Titre de la thèse : Développement de thérapies adjuvantes associées à l'anti-cytoadhérence. Résumé : L'antigène de surface PfEMP-1 (P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein-1) encodé par 60 gènes de la famille var du parasite, est un facteur de virulence du paludisme touchant l'Homme. Les différents variants de PfEMP-1 sont impliqués dans la cytoadhérence des érythrocytes infectés par P. falciparum (iRBCs) avec plusieurs récepteurs de l'endothélium vasculaire de l'hôte. Parmi eux, l'interaction avec ICAM-1 semble être liée à des manifestations sévères de la maladie telles que le paludisme cérébral. La majorité de la mortalité due à un paludisme sévère est observée dans les 24 heures après admission à l'hôpital, malgré l'utilisation d'antipaludiques efficaces, soulignant ainsi un besoin urgent en thérapies adjuvantes ciblant spécifiquement la cytoadhérence.Le site d'interaction d'ICAM-1 avec les érythrocytes infectés a été identifié au niveau du « BED side » de son domaine N-terminal, similaire à celui des immunoglobulines. Les variants antigéniques de P. falciparum capables de se lier à ICAM-1 présentent des différences subtiles au niveau des résidus responsables de cette interaction. La boucle DE semble être l'élément commun des sites de fixation à ICAM-1 pour trois variants de P. falciparum (ITO4-A4, ITO4-C24 and ItG-ICAM) et fut ainsi choisie par le groupe de Matthias Dormeyer comme cible pour un criblage in silico. Une librairie de structures de petites molécules fut criblée en utilisant une technique d'alignement moléculaire fournie par le programme 4Scan. Grâce à cette étude, la molécule (+)-epigalloyl-cathechin-gallate (EGCG) fut identifiée comme un inhibiteur d'interaction très spécifique et dose-dépendant pour deux des trois variants.Notre projet fut de développer des composés anti-adhésifs capables d'inhiber ou de supprimer l'interaction des hématies infectées avec les récepteurs endothéliaux. Tout d'abord, nous avons réalisé une série de substitues tetrahydroisoquinolines, analogues au composé naturel EGCG précédemment découvert. Ensuite, nous avons basé notre recherche sur la synthèse de composés peptidiques simulant des régions spécifiques d'ICAM-1 qui peuvent être impliquées dans l'interaction avec les variants de PfEMP1. Le design de ces peptides a été dirigé par le groupe du Prof. Tramontano sur la base d'analyses in silico de l'interaction moléculaire entre ICAM-1 (dont la structure cristallographique est connue) et un modèle de PfEMP1. Nous avons étudié les propriétés d'inhibition de la cytoadhérence de plusieurs de ces peptides afin de créer une base pour le design de molécules peptidomimétiques dotées de meilleures propriétés médicamenteuses.Finalement, afin d'élargir notre étude, EGCG a été criblé contre un panel de nouveaux isolats de P. falciparum provenant de patients et capables d'interagir avec ICAM-1. Ses propriétés anti-adhésives ont été étudiées afin de connaitre l'impact des variations de ces souches sur l'interaction et pour guider le design d'un inhibiteur de cytoadhérence à large spectre.INTITULÉ ET ADRESSE DE L'U.F.R. OU DU LABORATOIRE : - Prof. Giuseppe Campiani - Università degli Studi di Siena - Dipt. Farmaco-Chimico Tecnologico. Via Aldo Moro, 2, 53100, Siena (Italy) - Prof. Alister Craig – Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool, L3, 5QA, UK. / Thesis title-: Development of anti-cytoadherence adjunct therapies.Thesis abstract-Parasite derived surface antigen PfEMP-1 (P. falciparum erythrocyte membrane protein-1) encoded by 60 var genes, is a virulence factor of the human malaria parasite. PfEMP-1 variants have been implicated in the cytoadherence of P. falciparum infected erythrocytes (iRBCs) to several binding receptors on host vascular endothelium. Among them, binding to ICAM-1 seems to be related to severe manifestations of the disease such as cerebral malaria. The majority of the mortality with severe malaria is seen within 24 hours of hospital admission despite the use of effective anti-parasite drugs, therefore the development of adjunctive therapies specifically targeting cytoadherence is urgently needed.The binding site for iRBC has been mapped to the BED side of the N-terminal immunoglobulin-like domain of ICAM-1, and shows subtle differences in the contact residues used by ICAM-1 binding P. falciparum antigenic variants. The DE loop appears to be a common feature of the ICAM-1 binding sites for three P. falciparum variants (ITO4-A4, ITO4-C24 and ItG-ICAM) analyzed and was selected by Matthias Dormeyer group for in silico screening of a small-molecule structures library using a molecular-alignment technique based on the program package 4Scan. From this study, (+)-epigalloyl-cathechin-gallate (EGCG) was found to inhibit binding of two variant ICAM-1 binding parasites in a highly specific, dose-dependent manner.Our approach to this need has been the development of anti-adhesive compounds to inhibit and reverse the binding of iRBCs to endothelial receptors. Firstly, we developed a series of substituted tetrahydroisoquinolines as analogues of the natural compound EGCG previously identified. Secondly, we based our research on the synthesis of peptidic compounds mimicking specific ICAM-1 regions hypothesized to be involved in the binding with disease-relevant PfEMP1 variants. The design of the peptides has been conducted by the group of Prof. Tramontano on the basis of an in silico analysis of the molecular interaction between ICAM-1 (whose crystal structure is known) and a homology model of PfEMP1. We have evaluated several peptides for their cytoadherence blocking properties and the results of this studies could form the basis for the design of peptidomimetics endowed with better drug-like properties. Finally, to extend previous studies, EGCG has been screened against a panel of new ICAM-1 binding patient isolates of P. falciparum for its anti-adhesive properties to investigate the impact of iRBC strain variation and to guide the design of a broad-spectrum cytoadherence inhibitor.TITLE AND ADDRESS OF LABORATOIRE : Prof. Giuseppe Campiani - Università degli Studi di Siena - Dipt. Farmaco-Chimico Tecnologico. Via Aldo Moro, 2, 53100, Siena, Italy. Prof. Alister Craig – Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool, L3, 5QA, UK.

