The increasing incidence of disseminated (invasive) candidiasis is probably attributable to iatrogenic factors and to improved pre and postmortem evaluation. Premortem diagnosis of such infections have seldom been made early enough for successful treatment. In order to increase the likelihood of successful antifungal chemotherapy, rapid diagnosis of such infections is vital. However, present diagnostic procedures for invasive candidiasis are insensitive and often do not reliably differentiate superficial from invasive infections. This study was undertaken to produce DNA probes and to optimize conditions for rapid and efficient detection of Candida DNA. Seven random Candida albicans DNA fragments (2-7 kbp) were cloned into plasmid pACYC 184. These recombinant plasmids were labeled with either ³²p or biotin and used as probes. Two of the four recombinant plasmids tested were genus specific. The other two were slightly cross reactive with other yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala). Probes labeled with ³²p were twice as sensitive as the biotin probes. One ³²p labelled recombinant (#66) detected 7 Pg of target DNA , which corresponds to approximately 2 X 10⁵ C.albicans cells. With refined simple DNA extraction procedures for C.albicans (in serum), these recombinant probes could possibly be suitable for clinical application. / Medicine, Faculty of / Pathology and Laboratory Medicine, Department of / Graduate

Methoden zur direkten Detektion oder Anreicherung von doppelsträngiger DNA (dsDNA) bieten ein hohes Potential zum Einsatz in der molekularen Diagnostik. Bereits etablierte Methoden für die Nukleinsäure - Detektion (NAD) basieren in der Regel auf der Hybridisierung des komplementären Stranges gefolgt von der optischen Detektion oder enzymatischer Amplifikation. DNA - bindende oder organisierende Proteine (z.B. endogene Transkriptionsfaktoren) bieten im Kontrast zu den Hybridisierungsreaktionen eine überaus interessante Alternative um dsDNA direkt und zugleich spezifisch zu detektieren oder diese aus einem komplexen Gemisch heraus anzureichern. Im Rahmen der Entwicklung von neuartigen NAD - Assays zur direkten Detektion oder Anreicherung von Nukleinsäuren wurden vier DNA - bindende Proteine kloniert und in HEK293 und E. coli exprimiert. Der Cys2His2 - Zinkfinger (ZFD) vom humanen Transkriptionsfaktor Sp1 wurde mit MBP und 9×Lys - MBP fusioniert. Das MBP - Derivat 9×Lys - MBP ist eine erweiterte Variante mit neun aufeinanderfolgenden Lysinen im N - terminalen Bereich, welche eine regioselektive Immobilisierung ermöglichen soll. Der humane Sp3 - ZFD wurde mit EGFP fusioniert. Die Mitglieder der Sp - Familie binden spezifisch die Konsensussequenz 5’ - GGG GCG GGG - 3’ (GC - Box). Zusätzlich wurde die C - terminale DNA - bindende Domäne der E. coli DNA - Gyrase Untereinheit A (gyrA - CTD) ebenfalls mit MBP fusioniert. Die Domäne bindet spezifisch repetitive extragene Palindrome (REP), welche bislang nur auf bakteriellen Chromosomen vorkommen. Sämtliche MBP - Fusionsproteine liegen nach der Expression löslich vor und konnten über eine native Strategie aufgereinigt werden. Transiente Transfektionsexperimente in HEK293 zeigten einen destabilisierenden Effekt der Sp3 - ZFD und eine massive einhergehende Degradierung des EGFP - Fusionsproteins nach 120 h. Die Analyse der mRNA - Integrität nach Transfektion des Expressionsplasmids, sowie zellbiologische und proteinbiochemische Untersuchungen mit Durchflusszytometrie bzw. Western Blots deuten auf eine posttranslationale Modulierung von EGFP - Sp3 hin. Um die Hypothese der proteasomalen Degradierung von EGFP - Sp3 zu belegen, wurden transfizierte HEK293 mit dem reversiblen Proteasominhibitor MG132 behandelt. In Gegenwart von 1 µM MG132 konnte das zytosolische Fusionsprotein stabilisiert werden. Die hier präsentierten Daten offenbaren die humane Sp3 - ZFD als ein neues Substrat für das 26S - Proteasom. Lediglich die SUMOylierung von Wildtyp - Sp3 im Bereich der inhibitorischen Domäne (ID) ist bislang beschrieben worden. Die Funktionalität, Affinität und kinetische Parameter der mit MBP fusionierten Sp1 - ZFD und gyrA - CTD wurden anhand von Oberflächenplasmonresonanz (BIAcore) bzw. EMSAs analysiert. Sämtliche gewonnenen MBP - Fusionsproteine sind funktionell und interagieren mit dsDNA. Fusionsproteine mit Sp1 - Domäne zeigten in EMSAs ebenso eine Bindung an unspezifische dsDNA. In sensitiveren BIAcore - Assays mit immobilisierter dsDNA wurden (um den Faktor 2) geringere Assoziations (ka) - und Dissoziationsraten (kd) von MBP - Sp1 ermittelt, wenn bestimmte Basen innerhalb der GC - Box ausgetauscht wurden. Die Affinität (Kd) von MBP - Sp1 mit 4×10 - 9 M zur GC - Box und deren Derivate ist vergleichbar mit der Kd von nativem Sp1. Die EMSA - Experimente für MBP - gyrA zeigen eine deutliche Präferenz zum spezifischen dsDNA - Oligo in Gegenwart von humaner gDNA, eine interessante Eigenschaft die durchaus zur Anwendung in einem Assay zur Anreicherung von bakterieller DNA dienen kann. Nach der vorausgehenden Charakterisierung der MBP - Fusionsproteine wurden diese auf verschiedenen gängigen festen und semifesten Substraten über physische Adsorption, kovalent oder Affinität immobilisiert um das Konzept der direkten Detektion von dsDNA mit funktionellen Proteinen als neuartige Komponente in NAD - Assays umzusetzen. Lediglich MBP - Sp1 zeigte auf Glas und Polystyren - Mikrotiterplatten nach kovalenter oder adsorptiver Immobilisierung eine ausgeprägte Funktionalität hinsichtlich der Bindung von dsDNA. Die Immobilisierung von 9×Lys - MBP - Sp1 über identische Strategien führten zum massiven Verlust der ZFD - Funktion. Aus dieser Datenlage heraus wurde erfolgreich ein simples Lumineszenz - basiertes Mikrotiterplatten - Assay mit MBP - Sp1 entwickelt um PCR - Amplikons direkt aus einer analytischen PCR auf gDNA von S. aureus, welche die GC - Box beinhalten, nachzuweisen. Das spezifische Amplikon konnte mittels des simplen Assays in Gegenwart von 100fachem Überschuss an humaner gDNA nachgewiesen werden. Mit einem höheren Anteil an humaner gDNA wurde die PCR massiv inhibiert, ein negativer Effekt der bislang im Bereich der diagnostischen NAD - Assays nicht optimal adressiert wurde. Die magnetische Separation von bakterieller und humaner gDNA wurde dazu mit MBP - gyrA umgesetzt. Zunächst erfolgte die regioselektive Immobilisierung von MBP - gyrA auf Protein A - funktionalisierte magnetische Nanopartikel mittels MBP - Antikörper, wodurch die Funktionalität hinsichtlich der Bindung von dsDNA gewährleistet werden konnte. Dieses System eignet sich insbesondere für die Separation von bakterieller DNA (E. coli oder S. aureus) aus einem komplexen Gemisch mit bis zu 100fachem Überschuss an humaner gDNA. Die Kombination von MBP - gyrA - basierter magnetischer Separation mit NAD - Assays könnte deren Sensitivität signifikant erhöhen. Durch simple Verfahrensweise bietet das System einen wesentlichen Beitrag zur Verringerung des zeitlichen Aufwands für die Generierung therapierelevanter Resultate. / Methods for direct detection or enrichment of double - stranded DNA (dsDNA) possess tremendous potential for use in molecular diagnostics. Already established methods for nucleic acid detection (NAD) are generally based on the hybridization of two complementary strands followed by optical detection or enzymatic amplification. In contrast, DNA - binding or organizing proteins (e.g. endogenous transcriptions factors) are able to read the sequence information directly from dsDNA without prior denaturation of the double strand and subsequent hybridization. In order to develop novel NAD assays or assays for sample preparation, four artificial DNA - binding proteins were cloned, expressed and purified in HEK293 cells or E. coli. The Cys2His2 zinc finger domains (ZFD) from