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Platinum-based drugs are an important group of alkylating-like agents which are used in cancer chemotherapy treatment. Cisplatin and oxaliplatin in particular are still commonly used today and are the focus of this thesis. As with most chemotherapy drugs, the efficacy of these drugs are limited by toxicity as well as tumour resistance, and therefore by increasing our understanding of these areas it is hoped to one day achieve personalised chemotherapy. The use of ICP-MS in the study of bio-sciences is still relatively new, however it has the ability to provide robust, fast and accurate methods for the quantification of platinum in biological samples. The research presented here utilised mass spectrometry in the study of the formation of Pt-DNA adducts in the clinical samples, the binding of oxaliplatin to short peptides and the effect of selenium supplementation on oxaliplatin in colorectal cancer cell lines. A comparison in the number of Pt-DNA adducts in saliva and leukocyte samples obtained from patients undergoing Pt-based chemotherapy demonstrated a lack of correlation between the two sample types. Samples were taken pre- and post-treatment and analysed via SF-ICP-MS and significant inter-patient variability was observed as expected. In both leukocyte and saliva samples, not only was Pt from previous chemotherapy cycles observed, but Pt was detected in the DNA in both sample types 1 hour after treatment. However a lack of correlation between platinum levels seen in the blood and saliva, combined with unexpected difficulties obtaining patient adherence to the saliva sampling protocol, indicated that saliva does not at present offer a reliable alternative to leukocytes for this assay. The binding of oxaliplatin to short nitrogen and sulfur rich peptides was investigated. Platinum binding to the peptides was observed and no significant differences in the level of binding were observed between the range of N and S rich peptides studied in this investigation. Partly due to the inability to reproduce biological conditions in this study, oxaliplatin was observed as a whole molecule, and furthermore dimers and multimers were also observed. The effect of selenium supplementation on the total cellular uptake of platinum was investigated in cultured cells via ICP-MS and LA-ICP-MS. It was observed that selenium decreased the amount of Pt taken up by the cancer cells. This was seen in analysis of populations of cells as well as by single cell analysis. Furthermore, while problems were encountered measuring selenium in subcellular experiments, the effect of selenium on the subcellular distribution of platinum as well as the number of Pt-DNA adducts could be determined.

O produto comercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) é amplamente utilizado pela industria têxtil. Estudos mostram que corantes dinitrofenilazo são genotóxicos no ensaio de Ames/Salmonella, mas há poucos estudos sobre seus efeitos em células eucariontes. Este trabalho teve como objetivo investigar a genotoxicidade e citotoxicidade do corante DB291 em células humanas em cultura, bem como vias pelas quais o corante atua levando aos efeitos tóxicos. O corante comercial foi purificado por HPLC-DAD e utilizado para incubação com células HepG2 (5-100 µM por 3-72 h). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios de XTT, corante cristal violeta, lactato desidrogenase extracelular e consumo de glicose. A geração de ROS intracelular foi verificada pela emissão de fluorescência da 2\',7\'-diclorofluoresceína. Análises de ciclo celular, fragmentação do DNA, potencial de membrana mitocondrial (Ψ) e cálcio intracelular foram realizadas por citometria de fluxo. A produção de ATP foi mensurada por quimiluminescência. Níveis de 8-oxodG e 5-mdC foram avaliados por HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-UV, respectivamente. A expressão da enzima DNMT1 foi avaliada por western blot. Um produto de biotransformação foi identificado e caracterizado estruturalmente por MS/MS e 1H-RMN. A exposição ao corante DB291 diminuiu significativamente a sobrevivência das células em um modo tempo- e dose-dependente (IC50 = 74 µM), com a concomitante formação de um produto de biotransformação reduzido. A morte celular ocorreu sem lise da membrana plasmática. Nas células expostas, foi observado aumento da atividade