Malaria is a disease of global importance, causing hundreds of thousand of deaths a year. The majority or deaths are caused by Plasmodium falciparum, a parasite transmitted by the mosquito Anopheles. Its pathogenicity largely results from an ability to transform infected erythrocytes by creating knob-like structures that result in endothelial adhesion. Two major components of these knob structures have been identified as P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) and knob-associated histidine rich protein (KAHRP). The extracellular fragment of PfEMP1 is responsible for antigenic variability and cytoadherence while its intracellular domain (ATS) connects to the cytoskeleton via interactions with other plasmodium-encoded proteins. In addition, perforin-like proteins (PLPs) with a MACPF domain have been identified in the genome of Plasmodium. PLPs are highly conserved and are expressed in various life-cycle stages of the parasite. They are believed to form pores in membranes of the host cell but their structure is yet unknown. The aim of the work in this thesis was to obtain new information about the structure and role of malaria proteins, thus giving a better understanding of the disease and its possible treatment. Studies of numerous designed constructs of the ATS family were carried out using biophysical methods including high resolution NMR and CD. These revealed that ATS domains are mainly unstructured with a relatively small folded core, consisting of a bundle of α-helices. Surprisingly, no evidence could be found for ATS binding to KAHRP in solution conditions although previous pull-down data had indicated an interaction. Bioinformatics analysis and yeast-two-hybrid data suggested, however, that there is a conserved protein interaction epitope on the central flexible part of ATS. It was shown, using fluorescence anisotropy measurements, that this part of ATS associates with a parasite protein containing a PHIST (Plasmodium helical interspersed sub-telomeric) domain. Expression constructs of the PLP protein family were designed and manufactured, with the aim of enabling structural studies of this putative pore protein.

Plasmodium falciparum is a human intracellular parasite that is the causative agent of a deadly form of malaria. This species alone is responsible for 200 million cases of malaria annually resulting in over 1 million deaths worldwide. The excessive mortality due to P. falciparum infection is due to its ability to cause severe pathogenesis through hyperparasitemia and cytoadherence defined as the ability of infected red blood cells to adhere to host vasculature. Cytoadherence is mediated through the export of parasite proteins to the surface of the infected red blood cell (RBC). Exported proteins have been identified but the pathway for protein export is still being elucidated. Many protein coding genes in the P. falciparum genome are hypothetical and therefore still need to be studied. Random transposon mutagenesis using the piggyBac transposable element in P. falciparum has given us a library of mutants to use for forward genetic studies. In this work, we describe a novel approach for screening P. falciparum piggyBac mutants to look for differences in cytoadherence. We utilized an image-based approach in order to quantify cytoadherence in P. falciparum NF54 wild-type and thirty-four piggyBac mutants. We found cytoadherence to be affected by the expression of genes with specific gene ontologies including nucleic acid metabolism and post-translational modification. Many of these genes are annotated as hypothetical or putative and this work may result in further revelations of a role for these genes in parasite pathogenesis. We further characterized a piggyBac mutant that was increased in cytoadherent abilities as an atypical mitogen-activated protein kinase phosphatase (MKP) named PfMKP1. We were able to demonstrate phosphatase activity in a generic substrate-based assay and identify a putative substrate as mitogen-activated protein kinase 1 (Pfmap1). Furthermore, we found Pfmap1 to be differentially phosphorylated and a difference in localization (through immunofluorescence assay) in the PfMKP1 mutant line compared to the wild-type and complemented mutant. This adds to the recent work characterizing this gene as important in cell cycle progression within the erythrocytic cycle and lends to the hypothesis of a functioning mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in P. falciparum for which it is currently unknown. Supplementary work focused on the development of tools to further investigate the MAPK pathway and the role for PfMKP1 as an atypical MKP of Pfmap1 in this pathway. A mass spectrometry-based technique was developed to look at Pfmap1 and its potential active state based on its phosphorylation status. This approach needs further development but the methods are described here within. In addition, the tools needed to further characterize the binding interaction between PfMKP1 and Pfmap1 were established. The mass spectrometry screen and immunofluorescence screening of Pfmap1 can further our knowledge of the MAPK pathway in P. falciparum and lead to the identification of external stimuli that can induce growth or stress response in the parasite. Taken together, the elucidation of mechanisms for cytoadherence and signal transduction pathways in the parasite can lead to new drug target identification.