human Sp1 were fused to maltose binding protein (MBP) and its derivate 9×Lys - MBP, an extended variant with nine successive lysine residues in the N - terminal region of the protein to facilitate site - directed immobilization. The human Sp3 - ZFD was fused to green fluorescent protein (EGFP). The family of Sp - transcription factors was known to bind specifically the consensus sequence 5\' - GGG GCG GGG - 3 \'(GC - box). Moreover, the C - terminal DNA - binding domain of E. coli DNA Gyrase subunit A (gyrA - CTD) was fused to MBP. The CTD binds specifically repetitive extragenic palindromes (REP), which were only found on prokaryotic chromosomes. All MBP fusion proteins were soluble after expression and could be purified to homogeneity. Surprisingly, transient transfection experiments in HEK293 revealed a destabilizing effect of the Sp3 - ZFD accompanied by massive degradation of the EGFP fusion protein after 120 h post transfection. Analysis of mRNA integrity in combination with western blots indicates a posttranslational modulation of EGFP - Sp3. To confirm the hypothesis of proteasomal degradation of EGFP - Sp3, transfected cells were treated with the reversible proteasome inhibitor MG132. In the presence of 1µM MG132 the fusion protein could be stabilized. Taken together, the data presented here identified the human Sp3 - CTD as a new substrate for the 26S proteasome. Only SUMOylation of wild type human Sp3 within the inhibitory domain (ID) has been described so far. Initial EMSA experiments showed that purified MBP - ZFD fusion proteins were functional in terms of interacting with dsDNA containing the specific sequence motiv. However, all proteins bound to unspecific dsDNA as well. Therefore MBP - Sp1 was subjected to BIAcore analysis to determine the rate constants for association ka, dissociation kd and the dissociation constant Kd of the GC - Box - Protein complex as well as mutants of the GC - Box. The determined Kd (4 × 10 - 9 M) for MBP - Sp1 associated with GC - box or its derivatives were found to be comparable with the Kd of native Sp1, however the rate constants were reduced 2 fold in presence of the modified GC - boxes. EMSA experiments with MBP - gyrA revealed functionality and a clear preference for specific dsDNA in the presence of unspecific human genomic DNA (gDNA). After preliminary functional characterization, MBP fusion proteins were immobilized by physical adsorption, covalent or by affinity on various solid substrates or nanoscaled magnetic beads to implement the concept of direct detection of dsDNA or specific enrichment of bacterial DNA, respectively. MBP - Sp1 remains functional after adsorptive or covalent immobilization on different chemical modified glas surfaces. 9×Lys - MBP - Sp1 shows significantly reduced functionality after immobilization on the same glas substrates by similar strategies. Moreover, a simple NAD - assay with adsorptive immobilized MBP - Sp1 on polystyrene in microtiter format was established for direct detection of GC - boxes within PCR - products from S. aureus gDNA. By using the assay, specific PCR - products could be detected in presence up to 100 - fold excess of human gDNA in relation to 10 ng bacterial DNA. Separation of bacterial DNA from human DNA from clinical samples may have an important impact on downstream applications, involving NAD assays. To address this often underestimated technical problem, a new functional protein MBP - gyrA was introduced to overcome some limitations of already established methods. MBP - gyrA was site - directed coupled on nanoscaled magnetic beads by affinity. This system enabled the fast and specific separation of gDNA of E. coli or S.aureus from a huge background of human gDNA. The combination of MBP - gyrA - based magnetic separation with NAD assays could significantly increase the sensitivity and shorten the time for initiation of effective treatment.