enzimática mitocondrial, acompanhado por um aumento da taxa de consumo de glicose. Índices elevados de ATP, Ψ e cálcio foram verificados após a incubação das células com concentrações crescentes do corante. Alterações mitocondriais e o processo de biotransformação impeliram a aumento na produção de ROS intracelular, 8-oxodG e fragmentação do DNA. O dano ao DNA induziu a parada no ciclo celular e super-expressão de DNMT1, seguido por hipometilação global do DNA no ciclo celular subsequente. Os resultados obtidos apontam pela primeira vez para a toxicidade do corante DB291 via biotransformação, com alterações mitocondriais e indução de estresse oxidativo. / The commercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) is widely used by textile industry. It is mutagenic in the Ames/S. typhimurium assay, but there are few studies showing its effects in eukaryotic cells. We evaluated here the toxicity of CI DB291 in the human HepG2 cell line. The commercial dye was purified by HPLC-DAD and used for incubation with HepG2 cells (5-100 µM for 3-72 h). Cytotoxicity was assessed by the XTT, crystal violet dye, extracellular lactate dehydrogenase and glucose consumption assays. ROS formation was assessed by 2\',7\'-dichlorofluorescein fluorescence. Analyses of cell cycle, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential (Ψ) and intracellular calcium were analyzed by flow cytometry. ATP level was measured by chemiluminescence. Levels of 8-oxodG and 5-mdC were evaluated by HPLCESI-MS/MS and HPLC-UV, respectively. DNMT1 expression was assessed by western blot. A biotransformation product was identified and structurally characterized by MS/MS and 1H-NMR. DB291 significantly decreased cell survival in a time- and dose-dependent manner (IC50 = 74 µM), with concomitant formation of a reduced biotransformation product. Plasma membrane lysis did not occur. Increased mitochondrial enzymatic activity, accompanied by increase in glucose consumption rate, was observed in cells incubated with DB291. Elevated ATP, Ψ, and intracellular calcium was verified after cell incubation with increasing dye concentrations. Mitochondrial changes and the biotransformation process accounted for the observed raise in intracellular ROS, 8-oxodG, and DNA fragmentation. DNA damage induced cell cycle arrest and DNMT1 overexpression, followed by DNA hypomethylation in the subsequent cell cycle. Results point for the first time to toxicity of the dye through biotransformation, mitochondrial changes, and oxidative stress.

Introdução. O alto consumo de carne, principalmente vermelha e processada, tem sido relacionado com aumento de risco de doenças crônicas, especialmente o câncer. Uma das explicações possíveis são os métodos de preparo culinário a altas temperaturas, que acarretam na formação aminas heterocíclicas. Estes compostos são detoxificados no nosso organismo, passando por um processo, no qual podem ser geradas espécies reativas, relacionadas ao estresse oxidativo e ao dano ao DNA. Entretanto, os indivíduos apresentam respostas diferentes à mesma exposição dietética, podendo ter diferentes níveis de risco ou benefício com a mesma ingestão de alimentos. O código genético individual pode ser uma das causas dessa variação interpessoal. Objetivo. Investigar a relação entre o consumo de carnes e aminas heterocíclicas com estresse oxidativo e dano no DNA, considerando polimorfismos genéticos, fatores demográficos e de estilo de vida em residentes do Município de São Paulo. Métodos. Foram utilizados dados dietéticos, genéticos, bioquímicos e estilo de vida de um estudo transversal com amostra probabilística de múltiplo estágio chamado Inquérito de Saúde de São Paulo (ISACapital). Os dados de carne e aminas heterocíclicas foram obtidos a partir de um recordatório alimentar de 24 horas e questionário sobre métodos de cocção e graus de cozimento das carnes. A extração do DNA ocorreu pelo método por sal e utilizou-se a técnica PCR em tempo real para determinação dos seguintes polimorfismos de nucleotídeo único: CYP1A1 (rs1048943), CYP1A2 (rs762551, rs35694136), CYP1B1 (rs1056836, rs10012), NAT2 (rs1208, rs1041983, rs1799929, rs1801280, rs1799931, rs1799930, rs1801279), NAT1 (rs4986782, rs5030839, rs56379106, rs56318881, rs6586714), SULT1A1 (rs928286), UGT1A9 (rs3832043), SOD2 (rs4880), CAT (rs7943316), GSTA1 (rs3957357), GSTP1 (rs1695), e deleção dos genes