Ce travail a eu pour objectif de caractériser les parasites P. falciparum, infectant les femmes enceintes et responsables du paludisme associé à la grossesse. Dans la première partie de ce travail, le phénotype d’adhérence et le profil d'expression des gènes var chez les parasites infectant les femmes enceintes ont été étudiés. Ces analyses ont été réalisées sur des isolats parasitaires collectés dans deux études menées au Bénin entre 2008 et 2013. La première étude, sur des isolats prélevés dans le cadre d'une étude de cohorte de femmes enceintes dans les zones rurales au Bénin, a montré que les parasites qui infectent les femmes dans le premier trimestre de la grossesse expriment déjà un phénotype placentaire. Dans une deuxième étude, portant sur les isolats prélevés en prospective chez des femmes enceintes se présentant en consultations prénatales dans les centres de santé à Cotonou, une analyse plus détaillée des propriétés d'adhérence des hématies parasitées par P. falciparum, a confirmé nos premiers résultats. Cette étude a souligné une plus grande complexité dans les propriétés d’adhérence des isolats obtenus pendant le premier trimestre de grossesse qui adhèrent sur plusieurs récepteurs. Tout au long de la grossesse cette diversité phénotypique s’affine vers des phénotypes typiquement placentaires. Ce travail a également démontré, qu'au-delà de la parasitémie, l'adhérence à la CSA est un facteur important au regard de l’issue défavorable de la grossesse ; les parasites qui infectent les primigestes adhèrent en moyenne plus à la CSA que ceux provenant des multigestes. Conformément aux travaux antérieurs, les études menées au Bénin ont montré que le gène var2csa est le membre de la famille des gènes var qui est préférentiellement transcrit par les parasites infectant la femme enceinte. L’expression de la protéine correspondante à la surface des érythrocytes infectés a été démontrée grâce à des anticorps spécifiques. Cette expression a été étroitement associée à la capacité des isolats à adhérer, in vitro, à la CSA. La deuxième partie de ce travail a examiné le potentiel vaccinal de VAR2CSA par l’exploration des régions peptidiques impliquées dans l'acquisition d'anticorps « anti-adhérence ». En utilisant une approche d'immunisation génétique chez la souris, nous avons été en mesure d'identifier la région minimale de VAR2CSA située dans son extrémité N-terminale comme étant le site qui concentre les épitopes anti-adhérence. Les IgG induites contre la région NTS-DBL2X de VAR2CSA ont été capables d’inhiber l'adhérence de plus de 60% ??des isolats naturels de P. falciparum à la CSA. Cette étude a par ailleurs mis en évidence des propriétés fonctionnelles des IgG qui seraient souche-spécifique ainsi qu’a aidé à formuler une hypothèse concernant la combinaison antigénique des variants de VAR2CSA nécessaires pour garantir une activité optimale sur des isolats de terrain. La dernière partie de ce travail a porté sur l'analyse du polymorphisme des séquences de VAR2CSA dans sa partie N-terminale chez les isolats de terrain. Ces analyses ont démontré l'existence d'une région dimorphique dans le domaine structurellement critique ID1, qui a révélé une association très intéressante avec la survenue d'infections à très forte densité de parasite. Le travail développé dans cette thèse a permis de mettre à jour les connaissances sur les parasites qui infectent les femmes pendant la grossesse et de formuler des hypothèses sur les pistes d'optimisation moléculaire, nécessaires au développement d'un vaccin efficace à base de VAR2CSA. / This thesis aimed to characterize the P. falciparum parasites infecting pregnant women and causing pregnancy-associated malaria (PAM). In the first part of this work, cytoadherence phenotype and var genes expression profile of pregnant women parasites have been investigated on parasite isolates collected in two studies conducted in Benin between 2008 and 2013. The first study on isolates collected as part of a cohort study of pregnant women in rural areas in Benin, showed that parasites which infect women in the first trimester of pregnancy already express placental phenotype. In a second study on isolates collected prospectively from pregnant women attending antenatal clinics in health centers in Cotonou, the analysis of the adhesion phenotype using multiple host receptors described so far confirmed the first results and highlighted a greater complexity of the binding properties in isolates collected