Les glutathion transférases (GSTs) constituent une superfamille ubiquitaire d’enzymes multifonctionnelles impliquées dans les processus de détoxication cellulaire en métabolisant des substrats exogènes appelés xénobiotiques et dans le métabolisme secondaire. Pour cela, ces enzymes peuvent catalyser la conjugaison d’une molécule de glutathion (GSH) sur les composés ciblés ou simplement les lier au travers d’une fonction ligandine. Alors que la fonction de conjugaison est catalysée par les GSTs possédant une sérine ou une tyrosine comme résidu catalytique, certaines d’entre elles possèdent à la place une cystéine. Cette substitution change radicalement leurs propriétés puisque les GSTs à cystéine (Cys-GSTs) catalysent plutôt des réactions de déglutathionylation. Les Cys-GSTs sont retrouvées chez la plupart des organismes et sont réparties en plusieurs classes. Chez les plantes, on trouve principalement 4 classes : déshydroascorbate réductases (DHARs), GSTs Lambda (GSTLs), glutathionyl hydroquinone réductases (GHRs) et mPGES2 (microsomal prostaglandine E-synthase type 2). Alors que le rôle des DHARs semble clairement associé à la réduction du déshydroascorbate en ascorbate, la fonction physiologique des autres Cys-GSTs reste majoritairement inconnue. En combinant des approches moléculaires, cellulaires, biochimiques et structurales, l’analyse fonctionnelle des deux GHRs, des trois GSTLs et des trois DHARs chez l’arbre modèle Populus trichocarpa a été entreprise. De façon intéressante, les gènes GSTL et GHR sont majoritairement exprimés dans les fleurs, les fruits et les pétioles par rapport aux feuilles et aux racines. A l’inverse, les gènes DHAR sont principalement exprimés dans les feuilles. De plus, l’expression transitoire de protéines fusionnées à la GFP dans le tabac a montré que les GSTLs et les DHARs sont localisées dans les plastes, le cytoplasme et le noyau alors que les GHRs sont toutes plastidiales. Les études biochimiques et structurales effectuées à l’aide des protéines recombinantes et de substrats modèles ont montré que la plupart des Cys-GSTs possèdent des activités et des structures assez semblables. Cependant, bien que les GSTLs et les DHARs adoptent un repliement GST canonique classique proche de celui des GSTs Oméga fongiques et humaines, elles sont monomériques alors que les GSTs Oméga sont dimériques. Les GHRs sont particulières tant au niveau de leur interface de dimérisation unique qu’au niveau de leurs propriétés spécifiques de réduction de quinones glutathionylées. En résumé, la nature des substrats fixés par les Cys-GSTs (composés cycliques aromatiques) ainsi que les territoires d’expression de ces gènes et protéines suggèrent que ces protéines sont globalement impliquées dans la protection des plantes face aux contraintes environnementales via la modification, le stockage et/ou le transport de métabolites secondaires et autres composés antioxydants. Toutefois, l’objectif suivant sera de déterminer la nature exacte des substrats/ligands associés à chaque enzyme / Glutathione transferases (GSTs) constitute a ubiquitous superfamily of multifunctional enzymes involved in cellular detoxification processes by metabolizing exogenous substrates called xenobiotics and in secondary metabolism. For this purpose, these enzymes catalyze the conjugation of a glutathione molecule (GSH) onto target compounds or simply bind them through a ligandin function. While conjugation reactions are catalyzed by GSTs having a serine or a tyrosine as catalytic residues, other GSTs possess a cysteine. This substitution radically changes their properties since GSTs having a cysteine (Cys-GSTs) rather catalyze deglutathionylation reactions. Cys-GSTs are found in most organisms and are divided into several classes. In plants, there are mainly four classes: dehydroascorbate reductases (DHARs), Lambda GSTs (GSTLs), glutathionyl hydroquinone reductases (GHRs), and microsomal prostaglandin E-synthase type 2 (mPGES). While the role of DHARs seems clearly associated to the reduction of dehydroascorbate into ascorbate, the physiological function of other Cys-GSTs remains largely unknown. By combining molecular, cellular, biochemical and structural approaches, the functional analysis of the two GHRs, the three GSTLs and the three DHARs in the model tree Populus trichocarpa was undertaken. Interestingly, GSTL and GHR genes are predominantly expressed in flowers, fruits and petioles compared to leaves and roots. Conversely, the DHAR genes are mainly expressed in leaves. Furthermore, transient expression of proteins fused to GFP in tobacco showed that GSTLs and DHARs are localized in plastids, cytoplasm and nucleus while GHRs are all localized in plastids. Biochemical and structural studies using recombinant proteins and model substrates showed that most Cys-GSTs have similar activities and structures. However, although GSTLs and DHARs adopt a canonical GST folding similar to that of fungal and human Omega GSTs, they are monomeric whereas Omega GSTs are dimeric. GHRs are particular owing to their unique dimerization interface and to their specific capacity to reduce glutathionylated quinones. In summary, the nature of the substrates bound by Cys-GSTs (heterocyclic aromatic compounds) as well as the expression territories of these genes and proteins, suggest that they are generally involved in the protection of plants towards environmental constraints through the modification, storage and/or transport of secondary metabolites and other antioxidants. However, the next goal will be to determine the exact nature of the substrates/ligands associated with each enzyme

