonstrated that animals injected with LTD4 (2 pmol/3 μL icv), there also occurs a decrease in Na+,K+-ATPase activity, corroborating our in vitro findings and confirming the biological importance of this work. In summary, we showed that CysLT1 receptor activation modulates hippocampal Na+,K+-ATPase activity in mice, suggesting a possible mechanism for the involvement of leukotrienes in several dosorders related with brain inflammation and hyperexcitability. / Evidências crescentes têm mostrado que os leucotrienos são importantes contribuintes na patofisiologia de diversas doenças inflamatórias do sistema nervoso central nas quais a excitotoxicidade esteja envolvida, incluindo trauma crânio-encefálico, encefalite, doença de Parkinson, isquemia, dor neuropática e epilepsia. Entretanto pouco se sabe sobre o mecanismo molecular pelo qual os leucotrienos facilitam a atividade excitatória no encéfalo. Assim, neste trabalho investigamos o efeito de antagonistas para receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLT) sobre as convulsões induzidas por PTZ em camundongos. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) e pranlucaste (1 and 3 μmol), aumentaram a latência para as crises e diminuíram a amplitude média do EEG durante as crises. Montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) preveniu a ruptura da BHE induzida pelo PTZ, e o efeito foi revertido pelo LTD4 (6 pmol). Além disso, as doses de LTD4 (0.2 and 2 pmol) que reverteram o efeito do montelucaste nas crises não alteraram o efeito protetor do montelucaste sobre a barreira, dissociando o efeito anticonvulsivante do efeito protetor sobre a BHE. As análises de microscopia confocal revelaram: 1) PTZ aumentou o número de células CD45+ e IgG no córtex, evidenciando a ruptura da BHE; 2) enquanto o LTD4 (6 pmol) potencializou, o montelucaste diminuiu o efeito do PTZ sobre a migração leucocitária. Considerando que níveis aumentados de leucotrienos e diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase são achados comuns em diversas condições excitotóxicas, incluindo crises epilépticas, também investigamos o efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+- ATPase em fatias de hipocampo de camundongos. LTD4 nas doses de 10 e 100 nM, diminuiu a atividade das subunidades alfa 2/3 e alfa 1, respectivamente. O efeito inibitório do LTD4 na atividade da Na+,K+-ATPase não foi reproduzido quando realizado com homogeneizado de hipocampo, indicando que esse efeito requer a célula intacta. A fim de nos certificarmos de que o LTD4 (10 nM) estava se ligando ao receptor CysLT1, incubamos as fatias com anticorpo anti- CysLT1, e verificamos que, na presença do anticorpo, o LTD4 perde o efeito. Além disso, observamos que a diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase induzida pelo LTD4 foi revertida pelo montelucaste (1 μM), agonista inverso dos receptores CysLT1. Neste trabalho mostramos ainda que a ativação da PKC possivelmente esteja envolvida no efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de camundongos, uma vez que o GF 109203X (0,3 μM), inibidor da PKC, preveniu esse efeito. Por fim, mas não menos importante, também demonstramos que em animais injetados i.c.v. com LTD4 (2 pmol/3 μL, i.c.v.), também ocorre uma diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase, corroborando com nossos achados in vitro e confirmando a importância biológica deste trabalho. Assim, este trabalho mostrou evidências do envolvimento dos receptores CysLT1 nas crises induzidas por PTZ bem como na permeabilidade da BHE, sendo a modulação da enzima Na+,K+-ATPase um possível mecanismo para a implicação dos leucotrienos em diversas doenças do SNC relacionadas com inflamação e hiperexcitabilidade.