during the first trimester and those obtained from multigravidae. This study also demonstrated that beyond parasitaemia, adhesion to CSA is a major factor for poor pregnancy outcomes. Consistent with previous reports, studies in Benin showed that var2csa was the most transcribed var gene by PAM-isolates and its surface expression on infected erythrocyte (IE) was demonstrated with specific antibodies. This was closely linked to the ability of isolates to adhere to CSA in vitro. The second part of the work investigated the vaccine potency of VAR2CSA by exploring the region of var2csa involved in the acquisition of anti-adhesion antibodies. Using a DNA immunization approach performed in mice, we were able to identify the var2csa minimal region located in its N-terminus as the site that concentrates the anti-adhesion epitopes. The NTS-DBL2X region of VAR2CSA has been found to induce cross-reactive antibodies that inhibit adhesion of more than 60% of field P. falciparum isolates to CSPG. This study highlighted some strain-specific properties in functionality of the antibodies induced and helped formulate a hypothesis of antigenic FCR3 and 3D7 variants combination for optimal activity on field isolates. The last part of this work focused on the analysis of sequence polymorphism in the N-terminal part of VAR2CSA expressed by field isolates. The analysis demonstrated the existence of a dimorphic region within the structurally critical ID1 domain that revealed a very interesting association with the occurrence of infections with very high parasite density. The work developed in this thesis updates knowledge on parasites infecting women during pregnancy and formulates hypotheses on the molecular optimization tracks necessary for the development of an effective VAR2CSA-based vaccine.

La forte prévalence des hémoglobinopathies, notamment l'HbAS, l'HbC et l'α-thalassémie dans des zones d'endémie palustre est considérée comme la conséquence de la protection qu'elles procurent contre les formes létales du paludisme. De nombreux mécanismes ont été évoqués pour expliquer cette protection, ne sont pas cohérentes avec toutes les observations épidémio-cliniques disponibles. La première partie de ces travaux de thèse a abordé la réduction de la cytoadhérence des globules rouges (GR) parasités comme mécanisme potentiel commun aux trois hémoglobinopathies. Pour explorer plus en profondeur ce mécanisme, nous avons mené une étude comparative des phénotypes de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum obtenus chez des patients HbAS et HbAC et HbAA. Cela avait pour but de déterminer si l'HbAS et l'HbAC jouaient un rôle dans la sélection et le maintien des souches virulentes de P. falciparum dans la nature. La deuxième partie de la thèse a concerné l'influence du trait drépanocytaire (HbAS) sur la déformabilité des GR non parasités d'une part et sur la rétention splénique des GR non parasités et parasités par les formes jeunes de P. falciparum d'autre part. Nous avons observé que l'adhésion des GR parasités aux cellules endothéliales micro-vasculaires humaines ainsi qu'aux monocytes était réduite avec les GR α-thalassémiques par rapport aux GR HbAA. Aucune différence statistiquement significative n’a en revanche été observée entre les profils de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum issus de sujets HbAA, HbAS ou HbAC. L’étude de la déformabilité des GR a montré que les GR HbAS sont légèrement mais significativement moins déformables que les GR HbAA. En revanche, les GR HbAS parasités par les jeunes parasites de P. falciparum (anneaux) n’étaient pas plus retenus que leurs homologues HbAA dans la rate humaine isolé perfusée ex vivo, ou en microsphiltration, quelles que soient les conditions d’oxygénation. Nous n’avons observé aucune différence au niveau du taux de falciformation entre les GR parasités et non parasités que ce soit avec les GR HbAS ou avec les GR HbSS. En conclusion, nous proposons que la réduction de la cythoadhérence et la rétention splénique des GR contenant les formes matures de P. falciparum constituent un mécanisme commun à la protection des sujets HbAS, HbC et α-thalassémiques contre le paludisme. Ces deux phénomènes interconnectés peuvent rendre compte de l’ensemble des observations épidemio-cliniques disponibles sur la protection conférée par ces hémoglobinopathies. / The high prevalence of several inherited hemoglobin disorders, namely sickle cell trait (HbAS), HbAC and α-thalassemia, in