GSTM1 e GSTT1. Foram utilizados os biomarcadores malonaldeído (MDA) no plasma para estimar o estresse oxidativo e o 8-OHdG no plasma para estimar dano ao DNA. As associações foram examinadas por meio de modelos de regressão múltipla linear e logística ajustadas por sexo, idade, IMC, consumo de frutas e calorias, atividade física e fumo. Resultados. O consumo médio de aminas heterocíclicas foi de 437ng/dia e a carne de boi foi a que mais contribuiu para o consumo de aminas. Participantes que consumiram carne de boi grelhada muito bem passada apresentaram maiores concentrações de MDA do que os demais. Encontrou-se associação positiva entre consumo de aminas heterocíclicas com estresse oxidativo e dano ao DNA, isto é, indivíduos que consumiram maiores teores de aminas heterocíclicas apresentaram maiores chances de ter elevados concentrações de MDA (OR=1,17; P=0,04) e maiores concentrações de 8-OHdG (=1,62; P=0,04). Observou-se também que esta associação pode ser modificada pelas características genéticas individuais, sendo que polimorfismos nos genes das enzimas de detoxificação NAT2 e CYP1B1 interagiram com o consumo de aminas, diminuindo o estresse oxidativo. Conclusão. Verificou-se que o alto consumo de aminas heterocíclicas contribuiu para maiores níveis de estresse oxidativo e dano ao DNA independente de fatores demográficos e de estilo de vida, aumentando o risco de doenças crônicas. Observou-se também que esta relação pode ser alterada na presença de polimorfismos genéticos individuais. / Introduction. The excessive meat intake, especially red and processed meat, has been linked to chronic diseases, especially cancer. One of the reasons for that is the cooking process at high temperatures that can form heterocyclic amines (HCA). During HCA metabolism, reactive species can be formed, which can cause oxidative stress and DNA damage. However, people can show different answers to the same food intake, increasing or decreasing the risk of diseases. The DNA code can be one of the causes of this between-person variations. Objective. To investigate the association between meat/heterocyclic amine intake with oxidative stress and DNA damage, considering polymorphism, demographic and life style factors among population of São Paulo city. Methods. Information on food intake, genetics, biochemical, and lifestyle was obtained from a representative, multistage probability-based cross-sectional study titled Health Survey for Sao Paulo (ISA-Capital). Meat and heterocyclic amine intake was estimated by a 24-hour dietary recall complemented by a detailed questionnaire with preferences of cooking methods and level of doneness for meats. The salt method was used for DNA extraction and real time PCR to identify the following single nucleotide polymorphisms: CYP1A1 (rs1048943), CYP1A2 (rs762551, rs35694136), CYP1B1 (rs1056836, rs10012), NAT2 (rs1208, rs1041983, rs1799929, rs1801280, rs1799931, rs1799930, rs1801279), NAT1 (rs4986782, rs5030839, rs56379106, rs56318881, rs6586714), SULT1A1 (rs928286), UGT1A9 (rs3832043), SOD2 (rs4880), CAT (rs7943316), GSTA1 (rs3957357), GSTP1 (rs1695), GSTM1 and GSTT1 (null or not). We used malondialdehyde (MDA) concentration in plasma to estimated oxidative stress, and 8-OHdG concentration in plasma to estimate DNA damage. Analyses were performed using multivariate logistic and linear regressions adjusted for smoking, sex, age, body mass index, energy intake, fruit intake, smoking and physical activity. Results. Mean HCA intake was 437ng/day and beef was the meat that contributed more to HCA. Participants who consumed grilled beef very well-done presented more MDA concentration than other participants. We found significant association between heterocyclic amine intake with oxidative stress and DNA damage. Participants who consumed high levels of heterocyclic amines showed higher odds to show high MDA concentration (OR=1.17; P=0.04) and high 8-OHdG concentration (=1.62; P=0.04). These associations could be modified by individual genetic characteristics. Polymorphisms in genes that codify NAT2 and CYP1B1 detoxification enzymes interacted with HCA intake, decreasing oxidative stress. Conclusions. The high heterocyclic amine intake contributed to increase oxidative stress independently of lifestyle and demographic factors, increasing risk of chronic diseases. These relationships can be modified by genetic polymorphisms.

