Les moustiques génèrent une nuisance importante et sont notamment contrôlés grâce à des traitements insecticides. Aujourd'hui, les gîtes où se développent leurs larves sont souvent pollués par des xénobiotiques environnementaux (hydrocarbures, herbicides, pesticides, toxines naturelles…). Jusqu'à présent, l'impact de ces xénobiotiques sur la capacité des larves de moustiques à résister aux insecticides chimiques reste méconnu. Cette thèse vise à étudier la réponse des larves de d'Aedes aegypti aux xénobiotiques environnementaux et leur impact sur leur tolérance et résistance aux insecticides chimiques. Une première étude, sur le court terme, montre que des larves exposées pendant 24h à divers xénobiotiques deviennent plus tolérantes à vis à vis de différents insecticides chimiques (Poupardin et al. 2008). Des études biochimiques et transcriptomiques suggèrent que l'induction de certaines familles d'enzymes (e.g. P450s et GSTs) par ces xénobiotiques peut être liée à l'augmentation de tolérance des larves vis-à-vis de l'insecticide. Dans le but de mieux caractériser le profil transcriptionnel des précédents gènes candidats, des expérimentations complémentaires ont été faites à différents niveaux (Poupardin et al., 2010). Cette étude a montré que de nombreux gènes étaient préférentiellement transcrits dans des tissus fortement impliqués dans la détoxication de composés exogènes, essentiellement des CYP6. Elle révèle aussi que la transcription de ces P450s varie beaucoup au cours des différents stades de développement et qu'ils étaient induits à des faibles de doses de polluants avec un pic d'induction après 48 et 72 heures d'exposition. Ces études mettent en évidence le rôle potentiel des gènes de détoxication dans la réponse à l'exposition à des xénobiotiques et dans l'augmentation de tolérance aux insecticides chimiques. Concernant l'étude sur le long terme de l'impact des polluants sur la résistance des moustiques aux insecticides, la question est de savoir si les polluants trouvés dans l'environnement influencent la sélection de la résistance aux insecticides et si oui, favorisent-ils la sélection de gènes en particulier? Pour répondre à ces questions, trois souches d'Aedes aegypti ont été sélectionnées à la perméthrine. Ces souches sont exposées ou non à différents polluants avant sélection. Après 10 générations de sélection, des bioessais montrent une résistance de ces 3 souches vis-à-vis de la perméthrine. Aucune différence significative de niveau de résistance n'est observée entre les trois souches sélectionnées pour le moment. Pour identifier les gènes différentiellement transcrits dans ces souches, la puce "Agilent Aedes chip" développée par l'école de médecine tropicale de Liverpool (LSTM) et contenant 14200 transcrits a été utilisée. Les microarrays ont révélé que la présence de polluants ou insecticides résiduels pouvait affecter la sélection des mécanismes de résistance aux insecticides chimiques, notamment par la sélection de gènes particuliers codant pour des enzymes de détoxication (Poupardin et al, en préparation). D'une manière globale, cette thèse permettra de mieux comprendre l'impact de l'environnement chimique sur la résistance des moustiques aux insecticides et fournira de nouvelles pistes afin d'optimiser les traitements insecticides utilisés en démoustication. / Mosquitoes have a major impact on public health due to their capacity to transmit human diseases such as viruses (dengue, yellow-fever, west-Nile, chikungunya…) and parasites (malaria, filariasis…). To control them, insecticides have been heavily used since the 1950's leading to the emergence of insecticide resistance. Today, wetlands where mosquito larvae develop are frequently contaminated by environmental xenobiotics (e.g. residual insecticides, agrochemicals, pollutants and plant allelochemicals) and little is known about the impact of these molecules on the capacity of mosquitoes to resist insecticides. The aim of my thesis is to study the response of mosquito larvae to xenobiotic exposures and the impact of these molecules on the tolerance (single generation) and resistance (multiple generations) of mosquitoes to chemical insecticides. A first ‘short term' study revealed that mosquito larvae exposed for few hours to sub-lethal doses of various xenobiotics become more tolerant to several chemical insecticides (Poupardin et al., 2008, Riaz et al., 2009) and that this increased tolerance is linked with an increase of detoxification enzyme activities. Thanks to the “Aedes detox chip” developed in LSTM, we showed that several detoxification genes, especially P450s, were induced by various xenobiotics which could explain the increased tolerance of mosquito larvae to insecticides. In order to better characterize these genes, their transcription profiles were studied at different life stages and in various organs (Poupardin et al., 2010). We demonstrated that several of these P450s are preferentially transcribed in gastric caeca, midgut and malpighian tubules, known to play an important role in xenobiotic metabolism. Moreover, we found that the transcription levels of these genes vary according to life stages. Finally, several genes were induced by environmental doses of xenobiotics with a maximum induction peak at 48-72h after exposure. Overall, these studies evidenced of the potential role of mosquito detoxification genes to respond to xenobiotic exposure and to affect their tolerance to chemical insecticides. The other aim of my thesis was to understand the ‘long term' (across several generations) impact of xenobiotics on the selection of insecticide resistance mechanisms in mosquitoes. In other words, ‘Do pollutants affect the selection of insecticides resistance mechanism by insecticides treatments' and if yes, ‘are particular genes favoured?' To answer these questions, three strains of the mosquito Aedes aegypti were selected with the pyrethroid insecticide permethrin. Before the selection process, larvae were exposed or not to sub-lethal dose of various pollutants. After 11 generations of selection, the three strains showed elevated resistance to permethrin compared to the susceptible strain. To identify the genes differentially transcribed in these resistant strains, we used the new ‘Agilent Aedes chip' representing more than 14,200 transcripts developed by the LSTM. Microarray results showed that the presence pollutants or residual insecticide can affect the selection of insecticide resistance mechanisms by favouring the selection of particular genes such as those encoding for detoxification enzymes (Poupardin et al., in prep). Globally, this research work will provide a better understanding of the impact of environmental factors on insecticide resistances in mosquitoes and will provide new ways to optimize the control of vectors with insecticides.

La résistance des moustiques aux insecticides pyréthrinoïdes (PYRs) menace les programmes de lutte anti-vectorielle à l'échelle mondiale. Chez le moustique Aedes aegypti, vecteur de la dengue et du Chikungunya, les principaux mécanismes causant cette résistance ont été identifiés. La résistance métabolique joue alors un rôle important et consiste en une biodégradation accrue de l'insecticide par des enzymes de détoxication. Néanmoins, les bases moléculaires de ce mécanisme restent méconnues. La plupart des gènes impliqués dans la résistance métabolique aux PYRs ont été identifiés par des approches transcriptomiques, mais les modifications génomiques à l'origine de leur sur-expression dans les populations résistantes ainsi que les modifications structurales des enzymes en lien avec la résistance restent méconnues. Cette thèse vise alors à utiliser les nouvelles approches de séquençage à haut débit (NGS) pour caractériser les mécanismes moléculaires de la résistance aux PYRs chez le moustique Ae. Aegypti. La première partie de la thèse présente une étude pilote RNA-seq menée sur des populations de laboratoire sélectionnées avec des insecticides. Cette étude a pour objectif d'évaluer les avantages des NGS pour l'étude des mécanismes de résistance chez les moustiques. Le rôle des enzymes de détoxication dans la résistance a ainsi été clairement confirmé. Plusieurs gènes codant pour ces enzymes apparaissent sur-exprimés dans les populations résistantes et un important regroupement de P450 montre une forte empreinte de sélection en lien avec la résistance aux PYRs. La seconde partie de la thèse présente une étude sur des populations naturelles échantillonnées sur divers continents. Cette étude combine les technologies d'enrichissement génomique et de DNA-seq afin d'étudier les variations génomiques liées à la résistance au PYR Deltaméthrine. La comparaison de la couverture de séquençage entre populations résistantes et sensibles a permis d'identifier des variations de nombre de copies (CNVs) de certains gènes de détoxication associées à la résistance à la Deltaméthrine. Des mutations non-synonymes fortement liées au phénotype de résistance ont également été mises en évidence. La comparaison de ces marqueurs de la résistance entre les différentes populations a révélé que les gènes/mutations associés à la résistance à la Deltaméthrine sont peu conservés entre continents, probablement à cause des différences de fond génétique des populations, de leur histoire démographique et des pressions de sélections. La troisième partie de la thèse décrit une étude par RNA-seq portant sur les mêmes populations naturelles, visant à croiser des données de transcriptomique (expression des gènes et polymorphisme des transcrits) avec les données génomiques générées par l'étude précédente. Plusieurs enzymes de détoxications ont été retrouvées sur-exprimées chez les populations