malaria endemic areas is thought to be the consequence of their protective effects against malaria life-threatening manifestations. Numerous potential mechanisms have been proposed to explain this protective effect although many of them are not fully consistent with all available epidemiologic and clinical data. The first part of this thesis work explored the reduction of cytoadherence of infected RBC as a potential common mechanism for α-thalassemia-, HbAS- and HbAC-induced protection against malaria. To further explore this mechanism, and determine whether HbAS and HbAC select and maintain virulent P. falciparum parasite in nature, we compared the cytoadherence phenotype of P. falciparum isolates obtained from HbAS/HbAC and controls HbAA patients. The second part of the thesis work addressed the influence of HbAS on the deformability of uninfected RBC as well as the splenic retention of both uninfected RBCs and ring-infected RBCs. We observed a reduced adherence of α-thalassemic infected RBCs to human micro-vascular endothelial cells and monocytes compared to controls HbAA infected RBCs. The reduction was correlated to the number of non functional α- gene. Expression of PfEMP-1 on the surface of α- thalassemic infected RBCs was lower than on the surface of HbAA infected RBCs. There was no statistically significant difference between the cytoadherence of P. falciparum isolates obtained either from HbAS/HbAC or control HbAA malaria patients. The deformability of uninfected HbAS RBCs was slightly but significant lower than that of control uninfected HbAA RBCs. Retention rates of ring-infected HbAS and HbAA RBCs were similar either in human isolated spleen perfusion ex vivo and in microsphilters in vitro regardless of the oxygenation level. We did not observe any enhanced sickling of ring-infected RBCs compared to non infected RBCs, both in HbAS and HbSS samples. Based on these results along with available epidemiologic and previous experimental data, we propose a common malaria-protective mechanism of HbAS, HbAC and α-thalassemia whereby these hemoglobin disorders reduce the cytoadherence of mature P. falciparum-infected RBCs that stay in circulation where they are exposed to an enhanced splenic retention. These 2 mechanisms would act in conjunction to slower the rise of parasites loads in infected patients and protect them from sequestration-related complications of malaria.

Le paludisme à P. falciparum est l’une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde. Ce parasite est responsable de plusieurs manifestations cliniques allant du portage asymptomatique et infections non compliquées aigüe au paludisme grave et compliqué, tel que le neuropaludisme. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression différentielle des gènes contribue à la variation phénotypique de parasites, entraînant des interactions spécifiques avec l’hôte, qui à son tour déterminent le type de manifestations cliniques du paludisme. L’objectif principal de cette étude était d’identifier les facteurs génétiques de P. falciparum impliqués dans la pathogenèse du neuropaludisme. Ceci a été réalisé par l’analyse complète du transcriptome d’isolats provenant d’enfants camerounais porteurs asymptomatiques (PA) ou atteints d’accès simple (AS) ou de neuropaludisme (NP). Le transcriptome du clone non sélectionnée (3D7) et la lignée sélectionnée (3D7-Lib) a été également analysé. Les résultats ont montré la surexpression de plusieurs gènes chez des isolats provenant d’enfants atteints de neuropaludisme et chez la lignée 3D7-Lib, par rapport à ceux provenant d’enfants asymptomatiques et 3D7, respectivement. L’analyse de l’ontologie de gène indique que les gènes potentiellement impliqués dans la pathogenèse, la cytoadhérence et l’agrégation des érythrocytes sont surreprésentés parmi les gènes surexprimés chez les isolats de CM et 3D7-Lib. Les résultats les plus marquants étaient la surexpression des gènes var (groups A et B) portant les domaines cassettes DC4, DC5, DC8 et DC13 et les gènes avoisinants rif chez les isolats de NP et la lignée 3D7-Lib, par rapport aux isolats de PA et au clone non sélectionné 3D7, respectivement. Le rôle joué par ces gènes dans la virulence parasitaire est lié à la cytoadhérence, c’est-à-dire la capacité de leurs protéines exprimées à interagir entre les érythrocytes parasités et les récepteurs endothéliaux post capillaires. Parmi ces récepteurs, le CD36 et inter cellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) ont