O produto comercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) é amplamente utilizado pela industria têxtil. Estudos mostram que corantes dinitrofenilazo são genotóxicos no ensaio de Ames/Salmonella, mas há poucos estudos sobre seus efeitos em células eucariontes. Este trabalho teve como objetivo investigar a genotoxicidade e citotoxicidade do corante DB291 em células humanas em cultura, bem como vias pelas quais o corante atua levando aos efeitos tóxicos. O corante comercial foi purificado por HPLC-DAD e utilizado para incubação com células HepG2 (5-100 µM por 3-72 h). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios de XTT, corante cristal violeta, lactato desidrogenase extracelular e consumo de glicose. A geração de ROS intracelular foi verificada pela emissão de fluorescência da 2\',7\'-diclorofluoresceína. Análises de ciclo celular, fragmentação do DNA, potencial de membrana mitocondrial (Ψ) e cálcio intracelular foram realizadas por citometria de fluxo. A produção de ATP foi mensurada por quimiluminescência. Níveis de 8-oxodG e 5-mdC foram avaliados por HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-UV, respectivamente. A expressão da enzima DNMT1 foi avaliada por western blot. Um produto de biotransformação foi identificado e caracterizado estruturalmente por MS/MS e 1H-RMN. A exposição ao corante DB291 diminuiu significativamente a sobrevivência das células em um modo tempo- e dose-dependente (IC50 = 74 µM), com a concomitante formação de um produto de biotransformação reduzido. A morte celular ocorreu sem lise da membrana plasmática. Nas células expostas, foi observado aumento da atividade enzimática mitocondrial, acompanhado por um aumento da taxa de consumo de glicose. Índices elevados de ATP, Ψ e cálcio foram verificados após a incubação das células com concentrações crescentes do corante. Alterações mitocondriais e o processo de biotransformação impeliram a aumento na produção de ROS intracelular, 8-oxodG e fragmentação do DNA. O dano ao DNA induziu a parada no ciclo celular e super-expressão de DNMT1, seguido por hipometilação global do DNA no ciclo celular subsequente. Os resultados obtidos apontam pela primeira vez para a toxicidade do corante DB291 via biotransformação, com alterações mitocondriais e indução de estresse oxidativo. / The commercial CI Disperse Blue 291 (CI DB291) is widely used by textile industry. It is mutagenic in the Ames/S. typhimurium assay, but there are few studies showing its effects in eukaryotic cells. We evaluated here the toxicity of CI DB291 in the human HepG2 cell line. The commercial dye was purified by HPLC-DAD and used for incubation with HepG2 cells (5-100 µM for 3-72 h). Cytotoxicity was assessed by the XTT, crystal violet dye, extracellular lactate dehydrogenase and glucose consumption assays. ROS formation was assessed by 2\',7\'-dichlorofluorescein fluorescence. Analyses of cell cycle, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential (Ψ) and intracellular calcium were analyzed by flow cytometry. ATP level was measured by chemiluminescence. Levels of 8-oxodG and 5-mdC were evaluated by HPLCESI-MS/MS and HPLC-UV, respectively. DNMT1 expression was assessed by western blot. A biotransformation product was identified and structurally characterized by MS/MS and 1H-NMR. DB291 significantly decreased cell survival in a time- and dose-dependent manner (IC50 = 74 µM), with concomitant formation of a reduced biotransformation product. Plasma membrane lysis did not occur. Increased mitochondrial enzymatic activity, accompanied by increase in glucose consumption rate, was observed in cells incubated with DB291. Elevated ATP, Ψ, and intracellular calcium was verified after cell incubation with increasing dye concentrations. Mitochondrial changes and the biotransformation process accounted for the observed raise in intracellular ROS, 8-oxodG, and DNA fragmentation. DNA damage induced cell cycle arrest and DNMT1 overexpression, followed by DNA hypomethylation in the subsequent cell cycle. Results point for the first time to toxicity of the dye through biotransformation, mitochondrial changes, and oxidative stress.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico encontrado em grandes quantidades no cigarro, em medicamentos e alimentos, além de ser um dos mais importantes metabólitos tóxicos do benzeno (BZ). Temos mostrado que a exposição sistêmica à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Complementando estas investigações, o objetivo do presente projeto foi investigar o efeito da exposição ambiental à HQ sobre o recrutamento leucocitário para o pulmão induzido pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS) e sobre os eventos celulares envolvidos neste processo, bem como sobre a formação de adutos de DNA no tecido pulmonar. Para tanto, 12,5, 25 ou 50 ppm de HQ ou veículo (solução salina 5% de etanol) foram nebulizadas em caixa de exposição (60 mL/1h; 5 dias) onde 5 camundongos Swiss machos estavam alocados. Uma hora após as últimas exposições, a inflamação pulmonar foi induzida pela inalação de LPS (0,1 mg/mL; 10 min). Os