Methoden zur direkten Detektion oder Anreicherung von doppelsträngiger DNA (dsDNA) bieten ein hohes Potential zum Einsatz in der molekularen Diagnostik. Bereits etablierte Methoden für die Nukleinsäure - Detektion (NAD) basieren in der Regel auf der Hybridisierung des komplementären Stranges gefolgt von der optischen Detektion oder enzymatischer Amplifikation. DNA - bindende oder organisierende Proteine (z.B. endogene Transkriptionsfaktoren) bieten im Kontrast zu den Hybridisierungsreaktionen eine überaus interessante Alternative um dsDNA direkt und zugleich spezifisch zu detektieren oder diese aus einem komplexen Gemisch heraus anzureichern. Im Rahmen der Entwicklung von neuartigen NAD - Assays zur direkten Detektion oder Anreicherung von Nukleinsäuren wurden vier DNA - bindende Proteine kloniert und in HEK293 und E. coli exprimiert. Der Cys2His2 - Zinkfinger (ZFD) vom humanen Transkriptionsfaktor Sp1 wurde mit MBP und 9×Lys - MBP fusioniert. Das MBP - Derivat 9×Lys - MBP ist eine erweiterte Variante mit neun aufeinanderfolgenden Lysinen im N - terminalen Bereich, welche eine regioselektive Immobilisierung ermöglichen soll. Der humane Sp3 - ZFD wurde mit EGFP fusioniert. Die Mitglieder der Sp - Familie binden spezifisch die Konsensussequenz 5’ - GGG GCG GGG - 3’ (GC - Box). Zusätzlich wurde die C - terminale DNA - bindende Domäne der E. coli DNA - Gyrase Untereinheit A (gyrA - CTD) ebenfalls mit MBP fusioniert. Die Domäne bindet spezifisch repetitive extragene Palindrome (REP), welche bislang nur auf bakteriellen Chromosomen vorkommen. Sämtliche MBP - Fusionsproteine liegen nach der Expression löslich vor und konnten über eine native Strategie aufgereinigt werden. Transiente Transfektionsexperimente in HEK293 zeigten einen destabilisierenden Effekt der Sp3 - ZFD und eine massive einhergehende Degradierung des EGFP - Fusionsproteins nach 120 h. Die Analyse der mRNA - Integrität nach Transfektion des Expressionsplasmids, sowie zellbiologische und proteinbiochemische Untersuchungen mit Durchflusszytometrie bzw. Western Blots deuten auf eine posttranslationale Modulierung von EGFP - Sp3 hin. Um die Hypothese der proteasomalen Degradierung von EGFP - Sp3 zu belegen, wurden transfizierte HEK293 mit dem reversiblen Proteasominhibitor MG132 behandelt. In Gegenwart von 1 µM MG132 konnte das zytosolische Fusionsprotein stabilisiert werden. Die hier präsentierten Daten offenbaren die humane Sp3 - ZFD als ein neues Substrat für das 26S - Proteasom. Lediglich die SUMOylierung von Wildtyp - Sp3 im Bereich der inhibitorischen Domäne (ID) ist bislang beschrieben worden. Die Funktionalität, Affinität und kinetische Parameter der mit MBP fusionierten Sp1 - ZFD und gyrA - CTD wurden anhand von Oberflächenplasmonresonanz (BIAcore) bzw. EMSAs analysiert. Sämtliche gewonnenen MBP - Fusionsproteine sind funktionell und interagieren mit dsDNA. Fusionsproteine mit Sp1 - Domäne zeigten in EMSAs ebenso eine Bindung an unspezifische dsDNA. In sensitiveren BIAcore - Assays mit immobilisierter dsDNA wurden (um den Faktor 2) geringere Assoziations (ka) - und Dissoziationsraten (kd) von MBP - Sp1 ermittelt, wenn bestimmte Basen innerhalb der GC - Box ausgetauscht wurden. Die Affinität (Kd) von MBP - Sp1 mit 4×10 - 9 M zur GC - Box und deren Derivate ist vergleichbar mit der Kd von nativem Sp1. Die EMSA - Experimente für MBP - gyrA zeigen eine deutliche Präferenz zum spezifischen dsDNA - Oligo in Gegenwart von humaner gDNA, eine interessante Eigenschaft die durchaus zur Anwendung in einem Assay zur Anreicherung von bakterieller DNA dienen kann. Nach der vorausgehenden Charakterisierung der MBP - Fusionsproteine wurden diese auf verschiedenen gängigen festen und semifesten Substraten über physische Adsorption, kovalent oder Affinität immobilisiert um das Konzept der direkten Detektion von dsDNA mit funktionellen Proteinen als neuartige Komponente in NAD - Assays umzusetzen. Lediglich MBP - Sp1 zeigte auf Glas und Polystyren - Mikrotiterplatten nach kovalenter oder adsorptiver Immobilisierung eine ausgeprägte Funktionalität hinsichtlich der Bindung von dsDNA. Die Immobilisierung von 9×Lys - MBP - Sp1 über identische Strategien führten zum massiven Verlust der ZFD - Funktion. Aus dieser Datenlage heraus wurde erfolgreich ein simples Lumineszenz - basiertes Mikrotiterplatten - Assay mit MBP - Sp1 entwickelt um PCR - Amplikons direkt aus einer analytischen PCR auf gDNA von S. aureus, welche die GC - Box beinhalten, nachzuweisen. Das spezifische Amplikon konnte mittels des simplen Assays in Gegenwart von 100fachem Überschuss an humaner gDNA nachgewiesen werden. Mit einem höheren Anteil an humaner gDNA wurde die PCR massiv inhibiert, ein negativer Effekt der bislang im Bereich der diagnostischen NAD - Assays nicht optimal adressiert wurde. Die magnetische Separation von bakterieller und humaner gDNA wurde dazu mit MBP - gyrA umgesetzt. Zunächst erfolgte die regioselektive Immobilisierung von MBP - gyrA auf Protein A - funktionalisierte magnetische Nanopartikel mittels MBP - Antikörper, wodurch die Funktionalität hinsichtlich der Bindung von dsDNA gewährleistet werden konnte. Dieses System eignet sich insbesondere für die Separation von bakterieller DNA (E. coli oder S. aureus) aus einem komplexen Gemisch mit bis zu 100fachem Überschuss an humaner gDNA. Die Kombination von MBP - gyrA - basierter magnetischer Separation mit NAD - Assays könnte deren Sensitivität signifikant erhöhen. Durch simple Verfahrensweise bietet das System einen wesentlichen Beitrag zur Verringerung des zeitlichen Aufwands für die Generierung therapierelevanter Resultate. / Methods for direct detection or enrichment of double - stranded DNA (dsDNA) possess tremendous potential for use in molecular diagnostics. Already established methods for nucleic acid detection (NAD) are generally based on the hybridization of two complementary strands followed by optical detection or enzymatic amplification. In contrast, DNA - binding or organizing proteins (e.g. endogenous transcriptions factors) are able to read the sequence information directly from dsDNA without prior denaturation of the double strand and subsequent hybridization. In order to develop novel NAD assays or assays for sample preparation, four artificial DNA - binding proteins were cloned, expressed and purified in HEK293 cells or E. coli. The Cys2His2 zinc finger domains (ZFD) from human Sp1 were fused to maltose binding protein (MBP) and its derivate 9×Lys - MBP, an extended variant with nine successive lysine residues in the N - terminal region of the protein to facilitate site - directed immobilization. The human Sp3 - ZFD was fused to green fluorescent protein (EGFP). The family of Sp - transcription factors was known to bind specifically the consensus sequence 5\'' - GGG GCG GGG - 3 \''(GC - box). Moreover, the C - terminal DNA - binding domain of E. coli DNA Gyrase subunit A (gyrA - CTD) was fused to MBP. The CTD binds specifically repetitive extragenic palindromes (REP), which were only found on prokaryotic chromosomes. All MBP fusion proteins were soluble after expression and could be purified to homogeneity. Surprisingly, transient transfection experiments in HEK293 revealed a destabilizing effect of the Sp3 - ZFD accompanied by massive degradation of the EGFP fusion protein after 120 h post transfection. Analysis of mRNA integrity in combination with western blots indicates a posttranslational modulation of EGFP - Sp3. To confirm the hypothesis of proteasomal degradation of EGFP - Sp3, transfected cells were treated with the reversible proteasome inhibitor MG132. In the presence of 1µM MG132 the fusion protein could be stabilized. Taken together, the data presented here identified the human Sp3 - CTD as a new substrate for the 26S proteasome. Only SUMOylation of wild type human Sp3 within the inhibitory domain (ID) has been described so far. Initial EMSA experiments showed that purified MBP - ZFD fusion proteins were functional in terms of interacting with dsDNA containing the specific sequence motiv. However, all proteins bound to unspecific dsDNA as well. Therefore MBP - Sp1 was subjected to BIAcore analysis to determine the rate constants for association ka, dissociation kd and the dissociation constant Kd of the GC - Box - Protein complex as well as mutants of the GC - Box. The determined Kd (4 × 10 - 9 M) for MBP - Sp1 associated with GC - box or its derivatives