été les plus couramment utilisés par les isolats. L’étude sur l’implication de ces deux récepteurs, ainsi que celle des ligands PfEMP-1, dans la pathogenèse du neuropaludisme devrait être approfondie poursuivie. Nous avons analysé le phénotype de cytoadhérence et les profils de transcription des variantes de Pfemp-1 des isolats frais provenant des enfants béninois atteints de NP ou AS à l’aide du test d’adhérence statique aux récepteurs CD36, ICAM-1 et CSPG et au moyen de RT-PCR quantitative pour les groupes A, B, var2, var3, DC8 et DC13. Nos résultats montrent que le niveau de cytoadhérence des parasites associés au neuropaludisme au CD36 est significativement plus important que celui des parasites associés à l’accès simple. En outre, nous n’avons pas trouvé de différence significative entre la cytoadhérence des isolats de deux groupes cliniques à ICAM-1 et au CSPG. En outre, les niveaux d’expression des groupes var A, B, var2, var3 et du DC8 et DC13 sont plus élevés chez les isolats associés au neuropaludisme que chez les isolats associés à l’accès simple. Nos résultats montrent également que, chez les parasites provenant de NP le haut niveau de cytoadhérence des parasites au CD36 est corrélé au niveau de l’expression de groupe B de gènes var. En revanche, les profils d’expression des groupes spécifiques du gène var et le phénotype de cytoadhérence aux récepteurs ICAM-1 et CSPG n’étaient pas corrélés. Nos résultats suggèrent un rôle important du récepteur CD36 et des protéines codées par les variantes de PfEMP-1 codées par le groupe B dans la pathogenèse du neuropaludisme. / Plasmodium falciparum infection is a major cause of mortality and morbidity worldwide. This parasite is involved in several clinical manifestations, ranging from asymptomatic carriage and acute uncomplicated to severe and complicated malaria, including cerebral malaria. We hypothesized that differential gene expression contributes to phenotypic variation of parasites leading to specific interaction with the host which induces several clinical categories of malaria. The principal aim of this study was to identify parasite genetic factors implicated in the pathogenesis of cerebral malaria. We investigated the whole transcriptome of parasites isolated from Cameroonian children with asymptomatic (AM), uncomplicated (UM) and cerebral malaria (CM). We also investigated the transcriptome of 3D7 clone and the selected 3D7-Lib line. Our results revealed the up-regulation of several genes in CM isolates and 3D7-Lib line compared to AM isolates and 3D7 clone respectively. Gene ontology analysis indicates an over-representation of genes implicated in pathogenesis, cytoadherence, and erythrocyte aggregation among up-regulated genes in CM and 3D7-Lib. The most remarkable outcomes were the up-regulation of UPS A and B var genes containing architectural Domains Cassettes DC4, DC5, DC8, and DC13 and their neighboring rif genes in isolates from CM and 3D7-Lib line, compared with isolates from AM and the unselected 3D7 line, respectively. The involvement of these genes in parasite virulence rises from the ability of their encoded proteins to mediate cytoadherence of infected erythrocytes to post-capillary endothelial receptors. Of these receptors, CD36 and Inter Cellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) were found as the most commonly used by the isolates. The implication of these two receptors, as well as that of PfEMP-1 ligands in the pathogenesis of CM needs to be more elucidated. We examined the adhesive phenotype and the transcription patterns of Pfemp-1 variants of fresh isolates from Beninese children with CM or UM malaria by static binding assay to CD36, ICAM-1 and CSPG and RT-qPCR for groups A, B, var2, var3, DC8, and DC13. Our findings showed that isolates from CM patients bind more to CD36 than those from UM cases. No differences were observed in binding levels to ICAM-1 or CSPG between these two groups. Furthermore, CM isolates transcribed groups A, B, var2, var3, DC8 and DC13 of var genes at higher levels than UM isolates. Interestingly, the high transcription levels of group B in CM parasites correlated with their higher level of binding to CD36. In contrary, the expression profiles of a specific var group and the binding phenotype of isolates to ICAM-1 and to CSPG were not correlated. Our findings support the implication of CD36 along with PfEMP-1 variants encoded by group B in cerebral malaria pathogenesis.