animais expostos à HQ e na vigência ou ausência de inflamação foram empregados para: 1) coleta do lavado broncoalveolar (LBA) três horas após a inalação de LPS para quantificação do número de leucócitos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); 2) coleta de sangue para quantificação do número de leucócitos circulantes antes e 3 horas após a inalação de LPS (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); para a quantificação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos de animais não inflamados induzida ou não pelo formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) in vitro (citometria de fluxo); para obtenção de plasma para quantificação de malonaldeído (HPLC) e de neutrófilos para quantificação de espécies reativas de oxigênio intracelular (EROs; citometria de fluxo) de animais não inflamados pelo LPS; 3) coleta de tecido pulmonar para quantificação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) 3 horas após a inalação de LPS e para quantificação de adutos de DNA em tecido de animais não inflamados. Adicionalmente, a concentração de HQ na caixa de exposição foi quantificada por HPLC. Os resultados obtidos mostraram que a exposição à HQ não afetou os números de leucócitos circulantes, mas reduziu o número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no LBA; aumentou a atividade de MPO no tecido pulmonar; reduziu a expressão de L-selectina em PMN estimulados in vitro pelo fMLP; aumentou a expressão de β2 integrinas em PMN na vigência ou ausência (basal) de estimulação pelo fMLP; aumentou a expressão de β3 integrinas e PECAM-1 em condições basais; aumentou a formação de EROs por PMN; não alterou a expressão das moléculas de adesão endoteliais PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, JAM-C, P e Eselectinas e VE-Caderina; não aumentou significantemente a formação de adutos 8-oxo-7,8-dihidro- 2\'-desoxiguanosina e 1,N2-propano-2\'-deoxiguanosina no tecido pulmonar; aumentou a concentração de malonaldeído plasmático. A saturação da concentração de HQ na caixa de exposição foi 10 vezes menor que as preconizadas para a exposição ocupacional pelas agências regulamentadoras, indicando que mesmo a baixas concentrações de exposição, a HQ prejudica a resposta do hospedeiro a um agente infeccioso. O mecanismo tóxico pode estar relacionado à ativação das células na circulação, dependente da produção de espécies reativas de oxigênio, e que a toxicidade pode não ser detectada na ausência de resposta do organismo ao trauma. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound found in large quantities in cigarettes, medicines and food, besides it is one of the most important toxic metabolites of benzene (BZ). We have shown that systemic exposure impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of environmental exposure to HQ on leukocyte recruitment to the inflamed lung induced by lipolissacarideo of E. coli (LPS), the cell events involved in this process, and adducts formation on DNA of pulmonary tissue cells . For that 12.5, 25, or 50 ppm of HQ or vehicle (saline solution with 5% of ethanol) we aerosolized into an exposure box (60 mL/1h; 5 days) containing 5 male Swiss mice. One hour after the last exposures, the pulmonary inflammation was induced by LPS inhalation (0.1 mg/mL; 10 min). Animals exposed to HQ in presence or absence of inflammation were used for: 1) BAL collection three hours after LPS inhalation to quantify the leukocytes in BAL (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); 2) blood collection to quantify the circulating leukocytes before and three hours after LPS inhalation (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); to quantify the expression of adhesion moleculas in leukocytes from non-inflamed animals induced or not for formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) in vitro (flow citometry); to obtain blood plasma and quantify the formation of malondialdehyde (MDA; HPLC) and neutrophils to quantify the intracellular generation of reactive oxygen spices (ROS; flow citometry) from non-inflamed animals; 3) pulmonary tissue collection to quantify the expression oh adhesion molecules on endothelial cells and quantify the mieloperoxydase (MPO) activity, three hours after LPS inhalation and to quantify the DNA adducts on pulmonary tissue obtained from non-inflamed animals. Additionally, the concentration of HQ in the exposure box was quantified by HPLC. The results showed that exposure to HQ did not affect the numbers of circulating leukocytes, but reduced the number of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and mononuclear (MN) in BAL, increased the activity of MPO in lung tissue; reduced the expression of L-selectin in PMN stimulated by fMLP in vitro, increased the expression of β2 integrins in PMN in the presence or absence (basal) stimulation by fMLP, increased the expression of β3 integrin and PECAM-1 in basal conditions; increased ROS formation by PMN, did not alter the expression of endothelial adhesion molecules PECAM-1, VCAM- 1, ICAM-1, JAM-C, P and E-selectin and VE-Cadherin; not significantly increased the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-desoxyguanosine e 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine adducts in lung tissue; increased the concentration of plasma malondialdehyde. The concentration of HQ into the exposure box was 10 times lower than those recommended for occupational exposure from regulatory agencies, indicating that even at low exposure concentrations, HQ affect the host response to an infectious agent. The toxic mechanism may be related to activation of circulating cells, dependent on the generation of reactive oxygen species, and toxicity can not be detected in the absence of body response to trauma.