La préparation de formulations à libération contrôlée est le domaine des sciences pharmaceutiques qui vise à modifier l’environnement immédiat des principes actifs pour en améliorer l’efficacité et l’innocuité. Cet objectif peut être atteint en modifiant la cinétique de circulation dans le sang ou la distribution dans l’organisme. Le but de ce projet de recherche était d’étudier le profil pharmacocinétique (PK) de différentes formulations liposomales. L’analyse PK, généralement employée pour représenter et prédire les concentrations plasmatiques des médicaments et de leurs métabolites, a été utilisée ici pour caractériser in vivo des formulations sensibles au pH servant à modifier la distribution intracellulaire de principes actifs ainsi que des liposomes destinés au traitement des intoxications médicamenteuses. Dans un premier temps, la PK d’un copolymère sensible au pH, à base de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique (MAA) a été étudiée. Ce dernier, le p(NIPAM-co-MAA) est utilisé dans notre laboratoire pour la fabrication de liposomes sensibles au pH. L’étude de PK conduite sur les profils de concentrations sanguines de différents polymères a défini les caractéristiques influençant la circulation des macromolécules dans l’organisme. La taille des molécules, leur point de trouble ainsi que la présence d’un segment hydrophobe à l’extrémité des chaînes se sont avérés déterminants. Le seuil de filtration glomérulaire du polymère a été évalué à 32 000 g/mol. Finalement, l’analyse PK a permis de s’assurer que les complexes formés par la fixation du polymère à la surface des liposomes restaient stables dans le sang, après injection par voie intraveineuse. Ces données ont établi qu’il était possible de synthétiser un polymère pouvant être adéquatement éliminé par filtration rénale et que les liposomes sensibles au pH préparés avec celui-ci demeuraient intacts dans l’organisme. En second lieu, l’analyse PK a été utilisée dans le développement de liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pour le traitement des intoxications médicamenteuses. Une formulation a été développée et optimisée in vitro pour capturer un médicament modèle, le diltiazem (DTZ). La formulation liposomale s’est avérée 40 fois plus performante que les émulsions lipidiques utilisées en clinique. L’analyse PK des liposomes a permis de confirmer la stabilité de la formulation in vivo et d’analyser l’influence des liposomes sur la circulation plasmatique du DTZ et de son principal métabolite, le desacétyldiltiazem (DAD). Il a été démontré que les liposomes étaient capables de capturer et de séquestrer le principe actif dans la circulation sanguine lorsque celui-ci était administré, par la voie intraveineuse. L’injection des liposomes 2 minutes avant l’administration du DTZ augmentait significativement l’aire sous la courbe du DTZ et du DAD tout en diminuant leur clairance plasmatique et leur volume de distribution. L’effet de ces modifications PK sur l’activité pharmacologique du médicament a ensuite été évalué. Les liposomes ont diminué l’effet hypotenseur du principe actif administré en bolus ou en perfusion sur une période d’une heure. Au cours de ces travaux, l’analyse PK a servi à établir la preuve de concept que des liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pouvaient modifier la PK d’un médicament cardiovasculaire et en diminuer l’activité pharmacologique. Ces résultats serviront de base pour le développement de la formulation destinée au traitement des intoxications médicamenteuses. Ce travail souligne la pertinence d’utiliser l’analyse PK dans la mise au point de vecteurs pharmaceutiques destinés à des applications variées. À ce stade de développement, l’aspect prédictif de l’analyse n’a pas été exploité, mais le côté descriptif a permis de comparer adéquatement diverses formulations et de tirer des conclusions pertinentes quant à leur devenir dans l’organisme. / Drug delivery is the field of pharmaceutical sciences which focuses on altering the immediate environment of drug molecules to improve their efficacy and safety. Drug delivery systems can potentiate the effect of active principles or alleviate their side effects by modifying their circulation profiles and/or biodistribution. The objective of this research project was to investigate the role of pharmacokinetic (PK) analysis in the development of novel drug delivery systems. PK analysis is generally applied to describe and predict the blood concentration profiles of low molecular weight drugs and their metabolites. Nevertheless, it is herein used to characterize the circulation of 2 liposomal formulations: pH-sensitive liposomes designed to alter the intracellular distribution of drugs and liposomes with transmembrane pH gradient for drug detoxification. The first series of experiments were