Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The exposure of human populations to a variety of heavy metals has been a public health concern. Cadmium is a non-essential elements due to its immense usage in various industrial applications, is an environmental contaminant with food and tobacco smoking. This toxic metal is more efficiently absorbed through the lungs than through the gastrointestinal tract. Therefore, the use of lung as a target tissue of cadmium exposure is of great importance because this heavy metal can be absorbed on suspended particles, entering the lung through the respiration. Thus, a possible therapy for metal intoxication is to remove the toxic metals from the bound functional bioligands. The present study was designed to evaluate the effect of cadmium on d-minolevulinate dehydratase (d-ALA-D) activity from rat lung in vitro. d-ALA-D activity, a toxicological parameter, has been reported as a target of cadmium in different tissues. The protective effect of monotherapies with dithiol chelating (meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA) and 2,3-dimercaptopropane-1- sulfonic acid (DMPS)) or antioxidant agent (ascorbic acid, diphenyl diselenide, (PhSe)2, and Nacetylcysteine (NAC)) were also evaluated; as well as, the effect of a combined therapy (dithiol chelating x antioxidant agent) was studied. Moreover, to investigate the possible mechanism involved, we determined the effect of zinc chloride (ZnCl2) and dithiothreitol (DTT). The rat lung d-ALA-D activity was inhibited by low concentrations of cadmium, this inhibition occurred due the oxidation of SH groups of enzyme, and not by displacing zinc from the enzyme structure. The chelating agents were not effective in restoring enzyme activity inhibited by cadmium, and it presented an inhibitory effect per se. The possible mechanism involved in this inhibition was demonstrated. DTT restored the inhibition caused by both chelating agents, but ZnCl2 restored only the inhibitory effect of DMSA. This indicated that DMPS did not remove the zinc ions of the enzyme structure. This study also demonstrated that these chelating agents potentialized the d-ALA-D inhibition caused by cadmium. In this way, the study of possible mechanism verified that DTT restore the enzyme inhibition caused by cadmium/DMSA complex, but not by cadmium/DMPS complex. In contrast to DTT, ZnCl2 did not restore the enzyme activity inhibited by both complexes. In relation to antioxidants compounds, we can verify that none antioxidant utilized in this work was efficient in restoring the enzyme activity inhibited by cadmium. Some authors had demonstrated that the association of chelating and antioxidant agents is a good alternative in treatment of metal intoxication. In this way, we observed a combined effect of cadmium x DMPS x (PhSe)2 and cadmium x DMPS x NAC. However, this combined effect of cadmium x antioxidant x chelating did not observe when we utilized DMSA as chelating agent. In general, the results of this study indicate that cadmium inhibited the pulmonary d-ALA-D activity; and, the use oh chelating and antioxidant agents, alone or combined, 6 did not restore the enzyme activity, in some cases, potentialized the inhibition induced by cadmium. The principal mechanism involved in enzyme inhibition was the oxidation of SH groups. / A exposição das populações humanas a uma variedade de metais pesados é um problema de saúde pública. O cádmio é um elemento não essencial e devido ao seu imenso uso em diversas aplicações industriais, é um contaminante ambiental através da comida e da fumaça do cigarro. Este metal tóxico é mais eficientemente absorvido através dos pulmões do que do trato gastrointestinal. Portanto, o uso dos pulmões como um tecido alvo do cádmio é de grande importância porque este metal pesado pode ser absorvido, entrando nos pulmões através da respiração. Uma terapia possível para a intoxicação por metais é remover os metais tóxicos ligados a bioligantes funcionais. O presente estudo foi delineado para avaliar o efeito in vitro do cádmio na atividade da d-aminolevulinato desidratase (d-ALA-D) em pulmão de rato. A atividade da d-ALA-D, um parâmetro toxicológico, tem sido reportada como alvo do cádmio em diferentes tecidos. Foram avaliados também o possível efeito protetor dos agentes quelantes ditiólicos (ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfônico (DMPS) e o ácido meso 2,3- dimercaptosuccínico (DMSA)) ou agentes antioxidantes (ácido ascórbico, N-acetilcisteína (NAC) e o disseleneto de difenila (PhSe)2) isolados ou em combinação (agentes quelantes x antioxidantes). Além disso, para investigar o possível mecanismo envolvido, nós determinamos o efeito restaurador do cloreto de zinco (ZnCl2) e do ditiotreitol (DTT) na d-ALA-D. A atividade da d-ALA-D de pulmão de rato foi inibida por baixas concentrações de cádmio, e esta inibição ocorreu devido a oxidação dos grupos -SH da enzima, e não por remover os íons zinco da estrutura enzimática. Os agentes quelantes não foram efetivos em proteger a atividade da enzima inibida por cádmio, e apresentaram um efeito inibitório per se. O possível mecanismo envolvido nesta inibição foi demonstrado. O DTT restaurou a inibição causada por ambos agentes quelantes, mas o ZnCl2 restaurou somente o efeito inibitório do DMSA. Isto indica que o DMPS não remove os íons zinco da estrutura da enzima. Este estudo demonstrou também que estes agentes quelantes potencializam a inibição da d-ALA-D causada por cádmio. Neste sentido, o estudo do possível mecanismo verificou que o DTT restaura a inibição da enzima causada pelo complexo cádmio/DMSA, mas não pelo complexo cádmio/DMPS. Ao contrário do DTT, o ZnCl2 não restaura a atividade da enzima inibida por ambos complexos. Em relação aos compostos antioxidantes, nós podemos verificar que nenhum antioxidante utilizado neste trabalho foi eficiente em restaurar a atividade da enzima inibida por cádmio. Alguns autores têm demonstrado que a associação de agentes quelantes e antioxidantes é uma boa alternativa no tratamento das intoxicações por metais. Neste sentido, observou-se um efeito combinado de cádmio x DMPS x (PhSe)2 e cádmio x DMPS x NAC. Porém esse efeito combinado de cádmio x antioxidantes x quelantes não foi observado quando se utilizou o DMSA como 4 agente quelante. De uma maneira geral, os resultados deste estudo indicam que o cádmio inibiu a atividade da d-ALA-D do tecido pulmonar; e ainda, o uso de agentes quelantes e antioxidantes, sozinhos ou combinados, não restauraram a atividade da enzima, sendo que em alguns casos, potencializaram a inibição induzida por cádmio. O mecanismo principal envolvido na inibição da enzima foi à oxidação dos grupos sulfidrílicos.