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico encontrado em grandes quantidades no cigarro, em medicamentos e alimentos, além de ser um dos mais importantes metabólitos tóxicos do benzeno (BZ). Temos mostrado que a exposição sistêmica à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Complementando estas investigações, o objetivo do presente projeto foi investigar o efeito da exposição ambiental à HQ sobre o recrutamento leucocitário para o pulmão induzido pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS) e sobre os eventos celulares envolvidos neste processo, bem como sobre a formação de adutos de DNA no tecido pulmonar. Para tanto, 12,5, 25 ou 50 ppm de HQ ou veículo (solução salina 5% de etanol) foram nebulizadas em caixa de exposição (60 mL/1h; 5 dias) onde 5 camundongos Swiss machos estavam alocados. Uma hora após as últimas exposições, a inflamação pulmonar foi induzida pela inalação de LPS (0,1 mg/mL; 10 min). Os animais expostos à HQ e na vigência ou ausência de inflamação foram empregados para: 1) coleta do lavado broncoalveolar (LBA) três horas após a inalação de LPS para quantificação do número de leucócitos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); 2) coleta de sangue para quantificação do número de leucócitos circulantes antes e 3 horas após a inalação de LPS (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico®); para a quantificação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos de animais não inflamados induzida ou não pelo formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) in vitro (citometria de fluxo); para obtenção de plasma para quantificação de malonaldeído (HPLC) e de neutrófilos para quantificação de espécies reativas de oxigênio intracelular (EROs; citometria de fluxo) de animais não inflamados pelo LPS; 3) coleta de tecido pulmonar para quantificação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e para quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) 3 horas após a inalação de LPS e para quantificação de adutos de DNA em tecido de animais não inflamados. Adicionalmente, a concentração de HQ na caixa de exposição foi quantificada por HPLC. Os resultados obtidos mostraram que a exposição à HQ não afetou os números de leucócitos circulantes, mas reduziu o número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no LBA; aumentou a atividade de MPO no tecido pulmonar; reduziu a expressão de L-selectina em PMN estimulados in vitro pelo fMLP; aumentou a expressão de β2 integrinas em PMN na vigência ou ausência (basal) de estimulação pelo fMLP; aumentou a expressão de β3 integrinas e PECAM-1 em condições basais; aumentou a formação de EROs por PMN; não alterou a expressão das moléculas de adesão endoteliais PECAM-1, VCAM-1, ICAM-1, JAM-C, P e Eselectinas e VE-Caderina; não aumentou significantemente a formação de adutos 8-oxo-7,8-dihidro- 2\'-desoxiguanosina e 1,N2-propano-2\'-deoxiguanosina no tecido pulmonar; aumentou a concentração de malonaldeído plasmático. A saturação da concentração de HQ na caixa de exposição foi 10 vezes menor que as preconizadas para a exposição ocupacional pelas agências regulamentadoras, indicando que mesmo a baixas concentrações de exposição, a HQ prejudica a resposta do hospedeiro a um agente infeccioso. O mecanismo tóxico pode estar relacionado à ativação das células na circulação, dependente da produção de espécies reativas de oxigênio, e que a toxicidade pode não ser detectada na ausência de resposta do organismo ao trauma. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound found in large quantities in cigarettes, medicines and food, besides it is one of the most important toxic metabolites of benzene (BZ). We have shown that systemic exposure impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of environmental exposure to HQ on leukocyte recruitment to the inflamed lung induced by lipolissacarideo of E. coli (LPS), the cell events involved in this process, and adducts formation on DNA of pulmonary tissue cells . For that 12.5, 25, or 50 ppm of HQ or vehicle (saline solution with 5% of ethanol) we aerosolized into an exposure box (60 mL/1h; 5 days) containing 5 male Swiss mice. One hour after the last exposures, the pulmonary inflammation was induced by LPS inhalation (0.1 mg/mL; 10 min). Animals exposed to HQ in presence or absence of inflammation were used for: 1) BAL collection three hours after LPS inhalation to quantify