résistantes en lien avec les CNVs précédemment identifiées. Des centaines de variations de polymorphisme ont été identifiées par DNA-seq dans les zones cis-promotrices des différents gènes étudiés. Parmi ces variations, plusieurs apparaissent associées à la sur-régulation d'enzymes de détoxication. Enfin, la comparaison des données de polymorphismes obtenues par DNA-seq et RNA-seq a permis d'étudier les phénomènes d'expression d'allèles spécifiques en lien avec la résistance. Cette étude confirme l'intérêt de croiser des données de transcriptomique et de génomique pour caractériser les bases moléculaires de la résistance aux insecticides. D'un point de vue général, cette thèse permet de mieux appréhender les mécanismes de résistance du moustique Ae. aegypti aux PYRs mais aussi d'identifier de nouveaux marqueurs de la résistance potentiellement utilisables pour développer de nouveaux outils moléculaires diagnostiques de la résistance sur le terrain. Ce travail met également en avant les apports des NGS pour l'étude fine des bases moléculaires de l'adaptation d'organismes modèles. / Mosquito control programs worldwide are increasingly threatened by resistance to pyrethroid insecticides (PYRs). In the dengue and chikungunya vector Aedes aegypti, the key resistance mechanisms include modifications in the protein targeted by insecticides (target-site mutations) and metabolic resistance, consisting in an increased insecticide biodegradation by so called detoxification enzymes. However, as opposed to target-site mutations, the molecular basis of metabolic resistance remains poorly understood. Most metabolic resistance genes have been detected by transcriptomic approaches based on their over-expressed in resistant populations, but genomic changes leading to these expression changes as well as structural changes in enzymes potentially involved in resistance remain unknown. In this context, this thesis aims at using next-generation sequencing approaches for characterizing PYR resistance mechanisms in the mosquito Ae. aegypti.The first chapter of this thesis describes a pilot study on laboratory insecticide-selected populations of Ae. aegypti. This study aims at investigating the benefits of next-generation sequencing for studying resistance mechanisms in mosquitoes. This study confirmed that detoxification enzymes play a key role in resistance, with several of them being over-expressed in resistant populations and a large cluster of cytochrome P450 genes showing a selection imprint associated with resistance to PYRs.The second chapter of this thesis describes a study conducted on natural mosquito populations from various continents. Combining genomic target enrichment (targeting about 800 genes potentially involved in resistance) and DNA-seq allowed unravelling genomic changes associated with resistance to the PYR deltamethrin. Comparing normalized sequencing coverage between resistant and susceptible populations identified significant copy number variations (CNVs) in several detoxification genes strongly associated to deltamethrin resistance. Non-synonymous mutations affecting detoxification enzymes associated to the resistance phenotype were also detected. Comparing resistance markers between populations from various continents revealed that genes/mutations associated with deltamethrin resistance are poorly conserved across continents, probably due to differences in the genetic background of populations but also differences in terms of demographic history and selection pressures.The third chapter describes an RNA-seq study performed on the same natural mosquito populations in order to cross-link transcriptomic data (gene expression and transcript polymorphism) with genomic data obtained from the previous study. Multiple detoxification enzymes were found over-transcribed in resistant populations linked with previously identified CNVs. Hundreds polymorphism variations were identified by targeted DNA-seq in cis-promoter regions of detoxification genes. Among them, several were associated with the upper-regulation of detoxification enzymes in resistant populations. Finally, cross-comparing polymorphism data obtain from DNA-seq and RNA-seq allowed investigating allele specific expression (ASE) events related to PYR resistance. Overall, this study confirmed the benefits of combining transcriptomic and genomic NGS approaches for studying the molecular basis of insecticide resistance.As a whole, this thesis not only contributed to better understand PYR resistance mechanisms in the dengue vector Ae. aegypti but also identified novel genomic markers of resistance opening the way for developing new molecular diagnostic to early detect and monitor resistance mechanisms in the field. This work also highlights the benefits of using NGS technologies for unravelling the molecular bases of adaptation in model organisms.