Bacteriophage MooMoo is a temperate phage that was isolated and propagated on Mycobacterium smegmatis (M. smeg). It typically produces turbid plaques, however spontaneous clear plaque mutants can be readily isolated. Both turbid (MooMoo-T) and clear plaque (MooMoo-C) formers can establish stable lysogens, but the parental turbid plaque forming phage has a higher lysogenic frequency. The phage repressor protein typically plays the central role in regulating the lysis/lysogeny decision. Therefore, we expected that the mutation responsible for the clear plaque phenotype would be located in the repressor gene. Remarkably, whole genome sequencing detected a single base pair mutation in the minor tail protein gene (gp19). The regulatory role of the repressor protein could not be excluded considering it was unclear how the mutation in gp19 was leading to the altered plaque phenotype. To locate the phage repressor, we used bioinformatics to identify several candidate genes with helix-turn-helix and DNA binding motifs (gp42, gp43 and gp44). We also cloned the parental and mutant gp19 genes. Each candidate gene was cloned into a shuttle vector. The clones of gp43, gp44 and both derivatives of gp19 did not prevent MooMoo growth, whereas the clones of gp42 inhibited phage growth. Based on these results, we concluded that gp42 is the phage repressor for MooMoo. To determine if the presence of gp19 alters lysogenic frequency, lysogeny assays of wild-type (WT) and mutant gp19 clones were evaluated. Compared to the MooMoo-C lysate, the cloned copy of the mutant gp19 showed a slight increase in lysogeny efficiency. The lysogeny frequencies on strains that carry cloned copies of gp19 (WT or mutant) were similar to those obtained on strains that lacked the plasmids. From these results, we concluded, the presence of either parental or mutant gp19 clones does not affect the lysogeny frequency. To determine if host cell physiology was affected by lysogeny, carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur utilization resources were screened using high-throughput phenotypic microarrays. From these results, we concluded the presence of the WT or mutant prophage had no significant effect on the utilization of the resources tested.

The activity of Delta-Aminolevulinate Dehydratase (d-ALA-D) was analyzed in patients suffering from diabetes mellitus and primary hypothyroidism. Five groups of patients were studied: compensated diabetes mellitus, non-compensated diabetes mellitus, compensated hypothyroidism, non-compensated hypothyroidism and control group. The analysis of d-ALA-D in these groups showed the following results: the activity of d-ALA-D on non-compensated diabetes mellitus decreased comparing to the control group, to the compensated diabetes mellitus group. The activity of d-ALA-D on non-compensated hypothyroidism increased compared to the control group and also to non-compensated hypothyroidism. In vitro analyses of the drugs used by the patients suffering diabetes mellitus (metformin, chlorpropamide, glibenclamide, glimepiride) and the drug used by the patients suffering primary hypothyroidism (thyroxine) were fulfilled to verify some change in the activity of d-ALA-D, and the findings showed that there was not any changes on d-ALA-D activity. Metals may interfere in the action of d-ALA-D. Consequently,the quantity of metals (lead, zinc, copper) present in the patients blood was measured. One observed that the amount of those metals was not different, from a statistical, among the groups. Therefore, we can conclude that the activity of d-ALA-D increased in the group of non-compensated hipothyroidism and decreased in the non-compensated diabetes, and may be it could be related to the complications observed in such pathologies / A atividade da delta-aminolevulinato desidratase (d-ALA-D) foi analisada em pacientes com diabetes mellitus e pacientes com hipotireoidismo primário. Foram estudados cinco grupos de pacientes: diabetes mellitus compensado, diabetes mellitus descompensado, hipotireoidismo compensado, hipotireoidismo descompensado e grupo controle. A análise da d-ALA-D nesses grupos mostrou os seguintes resultados: a atividade da d-ALA-D nos pacientes com diabetes mellitus descompensados encontrava-se diminuída em relação ao grupo controle, ao grupo dos diabéticos compensados. Observamos que nos pacientes com hipotireoidismo descompensado, a atividade da d-ALA-D encontrava-se aumentada em relação ao controle e também em relação ao grupo dos hipotireoideos compensados. Foram realizadas análises in vitro das medicações utilizadas pelos pacientes diabéticos (metformina, glibenclamida, clorpropamida, glimepirida) e hipotireoideos (tiroxina), com o objetivo de verificar se havia alteração na atividade da d-ALA-D e como resultados obtivemos que as medicações não alteraram a atividade da referida enzima. Os metais podem interferir na atividade da d-ALA-D. Por isso foi medida a quantidade de metais (chumbo, zinco, cobre) presentes no sangue destes pacientes. Observamos que a quantidade dos referidos metais não foi diferente, do ponto de vista estatístico, entre os grupos. Desta forma, concluímos que a atividade da d-ALA-D estava aumentada no grupo de pacientes hipotireoideos descompensados e diminuída no dos diabéticos descompensados, podendo este fato ter relação com o desenvolvimento das complicações nestas doenças