Le paludisme est une infection parasitaire de répartition mondiale notamment en zones intertropicales où l’infection par Plasmodium falciparum est responsable de centaines de milliers de morts par an principalement chez les enfants de moins de cinq ans. Le paludisme constitue également un problème en France par l’importation de cas de paludisme chez le voyageur de retour de zone d’endémie. L’infection à Plasmodium falciparum dans cette population, considérée comme à risque de développer les formes graves de la maladie, peut se présenter sous différentes formes cliniques plus ou moins associées au risque de mortalité. Même si certains facteurs de risque de gravité tels que l’âge et l’immunité ont été identifiés, cette interaction complexe hôte-parasite n’a été largement étudiée que chez l’enfant en zone d’endémie et peu de données sont disponibles pour le paludisme d’importation. L’objectif de ces travaux de thèse repose sur l’analyse des facteurs d’hôte et des facteurs parasitaires intervenant dans le paludisme d’importation. A travers le réseau de surveillance du centre national de référence du paludisme en France métropolitaine, l’ensemble des données démographiques, épidémiologiques, cliniques et biologiques des cas de paludisme d’importation, notifiés entre 2011 et 2015, ont été collectées ainsi que les échantillons ayant servis au diagnostic. Après expertise diagnostique, le plasma obtenu après centrifugation a été utilisé pour les dosages des antipaludéens, pour la quantification d’HRP2 ainsi que pour la sérologie anti-palustre. L’ARN extrait par le TRIZOL® à partir du culot globulaire a été utilisé pour l’étude de l’expression des gènes var et des domaines cassettes par qRT-PCR. Le culot de globules rouges parasités a été mis en culture pour la maturation des formes parasitaires en vue de l’étude du phénotype de cytoadhérence sur les récepteurs solubles CD36, ICAM-1, EPCR et du phénomène de rosetting . L’ensemble de ces études a été réalisé sur une population de patients dans le cadre du paludisme d’importation groupée en migrants de première génération, migrants de deuxième génération et voyageurs/expatriés et dont la présentation clinique du paludisme d’importation a été classée en paludisme « très grave », paludisme « grave » et paludisme « simple ». L’ensemble des données épidémiologiques, cliniques et biologiques recueillies au cours de l’étude a permis d’identifier l’âge élevé, l’origine ethnique, la profondeur de la thrombopénie et l’absence d’antécédents de paludisme comme des facteurs de risque associés à la survenue d’un accès palustre « très grave », entité clinique caractérisée pour une biomasse parasitaire séquestrée élevée. L’effet de la pré-exposition au parasite, reflété par le statut sérologique des patients, semble être à l’origine de la présentation clinique de la maladie en limitant notamment la biomasse parasitaire séquestrée au cours de l’accès palustre. L’étude de l’expression des gènes var et des domaines cassettes réalisée dans cette population, en fonction de la présentation clinique, de l’origine ethnique et du statut sérologique des patients, a révélé une surexpression du groupe de gènes var A et B et des motifs protéiques composant les domaines cassettes DC4, DC8 et DC13 dans le paludisme « grave » et « très grave » d’importation au sein de cette population hétérogène de patients. L’étude du phénotype de cytoadhérence et du rosetting, réalisée dans un autre groupe de patients rencontré dans le cadre du paludisme d’importation, a identifié le rosetting comme le phénotype d’adhérence à l’origine de l’accès palustre « très grave ». Le profil d’expression des gènes var et domaines cassettes correspondants à cette population a confirmé les observations antérieures et corrèle le phénotype de rosetting à l’expression des motifs protéiques DBLß3 et DBLa2 de DC4 et DC8 (...) / Malaria is a worldwide parasitic infection especially in tropical area where Plasmodium falciparum infection is responsible for hundreds of thousands annually mainly among children under five years old. Malaria is also a problem in France by the importation of malaria cases in travelers coming from endemic area. The Plasmodium falciparum infection in this population, considered at risk of developping severe malaria, can present different clinical forms more or less associated with mortality.While some risk factors for severity like age and immunity have been identified, this complex host-parasite interactions have been widely studied in children in endemic areas and few data are available for imported malaria. The aim of the thesis work is based on analysis of host factors and parasite factors in imported malaria.Through the monitoring network of the French National reference center of malaria, all the demographic, epidemiological, clinical and laboratory of imported malaria cases, notified between 2011 and 2015, were collected and also samples of the parasitological diagnosis. After diagnostic expertise, the plasma obtained after centrifugation was used for determinations of antimalarial drugs, for quantification of plasmatic HRP2 and for serological tests. RNA extracted by the Trizol® from red cells pellets was used to study the expression of var genes and domain cassettes by qRT-PCR. The pellet of parasitized red blood cells were cultured for maturation of parasitic forms for the study of phenotype cytoadherence on soluble receptor CD36, ICAM-1 and EPCR and for the study of the rosetting phenomenon. All of these studies was conducted in an imported malaria context,in a population of patients composed by first-generation migrants, second-generation migrants and travelers / expatriates and whose clinical presentation of imported malaria was classified into very severe (VSM), mild severe (MSM) and uncomplicated malaria (UM).All the epidemiological, clinical and biological data collected during the study identified the high age, ethnicity, depth of thrombocytopenia and no history of malaria as factors risk associated with the occurrence of very severe malaria, clinical entity characterized by high sequestered parasite biomass. The effect of pre-exposure to the parasite, reflected by the serological status of patients, seems to be the cause of the clinical presentation of the disease in particular by limiting parasite biomass sequestered during malaria. The study of the expression of var genes and domain cassettes performed in this population, according to clinical presentation, ethnicity and the serological status of patients, revealed an overexpression of the group of var genes A and B and protein patterns of the domain cassette DC4, DC8 and DC13 in mild severe and very severe malaria within this heterogeneous patient population. The study of cytoadherence phenotype and rosetting, made in another group of patients in imported malaria context, identified the rosetting as adhesion phenotype causing very severe malaria. The expression profile of var genes and domain cassettes corresponding to this population confirmed earlier observations and correlates rosetting phenotype to the expression of DBLß3 and DBLa2 of DC4 and DC8 (...)