La fusariose des épis est l’une des principales maladies des céréales, majoritairement causée par le champignon pathogène et toxinogène, Fusarium graminearum (Fg). Lors son développement in planta, le champignon produit des mycotoxines dommageables pour la santé humaine et animale, dont le déoxynivalénol (DON). De nombreux loci à effet quantitatif sur la résistance à Fg ont été identifiés chez le blé tendre. Certains d’entre eux ont été corrélés à la capacité à détoxifier le DON, en particulier par glucosylation sous l’action d’UDP-glucosyltransférases (UGT). Une UGT d’orge impliquée dans la conjugaison du DON a été identifiée en système hétérologue. Brachypodium distachyon (Bd) a récemment émergé comme modèle d’étude pour les céréales. Ce travail à l’aide d’approches transcriptomique et métabolomique a mis en évidence que lors de l’interaction avec Fg, Bd met en place des réponses macroscopiques, moléculaires et métaboliques similaires à celles connues chez le blé et l’orge. La recherche d’UGTs candidates capables de conjuguer le DON en DON-3-O-glucoside (D3G) chez Bd a permis l’identification d’un candidat. L’analyse fonctionnelle du gène correspondant a été conduite par des approches de mutagenèse et de surexpression. Ceci a montré une sensibilité accrue des lignées mutantes à la toxine et à l’agent pathogène. A l’inverse les lignées surexpresseurs ont montré une tolérance et résistance quantitative à la toxine et l’agent pathogène. Ces résultats ont été corrélés par la détection in planta de DON et D3G, dans des proportions variables selon les lignées. Ces résultats démontrent le rôle majeur que joue la glucosylation du DON dans l’établissement de la résistance observée chez Bd en réponse à Fg. / Fusarium head blight is a major cereal disease, mostly caused by the pathogenic and toxin-producing fungus, Fusarium graminearum (Fg). During its development in planta, the fungus produces mycotoxins harmful to human and animal health, including deoxynivalenol (DON). Many quantitative trait loci exhibiting an effect on resistance to Fg have been identified in wheat. Some of them were correlated with the ability to detoxify DON, particularly by glucosylation by UDP-glycosyltransferases (UGT). A barley UGT involved in the conjugation of DON was identified in a heterologous system. Brachypodium distachyon (Bd) has recently emerged as a model species for cereals. Using transcriptomic and metabolomic approaches, we show that when interacting with Fg, Bd implements macroscopic, molecular and metabolic responses similar to those known in wheat and barley. The search for UGT candidates able to conjugate DON into DON-3-O-glucoside (D3G) in Bd resulted in the identification of the Bradi5g03300 gene. Functional analyses of this gene showed increased sensitivity of the mutant lines to the toxin and to the pathogen. Conversely the overexpressor lines showed a tolerance to the toxin and quantitative resistance to Fg. These results were correlated with the detection of differential amounts of DON and D3G in the different lines. These results demonstrate the important role of DON glucosylation in the resistance establishment of Bd observed in response to Fg.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d'être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l'hypothèse qu'ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l'accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu'ABCG2 transporte de l'hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d'ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d'ABCG2, ECL3, composé d'environ 70 acides aminés. L'affinité d'ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l'albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l'hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L'ensemble de ce travail a donc permis d'une part de mieux comprendre le rôle d'ABCG2 dans la régulation de l'homéostasie des porphyrines, notamment l'hème, et d'autre part, de façon originale, d'identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s'effectue.