designed to study the circulation kinetics of a pH-sensitive polymer prepared with N-isopropylacrylamide (NIPAM) and methacrylic acid (MAA). The copolymer p(NIPAM-co-MAA) is used in our laboratory to prepare serum-stable, PEGylated, pH-sensitive liposomes. The circulation profiles of polymers with different characteristics were characterized. The parameters which impacted the fate of the macromolecules were the length of the polymer chain, its cloud point and the presence of a hydrophobic anchor at one extremity of the molecule. The glomerular filtration cut-off of the polymer was determined to be around 32,000 g/mol. PK analysis allowed to conclude that the complexes prepared by anchoring the polymer on the surface of the liposomes remained stable in the bloodstream. This data established that pH-sensitive vesicular formulations could be produced using a polymer which could be excreted through renal filtration. It also confirmed that the formulation remained intact in the bloodstream. The second part of this work involved the development of liposomes with a transmembrane pH gradient designed to treat cardiovascular drug intoxications. Liposomes were designed and optimized in vitro to capture a model cardiovascular drug, diltiazem (DTZ). In vitro, the liposome uptake capacity was 40-fold higher than the lipid emulsion used in the clinic. PK analysis was used to verify the stability of the formulation in vivo, and to assess the impact of the liposomes on the plasma concentration of DTZ and its principal active metabolite, deacetyl-diltiazem (DAD). It was shown that the vesicles were able to capture and sequester DTZ and DAD. Injection of liposomes 2 min prior to administration of DTZ significantly increased the area under the plasma-concentration vs. time curve of both DTZ and DAD, while lowering their clearance and volume of distribution. The impact of the changes in PK on the pharmacological effect of the drug was also investigated. Liposomes tempered the hypotensive effect of the drug when the latter was administered via an intravenous bolus or a 1-h perfusion. Throughout this work, PK analysis proved to be an efficient tool to study the ability of transmembrane pH gradient liposomes to alter the blood circulation profiles of a cardiovascular drug, and to reduce its pharmacological effect. This proof of concept establishes firm ground for the further development of this colloidal formulation to treat drug intoxications. This work pointed out the relevance of PK analysis for the development of multi-purpose, colloidal drug delivery systems. At this stage, the predictive nature of the analysis was not exploited, but its descriptive properties allowed objective comparison of the circulation profiles of distinct systems and pertinent conclusions concerning their fate in vivo.

La préparation de formulations à libération contrôlée est le domaine des sciences pharmaceutiques qui vise à modifier l’environnement immédiat des principes actifs pour en améliorer l’efficacité et l’innocuité. Cet objectif peut être atteint en modifiant la cinétique de circulation dans le sang ou la distribution dans l’organisme. Le but de ce projet de recherche était d’étudier le profil pharmacocinétique (PK) de différentes formulations liposomales. L’analyse PK, généralement employée pour représenter et prédire les concentrations plasmatiques des médicaments et de leurs métabolites, a été utilisée ici pour caractériser in vivo des formulations sensibles au pH servant à modifier la distribution intracellulaire de principes actifs ainsi que des liposomes destinés au traitement des intoxications médicamenteuses. Dans un premier temps, la PK d’un copolymère sensible au pH, à base de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique (MAA) a été étudiée. Ce dernier, le p(NIPAM-co-MAA) est utilisé dans notre laboratoire pour la fabrication de liposomes sensibles au pH. L’étude de PK conduite sur les profils de concentrations sanguines de différents polymères a défini les caractéristiques influençant la circulation des macromolécules dans l’organisme. La taille des molécules, leur point de trouble ainsi que la présence d’un segment hydrophobe à l’extrémité des chaînes se sont avérés déterminants. Le seuil de filtration glomérulaire du polymère a été évalué à 32 000 g/mol. Finalement, l’analyse PK a permis de s’assurer que les complexes formés par la fixation du polymère à la surface des liposomes restaient stables dans le sang, après injection par voie intraveineuse. Ces données ont établi qu’il était possible de synthétiser un polymère pouvant être adéquatement éliminé par filtration rénale et que les liposomes sensibles au pH préparés avec celui-ci demeuraient intacts dans l’organisme. En second lieu, l’analyse PK a été utilisée dans le développement de liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pour le traitement des intoxications médicamenteuses. Une formulation a été développée et optimisée in vitro pour capturer un médicament modèle, le diltiazem (DTZ). La formulation liposomale s’est avérée 40 fois plus performante que les émulsions lipidiques utilisées en clinique. L’analyse PK des liposomes a permis de confirmer la stabilité de la formulation in vivo et