Erythrocytes infected by mature forms of the Plasmodium falciparum parasite adhere to other components of the vascular space, a behavior considered critical to the pathogenesis of severe malaria. Adhesion is mediated by the P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1), a highly variant antigen expressed by the parasite and subject to switching during the course of an infection. The host ligands of PfEMP1 include CD36, ICAM-1 and the ABO antigens. By employing a series of population- and family-based association studies from multiple African populations, we examined whether variation in the genes underlying these molecules affects susceptibility to severe malaria. Our results suggest that a common frameshift mutation in the ABO glycosyltransferase, responsible for blood group O, is associated with protection from severe malarial phenotypes (P=2x10⁻⁷), particularly severe malarial anaemia. However, we found no significant disease associations with variation in either the ICAM1 or CD36 genes. We focused on two particular functional polymorphisms, the missense ICAM-1Kilifi and the CD36 nonsense mutation T1264G. We genotyped both markers in around 10,000 individuals, but neither demonstrated an association with severe malarial phenotypes. Malaria has been a profound selection pressure shaping human genetic diversity. The last decade has seen the development of several haplotype-based methods to detect signatures of recent positive evolutionary selection. These techniques are potentially invaluable tools in our hunt for genetic variants that protect from life threatening malaria. We used simulations and empirical data from the International HapMap Project to demonstrate the validity of searching for long regions of haplotype homozygosity, as an approach to finding alleles undergoing selective sweeps. We analysed genetic data from a range of populations, particularly those utilized by HapMap, to investigate whether our candidate genes were associated with signals of recent positive selection. We characterized the distribution of a selection event associated with the CD36 1264G allele, focused in Central-West Africa, and demonstrated a novel signal of low population differentiation at the ABO gene, suggestive of longstanding balancing selection. Our work confirms that variation in the host ligands of PfEMP1 modulates severe malaria susceptibility, and highlights the value of using signals of selection, along with functional experiments and genetic association studies, to dissect the biology of severe malaria.

Una de les forces selectives més fortes que han afectat a les poblacions humanes en la història més recent és el paràsit de la malària: Plasmodium falciparum, que és la causa de varis exemples d'adaptació induïda per patògens en els éssers humans. Una forma especial de malària és l'associada a l'embaràs, que es caracteritza per l'acumulació d'eritròcits infectats en la placenta, i que pot arribar a causar fins a 200.000 morts maternoinfantils cada any. L'objectiu d'aquest treball és descriure com aquesta forma peculiar de malària ha afectat la variació genètica humana. Amb aquesta finalitat, hem utilitzat mètodes tant de la genètica evolutiva com de l'epidemiologia molecular, resultant en la primera investigació a gran escala de la base genètica de la malària placentària. Els resultats ofereixen una nova visió sobre els gens que modulen el risc d'infecció, ,així com de la selecció natural actuant sobre les vies cel·lulars implicades en la patogènesi de la malaltia. Finalment, també aportem noves dades sobre l'estructura genètica de les poblacions sub-saharianes analitzades. / One of the strongest selective forces affecting human populations in recent history is the malaria parasite Plasmodium falciparum, which is the cause of a variety of well-established examples of pathogen-induced adaptation in humans. A special form of malaria is pregnancy-associated malaria, which is characterised by the accumulation of infected erythrocytes in the placenta, and causes up to 200,000 maternal and infant deaths every year. The aim of this work is to characterise how this particular form of malaria has shaped human genetic variation. To that end we use methods of both evolutionary genetics and molecular epidemiology, reporting the first large-scale investigation of the genetic basis of placental infection. Our results provide new insights into genes modulating the risk of infection, as well as natural selection acting on cellular pathways involved in the pathogenesis of the disease. Finally, we also provide new data on the genetic structure of affected populations in Sub-Saharan Africa.