L'ovaire est au cœur de la physiologie de la reproduction féminine. Il est à la fois à l'origine des ovocytes nécessaires à la fécondation et acteur des régulations endocrines du système reproducteur. Les ovocytes de l'ovaire fœtal sont groupés en amas bordés de cellules somatiques et d'une membrane basale, formant les cordons ovariens. Ces cordons ovariens se fragmentent pour former les follicules ovariens: un ovocyte bordé de cellules somatiques et d'une membrane basale. Cette fragmentation se déroule sur une courte période (/in utero/ chez la femme et juste après la naissance chez les rongeurs) et fait intervenir une vague de mort cellulaire programmée touchant les ovocytes pendant leur méiose et un remodelage de la membrane basale. La formation des follicules est une période cruciale du développement ovarien puisque le stock de follicules formés à l'issue de ce processus est non renouvelable. Son altération peut donc être à l'origine de troubles de la fonction de reproduction chez le futur adulte. Il existe une fragile homéostasie œstrogénique en place au moment de la formation folliculaire: chez la femme, l'ovaire se développe /in utero/, sous l'influence des œstrogènes circulants maternels et la production ovarienne fœtale. Chez les rongeurs, les follicules se forment lors de la levée de l'imprégnation hormonale maternelle au moment de la naissance. Nous avons souhaité comprendre comment le 17b-œstradiol (E2), œstrogène endogène, pouvait contribuer à la mise en place des follicules. Pour cela, des rattes Sprague-Dawley ont été traitées pendant la période de formation des follicules avec de l'E2 à différentes doses entre 0.01 et 10 µg/jour. Nos travaux démontrent que le traitement de rattes par des œstrogènes entre leur naissance et 3 jours induit une réduction dose-dépendante de leur nombre d'ovocytes. Bien que le traitement entrave le développement normal du système de détoxication hépatique et ovarien, l'animal est capable d'accroître ses capacités d'élimination des œstrogènes. Ces capacités sont toutefois insuffisantes pour bloquer les effets du traitement. Quelle que soit la dose d'E2 utilisée (0.1 ou 10 µg/jour), la puberté est plus précoce chez les femelles exposées mais toutes sont fertiles, au moins transitoirement. Cependant le traitement induit une dégradation rapide des capacités reproductives. L'E2 modifie la dynamique folliculaire chez l'adulte, longtemps après l'arrêt du traitement. Si une forte dose d'E2 réduit la survie des ovocytes lors de la formation des follicules et conduit à une infertilité secondaire due à un dysfonctionnement général du tractus reproducteur, une dose faible n'affecte pas la survie des ovocytes à court terme mais conduit à une sénescence reproductive précoce vraisemblablement d'origine ovarienne. L'origine de ces troubles pourrait résider dans les effets précoces de l'exposition à E2 : cette molécule altère le transcriptome ovarien et induit de nombreuses lésions de l'ADN des cellules ovariennes.

L'aflatoxine B1 (AFB1) et l'ochratoxine A (OTA) sont des mycotoxines pouvant contaminer une large variété de denrées alimentaires. L'ingestion d'aliments contaminés par des animaux d'élevage peut entraîner l'altération de leur santé et de leurs performances zootechniques ainsi qu'un problème de sécurité alimentaire lié à la présence de résidus de mycotoxines dans les produits animaux, notamment le lait. Des traitements de détoxication basés sur l'addition d'adsorbants organiques ont été développés pour fixer les mycotoxines dans le tube digestif et ainsi réduire l'exposition des animaux. L'objectif de ce travail de thèse était d'évaluer l'efficacité d'un adsorbant à base d'extraits de parois modifiées de levures (Mycosorb®) sur deux modèles animaux, le rat et la brebis. L'efficacité a été déterminée en réalisant un suivi des mycotoxines et/ou de leurs métabolites dans 3 matrices : l'excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine. Sur les 2 modèles animaux, nous avons ainsi étudié les effets de l'apport en Mycosorb sur l'excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine des 2 mycotoxines (AFB1 et OTA). Chez le rat, le suivi de la radioactivité a montré que les fèces d'animaux supplémentés en parois de levures contiennent significativement plus de mycotoxines. Cette augmentation de la radioactivité dans les fèces s'est accompagnée d'une diminution marquée de la radioactivité dans le sang et dans les urines. Chez la brebis laitière, en plus de ces paramètres, nous avons évalué l'effet de l'adsorbant sur les paramètres de production de l'animal et l'excrétion des mycotoxines dans le lait. L'addition de la paroi de levure a entraîné une augmentation significative de l'excrétion de l'AFB1 et de son métabolite, l'aflatoxine M1(AFM1) dans les fèces du ruminant. Cette augmentation de l'excrétion fécale s'accompagne de la réduction du taux d'AFM1 excrété dans l'urine mais pas dans le lait. Les effets observés chez les deux modèles expérimentaux semblent être liés à la séquestration des mycotoxines dans le tractus digestif des animaux et permettent de conclure à la capacité de l'adsorbant organique à réduire la biodisponibilité des mycotoxines testées. L'ajout de la paroi de levure pourrait, par conséquent, réduire les risques sanitaires chez les animaux d'élevage exposés à une alimentation contaminée par les mycotoxines. Cependant, nous n'avons pas observé d'effet sur la santé et les paramètres zootechniques des animaux dans les conditions expérimentales utilisées.