were found to be comparable with the Kd of native Sp1, however the rate constants were reduced 2 fold in presence of the modified GC - boxes. EMSA experiments with MBP - gyrA revealed functionality and a clear preference for specific dsDNA in the presence of unspecific human genomic DNA (gDNA). After preliminary functional characterization, MBP fusion proteins were immobilized by physical adsorption, covalent or by affinity on various solid substrates or nanoscaled magnetic beads to implement the concept of direct detection of dsDNA or specific enrichment of bacterial DNA, respectively. MBP - Sp1 remains functional after adsorptive or covalent immobilization on different chemical modified glas surfaces. 9×Lys - MBP - Sp1 shows significantly reduced functionality after immobilization on the same glas substrates by similar strategies. Moreover, a simple NAD - assay with adsorptive immobilized MBP - Sp1 on polystyrene in microtiter format was established for direct detection of GC - boxes within PCR - products from S. aureus gDNA. By using the assay, specific PCR - products could be detected in presence up to 100 - fold excess of human gDNA in relation to 10 ng bacterial DNA. Separation of bacterial DNA from human DNA from clinical samples may have an important impact on downstream applications, involving NAD assays. To address this often underestimated technical problem, a new functional protein MBP - gyrA was introduced to overcome some limitations of already established methods. MBP - gyrA was site - directed coupled on nanoscaled magnetic beads by affinity. This system enabled the fast and specific separation of gDNA of E. coli or S.aureus from a huge background of human gDNA. The combination of MBP - gyrA - based magnetic separation with NAD assays could significantly increase the sensitivity and shorten the time for initiation of effective treatment.

A specific double-stranded DNA sensing system is of great interest for diagnostic and other biomedical applications. Zinc finger domains, which recognize double-stranded DNA, can be engineered to form custom DNA-binding proteins for recognition of specific DNA sequences. As a proof of concept, a sequence-enabled reassembly of TEM-1 β- lactamase system (SEER-LAC) was previously demonstrated to develop zinc finger protein (ZFP) arrays for the detection of a double-stranded bacterial DNA sequence. Here, we implemented the SEER-LAC system to demonstrate the direct detection of pathogenspecific DNA sequences present in E. coli O157:H7 on the lab-on-a chip. ZFPs customdesigned to detect shiga toxin in E. coli O157:H7 were immobilized on the cyclic olefin copolymer (COC) chip, which can function as a non-PCR based molecular diagnostic. Pathogen-specific double-stranded DNA was directly detected by engineered ZFPs immobilized on the COC chip, providing a detection limit of 10 fmole of target DNA in colorimetric assay. Therefore, in this study, we demonstrated a great potential of ZFP arrays on the COC chip for further development of a simple and novel lab-on-a chip technology for detection of pathogens. Antibiotic resistance is a serious, and rapidly growing global threat. Here, we designed a novel screening method to detect antibiotic resistance genes (ARGs) in bacteria using a graphene oxide-based biosensor utilizing engineered ZFPs. Two-dimensional graphene oxide (GO) sheet possesses unique electronic, thermal, and mechanical properties. The quenching ability of GO can create novel methods for detection of biomolecules. Our approach utilizes quenching of fluorescence signal by GO in the absence of target ARGs, but restoring the signal in the presence of target ARGs. Quantum dot (QD)- labeled ZFP can bind to GO via stacking interactions of aromatic and hydrophobic residues in conjunction with hydrogen bonding interaction between hydroxyl or carboxyl groups of GO and hydroxyl or amine groups of the protein. Due to fluorescence resonance energy transfer (FRET) between QD and GO when they are in close proximity, fluorescence signal of QD-labeled ZFP is expected to be quenched. In the presence of target DNA, the bound DNA-protein complex is released from GO, restoring the fluorescence signal.