the leukocytes in BAL (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); 2) blood collection to quantify the circulating leukocytes before and three hours after LPS inhalation (Neubauer chamber and Panótico® stained smears); to quantify the expression of adhesion moleculas in leukocytes from non-inflamed animals induced or not for formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) in vitro (flow citometry); to obtain blood plasma and quantify the formation of malondialdehyde (MDA; HPLC) and neutrophils to quantify the intracellular generation of reactive oxygen spices (ROS; flow citometry) from non-inflamed animals; 3) pulmonary tissue collection to quantify the expression oh adhesion molecules on endothelial cells and quantify the mieloperoxydase (MPO) activity, three hours after LPS inhalation and to quantify the DNA adducts on pulmonary tissue obtained from non-inflamed animals. Additionally, the concentration of HQ in the exposure box was quantified by HPLC. The results showed that exposure to HQ did not affect the numbers of circulating leukocytes, but reduced the number of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and mononuclear (MN) in BAL, increased the activity of MPO in lung tissue; reduced the expression of L-selectin in PMN stimulated by fMLP in vitro, increased the expression of β2 integrins in PMN in the presence or absence (basal) stimulation by fMLP, increased the expression of β3 integrin and PECAM-1 in basal conditions; increased ROS formation by PMN, did not alter the expression of endothelial adhesion molecules PECAM-1, VCAM- 1, ICAM-1, JAM-C, P and E-selectin and VE-Cadherin; not significantly increased the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-desoxyguanosine e 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine adducts in lung tissue; increased the concentration of plasma malondialdehyde. The concentration of HQ into the exposure box was 10 times lower than those recommended for occupational exposure from regulatory agencies, indicating that even at low exposure concentrations, HQ affect the host response to an infectious agent. The toxic mechanism may be related to activation of circulating cells, dependent on the generation of reactive oxygen species, and toxicity can not be detected in the absence of body response to trauma.

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La néphropathie aux plantes chinoises (CHN) est une maladie rénale grave qui a été décrite pour la première fois en 1993 chez des patientes ayant suivi un régime amaigrissant à base d’extraits de plantes chinoises (Aristolochia fangchi) contenant des acides aristolochiques (AA). Cette néphropathie se caractérise par une atrophie tubulaire et une fibrose interstitielle aboutissant à l’urémie terminale et se complique fréquemment de cancers des voies urinaires. Au moment d’initier ce travail, il subsistait toujours un large débat quant au rôle étiologique réel des acides aristolochiques dans la genèse de cette maladie. En effet, les gélules à visée amaigrissante contenaient d’autres substances potentiellement néphrotoxiques. Mais surtout, il n’existait aucune preuve expérimentale que les AA pouvaient induire une fibrose rénale interstitielle. Dans la première partie de ce travail, nous démontrons que l’injection par voie sous-cutanée d’AA à la dose de 10 mg/Kg/jour à des rats Wistar mâles en déplétion sodée entraîne l’apparition au 35ème jour d’une atrophie tubulaire, d’une fibrose interstitielle et d’une insuffisance rénale, reproduisant ainsi les anomalies caractéristiques de la CHN. Nous avons ensuite montré que la dexfenfluramine, substance anorexigène à action de type sérotoninergique prise concomitamment par les patientes atteintes de CHN, ne potentialise pas la toxicité rénale des AA. Enfin, la stimulation du système rénine angiotensine (SRA) par la déplétion sodée ou l’inhibition de celui-ci par un traitement pharmacologique ne modifie pas la fibrose interstitielle ni l’insuffisance rénale induite par les AA. En conclusion, nous avons réussi à développer un modèle in vivo de fibrose rénale interstitielle induite par les AA. Dès lors nous avons apporté la preuve expérimentale de l’implication des AA dans le développement de la CHN. Ce modèle a permis de démontrer que les autres éléments potentiellement néphrotoxiques contenues dans la cure d’amaigrissement (dexfenfluramine, diurétique, laxatif) n’influençaient pas l’évolution de la fibrose interstitielle, ce qui confirme que la prise isolée d’AA suffit à expliquer le développement de la CHN. Cette confirmation à d’importantes implications en santé publique dans la mesure où des plantes contenant des acides aristolochiques font toujours partie des phytothérapies traditionnelles. De plus, il est apparu que, dans ce modèle, les mécanismes de la fibrose rénale interstitielle pouvaient être largement indépendants du SRA. Enfin, de par sa durée limitée et sa grande reproductibilité, ce modèle constitue un outil expérimental d’avenir pour l’étude des mécanismes physiopathologiques de la fibrose rénale interstitielle en général.