L'ovaire est au cœur de la physiologie de la reproduction féminine. Il est à la fois à l'origine des ovocytes nécessaires à la fécondation et acteur des régulations endocrines du système reproducteur. Les ovocytes de l'ovaire fœtal sont groupés en amas bordés de cellules somatiques et d'une membrane basale, formant les cordons ovariens. Ces cordons ovariens se fragmentent pour former les follicules ovariens: un ovocyte bordé de cellules somatiques et d'une membrane basale. Cette fragmentation se déroule sur une courte période (/in utero/ chez la femme et juste après la naissance chez les rongeurs) et fait intervenir une vague de mort cellulaire programmée touchant les ovocytes pendant leur méiose et un remodelage de la membrane basale. La formation des follicules est une période cruciale du développement ovarien puisque le stock de follicules formés à l'issue de ce processus est non renouvelable. Son altération peut donc être à l'origine de troubles de la fonction de reproduction chez le futur adulte. Il existe une fragile homéostasie œstrogénique en place au moment de la formation folliculaire: chez la femme, l'ovaire se développe /in utero/, sous l'influence des œstrogènes circulants maternels et la production ovarienne fœtale. Chez les rongeurs, les follicules se forment lors de la levée de l'imprégnation hormonale maternelle au moment de la naissance. Nous avons souhaité comprendre comment le 17b-œstradiol (E2), œstrogène endogène, pouvait contribuer à la mise en place des follicules. Pour cela, des rattes Sprague-Dawley ont été traitées pendant la période de formation des follicules avec de l'E2 à différentes doses entre 0.01 et 10 µg/jour. Nos travaux démontrent que le traitement de rattes par des œstrogènes entre leur naissance et 3 jours induit une réduction dose-dépendante de leur nombre d'ovocytes. Bien que le traitement entrave le développement normal du système de détoxication hépatique et ovarien, l'animal est capable d'accroître ses capacités d'élimination des œstrogènes. Ces capacités sont toutefois insuffisantes pour bloquer les effets du traitement. Quelle que soit la dose d'E2 utilisée (0.1 ou 10 µg/jour), la puberté est plus précoce chez les femelles exposées mais toutes sont fertiles, au moins transitoirement. Cependant le traitement induit une dégradation rapide des capacités reproductives. L'E2 modifie la dynamique folliculaire chez l'adulte, longtemps après l'arrêt du traitement. Si une forte dose d'E2 réduit la survie des ovocytes lors de la formation des follicules et conduit à une infertilité secondaire due à un dysfonctionnement général du tractus reproducteur, une dose faible n'affecte pas la survie des ovocytes à court terme mais conduit à une sénescence reproductive précoce vraisemblablement d'origine ovarienne. L'origine de ces troubles pourrait résider dans les effets précoces de l'exposition à E2 : cette molécule altère le transcriptome ovarien et induit de nombreuses lésions de l'ADN des cellules ovariennes. / The ovary is not solely the unique source of oocytes necessary for fertilization but also a crucial conductor of endocrine regulations of the reproductive system. In the fetal ovary, oocytes grouped in clusters are surrounded by somatic pre-granulosa cells, altogether delineated by a basement membrane and constituting ovarian cords. The formation of the definitive ovarian functional units requires their fragmentation into follicles formed by a single oocyte surrounded by granulosa cells and delineated by a basement membrane. This partitioning occurs within a tiny period and is dependent on the correct timing of the meiotic process, on an apoptotic wave that specifically targets oocytes and the remodelling of the basement membrane. Follicle formation is a crucial event of ovarian development because the follicle stock formed at the end of this process is non-renewable. Therefore, any disturbance of this process can lead to reproductive abnormalities in adulthood. Recent data on endocrine disruptors displaying estrogenic activity have involved the fragile estrogenic homeostasis in the process. We aimed at better understanding how the endogen estrogen 17b-estradiol (E2) contributes to follicle formation. To assess it, Sprague-Dawley rats were treated with E2 at different doses during follicle formation, /i.e./ in the 3 days following birth. We show that although this treatment impairs the development of the hepatic and ovarian detoxification systems, the female neonate is able to increase its estrogen clearance capabilities. Nevertheless, E2 treatment within this critical period triggers a dose-dependent decrease of oocyte number per ovary. Regardless of the E2 dose, puberty is advanced. All treated females are at least transiently fertile, yet these reproductive capabilities rapidly decline. A high (10 µg/day) dose of E2 leads to a secondary infertility characterized by anovulation that probably result from a dysfunction of the whole reproductive tract. By contrast, a lower (0.1 µg/day) dose of E2, that does not significantly modify neonatal oocyte survival, leads to a progressive reproductive senescence likely due to ovarian failure. Long-term troubles may originate from precocious E2 impact on the ovary since it disturbs ovarian transcriptome and produces many lesions on ovarian cell DNA.