d’analyser l’influence des liposomes sur la circulation plasmatique du DTZ et de son principal métabolite, le desacétyldiltiazem (DAD). Il a été démontré que les liposomes étaient capables de capturer et de séquestrer le principe actif dans la circulation sanguine lorsque celui-ci était administré, par la voie intraveineuse. L’injection des liposomes 2 minutes avant l’administration du DTZ augmentait significativement l’aire sous la courbe du DTZ et du DAD tout en diminuant leur clairance plasmatique et leur volume de distribution. L’effet de ces modifications PK sur l’activité pharmacologique du médicament a ensuite été évalué. Les liposomes ont diminué l’effet hypotenseur du principe actif administré en bolus ou en perfusion sur une période d’une heure. Au cours de ces travaux, l’analyse PK a servi à établir la preuve de concept que des liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pouvaient modifier la PK d’un médicament cardiovasculaire et en diminuer l’activité pharmacologique. Ces résultats serviront de base pour le développement de la formulation destinée au traitement des intoxications médicamenteuses. Ce travail souligne la pertinence d’utiliser l’analyse PK dans la mise au point de vecteurs pharmaceutiques destinés à des applications variées. À ce stade de développement, l’aspect prédictif de l’analyse n’a pas été exploité, mais le côté descriptif a permis de comparer adéquatement diverses formulations et de tirer des conclusions pertinentes quant à leur devenir dans l’organisme. / Drug delivery is the field of pharmaceutical sciences which focuses on altering the immediate environment of drug molecules to improve their efficacy and safety. Drug delivery systems can potentiate the effect of active principles or alleviate their side effects by modifying their circulation profiles and/or biodistribution. The objective of this research project was to investigate the role of pharmacokinetic (PK) analysis in the development of novel drug delivery systems. PK analysis is generally applied to describe and predict the blood concentration profiles of low molecular weight drugs and their metabolites. Nevertheless, it is herein used to characterize the circulation of 2 liposomal formulations: pH-sensitive liposomes designed to alter the intracellular distribution of drugs and liposomes with transmembrane pH gradient for drug detoxification. The first series of experiments were designed to study the circulation kinetics of a pH-sensitive polymer prepared with N-isopropylacrylamide (NIPAM) and methacrylic acid (MAA). The copolymer p(NIPAM-co-MAA) is used in our laboratory to prepare serum-stable, PEGylated, pH-sensitive liposomes. The circulation profiles of polymers with different characteristics were characterized. The parameters which impacted the fate of the macromolecules were the length of the polymer chain, its cloud point and the presence of a hydrophobic anchor at one extremity of the molecule. The glomerular filtration cut-off of the polymer was determined to be around 32,000 g/mol. PK analysis allowed to conclude that the complexes prepared by anchoring the polymer on the surface of the liposomes remained stable in the bloodstream. This data established that pH-sensitive vesicular formulations could be produced using a polymer which could be excreted through renal filtration. It also confirmed that the formulation remained intact in the bloodstream. The second part of this work involved the development of liposomes with a transmembrane pH gradient designed to treat cardiovascular drug intoxications. Liposomes were designed and optimized in vitro to capture a model cardiovascular drug, diltiazem (DTZ). In vitro, the liposome uptake capacity was 40-fold higher than the lipid emulsion used in the clinic. PK analysis was used to verify the stability of the formulation in vivo, and to assess the impact of the liposomes on the plasma concentration of DTZ and its principal active metabolite, deacetyl-diltiazem (DAD). It was shown that the vesicles were able to capture and sequester DTZ and DAD. Injection of liposomes 2 min prior to administration of DTZ significantly increased the area under the plasma-concentration vs. time curve of both DTZ and DAD, while lowering their clearance and volume of distribution. The impact of the changes in PK on the pharmacological effect of the drug was also investigated. Liposomes tempered the hypotensive effect of the drug when the latter was administered via an intravenous bolus or a 1-h perfusion. Throughout this work, PK analysis proved to be an efficient tool to study the ability of transmembrane pH gradient liposomes to alter the blood circulation profiles of a cardiovascular drug, and to reduce its pharmacological effect. This proof of concept establishes firm ground for the further development of this colloidal formulation to treat drug intoxications. This work pointed out the relevance of PK analysis for the development of multi-purpose, colloidal drug delivery systems. At this stage, the predictive nature of the analysis was not exploited, but its descriptive properties allowed objective comparison of the circulation profiles of distinct systems and pertinent conclusions concerning their fate in vivo.