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d’être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l’hypothèse qu’ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l’accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu’ABCG2 transporte de l’hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d’ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d’ABCG2, ECL3, composé d’environ 70 acides aminés. L’affinité d’ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l’albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l’hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L’ensemble de ce travail a donc permis d’une part de mieux comprendre le rôle d’ABCG2 dans la régulation de l’homéostasie des porphyrines, notamment l’hème, et d’autre part, de façon originale, d’identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s’effectue. / ABCG2 belongs to the ABC-transporter family, involved in drug resistance developed by cells, notably cancer cells. This transporter has also a physiological role of endobiotic detoxification, in particular porphyrins that are essential but potentially toxic molecules. This toxicity implies a specific handle, to avoid them to remain free in solution. In that context, we hypothesized that ABCG2 participate to this detoxification, limiting the intracellular porphyrin accumulation by presenting them to an extracellular partner. We show that ABCG2 transports heme and some of its derivatives and precursors. Interestingly, these porphyrins, unlike other ABCG2 (non-porphyric) substrates, can bind to an extracellular domain, specific of ABCG2, ECL3, 70 residues-long. ECL3 displays affinities for porphyrins in the range of 0.5 to 3.5 μM, high enough to allow their binding after transport. We also show that human serum albumin, implicated in heme detoxification, releases porphyrins bound to ECL3 by a direct interaction with ABCG2. This work established a better comprehension of ABCG2 role in porphyrin and in particular heme homeostasis regulation. In addition, our results contribute to elucidate part of the molecular mechanism by which such regulation is carried out.

L’aflatoxine B1 (AFB1) et l’ochratoxine A (OTA) sont des mycotoxines pouvant contaminer une large variété de denrées alimentaires. L’ingestion d’aliments contaminés par des animaux d’élevage peut entraîner l’altération de leur santé et de leurs performances zootechniques ainsi qu’un problème de sécurité alimentaire lié à la présence de résidus de mycotoxines dans les produits animaux, notamment le lait. Des traitements de détoxication basés sur l’addition d’adsorbants organiques ont été développés pour fixer les mycotoxines dans le tube digestif et ainsi réduire l’exposition des animaux. L’objectif de ce travail de thèse était d’évaluer l’efficacité d’un adsorbant à base d’extraits de parois modifiées de levures (Mycosorb®) sur deux modèles animaux, le rat et la brebis. L’efficacité a été déterminée en réalisant un suivi des mycotoxines et/ou de leurs métabolites dans 3 matrices : l’excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine. Sur les 2 modèles animaux, nous avons ainsi étudié les effets de l’apport en Mycosorb sur l’excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine des 2 mycotoxines (AFB1 et OTA). Chez le rat, le suivi de la radioactivité a montré que les fèces d’animaux supplémentés en parois de levures contiennent significativement plus de mycotoxines. Cette augmentation de la radioactivité dans les fèces s’est accompagnée d’une diminution marquée de la radioactivité dans le sang et dans les urines. Chez la brebis laitière, en plus de ces paramètres, nous avons évalué l’effet de l’adsorbant sur les paramètres de production de l’animal et l’excrétion des mycotoxines dans le lait. L’addition de la paroi de levure a entraîné une augmentation significative de l’excrétion de l’AFB1 et de son métabolite, l’aflatoxine M1(AFM1) dans les fèces du ruminant. Cette augmentation de l’excrétion fécale s’accompagne de la réduction du taux d’AFM1 excrété dans l’urine mais pas dans le lait. Les effets observés chez les deux modèles expérimentaux semblent être liés à la séquestration des mycotoxines dans le tractus digestif des animaux et permettent de conclure à la capacité de l’adsorbant organique à réduire la biodisponibilité des mycotoxines testées. L’ajout de la paroi de levure pourrait, par conséquent, réduire les risques sanitaires chez les animaux d’élevage exposés à une alimentation contaminée par les mycotoxines. Cependant, nous n’avons pas observé d’effet sur la santé et les paramètres zootechniques des animaux dans les conditions expérimentales utilisées. / Aflatoxin B1 (AFB1) and Ochratoxin A (OTA) are mycotoxins that can be found in a large variety of feedstuffs. Consumption of contaminated feeds can affect the health and performances of farm animals and if transferred into animal products can be a problem for the safety of food. Different treatments of detoxication based on organic adsorbants addition have been developed to bind these mycotoxins in the digestive tract and thus to reduce exposure of animals. The objective of this work was to evaluate the efficacy of an adsorbent containing yeast cell wall extracts (Mycosorb®) in two animal models, the rat and the dairy ewe. The efficacy was determined by performing a monitoring of mycotoxins and/or theirs metabolites in 3 matrices : urinary and faecal excretion and blood kinetic. In both animal models, thus we have studied the effects of yeast cell walls on urinary and faecal excretion and blood kinetic of the 2 mycotoxins (AFB1 and OTA). Radioactivity analysis showed that faeces of animals supplemented with the adsorbent contained significantly more mycotoxins in rats. This increase of radioactivity in feces was associated with a marked decrease of radioactivity in blood and urine. In dairy ewes, in addition to these parameters, we have evaluated the effects of the adsorbent on the production parameters of animals and the excretion of mycotoxins in milk. The addition of yeast cell walls significantly increased the excretion of AFB1 and its metabolite, aflatoxin M1 (AFM1) in the faeces. This increase in fecal excretion was associated with a reduction of the excretion of AFM1 in urine but not in milk. The reduced absorption of AFB1 and OTA in both animal models could be associated with the capacity of the adsorbent to bind mycotoxins in the digestive tract. Addition of yeast cell wall extract could be a strategy to reduce sanitary risks in ruminants exposed to mycotoxins-contaminated feeds. However, we have not observed an effect on the health and the performances of animals in the experimental conditions used.

Les végétaux appartenant au genre Allium et notamment le poireau, Allium porrum, ont la caractéristique de produire des composés secondaires soufrés. A l'instar de nombreuses substances issues du métabolisme secondaire des plantes, ces composés soufrés semblent être impliqués dans les systèmes de défense naturelle des Allium. Les tests de toxicité réalisés sur différentes espèces d'insectes ont révélé que les substances volatiles soufrées émises par ces plantes, les thiosulfinates et leurs produits de dégradation, les disulfures et notamment le disulfure de diméthyle (DMDS) sont toxiques vis à vis de toutes les espèces testées. Le DMDS provoque la mort des insectes par un disfonctionnement mitochondrial via l'inhibition de la cytochrome oxydase conduisant à une forte diminution de la production d'ATP et de ce fait, à une perte de l'influx nerveux. Toutefois, les larves de la teigne du poireau, Acrolepiopsis assectella, lépidoptère spécialiste des Allium et notamment du poireau, sont nettement moins sensibles à ces substances soufrées que les autres espèces. Cet insecte a développé des mécanismes adaptatifs spécifiques mais pour l'instant inconnus lui conférant cette meilleure tolérance et donc la possibilité de se développer sur sa plante hôte riche en substances soufrées. Les composés secondaires soufrés produits de façon constitutive par les poireaux agissent très certainement dans la nature par des phénomènes d'anti-appétence, de répulsion et de toxicité et représentent alors un système de défense constitutive directe vis à vis des insectes non inféodés à ces plantes. Ce système de défense peut probablement expliquer pourquoi si peu d'espèces phytophages sont capables de se développer aux dépens du poireau.<br />Lorsqu'il est attaqué de façon importante par la teigne du poireau, le poireau met en place une réponse se traduisant par une augmentation de la production de composés soufrés non volatils pouvant aboutir à une émission plus importante de substances soufrées volatiles. Cette réponse du poireau induite par l'attaque des teignes a des répercussions sur le comportement et les capacités de développement du lépidoptère spécialiste et semble ainsi représenter pour la plante un système de défense directe induite. Les composés soufrés volatils émis par le poireau en ayant un rôle très important dans le comportement de recherche de l'hôte par Diadromus pulchellus, parasitoïde spécialiste des chrysalides de teignes du poireau pourraient être également impliqués dans un phénomène de défense indirecte de la plante.