La sénescence est un état d’arrêt prolifératif mis en place par les cellules en réponse à des dommages à l’ADN. Elle est considérée comme un mécanisme de protection qui s’oppose à l’initiation et au développement d’un cancer. Or, les mécanismes de sénescence et la capacité des cellules à s’échapper de cet état et à générer des cellules transformées semblent varier selon les types cellulaires. Chez les kératinocytes humains normaux de peau (NHEKs), la sénescence est transitoire et débouche pour la plupart des cellules sur une mort par autophagie et, pour environ une sur dix mille, sur une émergence néoplasique post-sénescence. Les cellules émergentes présentent des caractères de transformation et accumulent des mutations et des délétions. Cet échappement néoplasique de la sénescence n’est jamais observé dans les fibroblastes normaux de peau (NHDFs) qui, au contraire, une fois en sénescence sont bloqués irréversiblement dans le cycle cellulaire.J’ai participé dans un premier temps à l’étude du rôle de l’autophagie dans la balance échappement néoplasique et mort des NHEKs sénescents. Nous avons pu démontrer que les progéniteurs de cellules néoplasiques ont une activité autophagique modérée plus faible que ceux qui subissent la mort. Ainsi, ils échappent à la mort par autophagie tout en gardant un niveau d’activité autophagique de ménage suffisant pour éliminer leurs composés altérés par le stress oxydant et être capable de ré-entrer en mitose.J’ai ensuite cherché à caractériser les dommages oxydants mutagènes impliqués dans l’échappement néoplasique. Ma stratégie a été d’analyser de façon comparative les NHEKs par rapport aux NHDFs, puisque les uns mais non les autres développent une émergence néoplasique. J’ai ainsi pu constater que le taux de cassures augmente à la sénescence dans les deux types cellulaires, mais que ces cassures sont de nature différente, uniquement des SSBs (Single Strand Breaks) pour les NHEKs et principalement des DSBs (Double Strand Breaks) pour les NHDFs. L’accumulation de DSBs à la sénescence des NHDFs s’accompagne d’une induction robuste de la voie DDR (DNA Damage Response), d’une activation la voie p53-p21 et d’un arrêt stable dans le cycle cellulaire. Dans le cas des NHEKs, l’augmentation du taux de SSBs est la conséquence de l’augmentation du niveau de stress oxydant et de la perte de l’expression et de l’activité de la PARP1. Ceci contribue à une agglomération aberrante de XRCC1 au niveau des cassures engendrant une induction de la voie p38MAPK - p16INK4a et un arrêt dans le cycle cellulaire caractéristique de la sénescence. D’une manière paradoxale, l’échappement néoplasique de la sénescence dépend également de cette accumulation de SSBs non réparés. Ainsi, la nature des dommages à l’ADN influence le devenir des cellules sénescentes. Les DSBs renforcent la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire alors que les SSBs promeuvent l’acquisition de mutations et l’échappement néoplasique. / Senescence is a permanent cell-cycle arrest activated in response to DNA damage. If a cell escapes from this state, it should inherit mutations and could potentially initiate a tumor. NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) display a classical irreversible and stable senescence plateau. In contrast, senescent NHEKs (Normal Human Epidermal Keratinocytes) experience two different outcomes. Most of them undergo autophagic cell death and about one on 10000 spontaneously resumes mitosis and generates clones of transformed, mutated and tumorigenic cells.I contributed in a first time to studying the role of macroautophagy in the cell death / post-senescence neoplastic emergence balance of senescent NHEKs. We have shown that macroautophagy plays antagonistic roles during senescence, inducing cell death or promoting neoplastic transformation, depending on its level of activation. Indeed, the progenitors of post-senescent emergent cells display oxidative stress and autophagic activity levels slightly lower than the average, what allows them to avoid autophagic cell death and to ensure the quality control indispensable for mitosis re-entry.Since oxidative stress is the motor of the post-senescence neoplastic emergence in NHEKs, I wondered next whether oxidative stress could operate through the generation of some mutagenic DNA damage. I took advantage of the comparison of senescent NHEKs to NHDFs. I have shown that unlike NHDFs, NHEKs do not suffer from significantly shortened telomeres, nor accumulate DSBs, do not activate a DDR (DNA Damage Response) pathway and in consequence do not significantly activate the p53/p21 pathway. Instead, they suffer from a decrease in PARP1 expression, which compromises the repair of SSBs generated by oxidative stress. In consequence, SSBR foci, precisely XRCC1 foci, become persistent. These persistent foci initiate a signalization, through p38MAPK, which leads to up-regulation of p16INK4A and to cell cycle arrest. Notably, the accumulation of unrepaired SSBs is sufficient for the post-senescence neoplastic emergence phenomenon, in addition, paradoxically to its involvement in the onset of senescence.In conclusion, senescence results from the persistence of a DNA damage signalization, but the exact nature of the damages could vary in different cell types depending on their repair capacities and could dictate completely different outcomes. Namely, persistent DSBs, including telomeric ones, dictate a permanent tumor-suppressor cell cycle arrest, whereas persistent SSBs are permissive to mutation and senescence evasion.

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancérogène pour l’homme, qui contamine toutes les sphères de notre environnement. Son métabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) est considéré comme son cancérogène ultime. Le BPDE se lie à l’ADN, formant des adduits qui doivent être réparés et qui seraient responsables des dommages à l’ADN et de la cancérogenèse induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages à l’ADN (bris simple-brin [BSB] à l’ADN, aberrations chromosomiques [AC], échanges entre chromatides-sœurs [ÉCS] et micronoyaux [MN]) ont été mesurés dans les lymphocytes humains exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en santé. Suite à l’exposition au BaP, le niveau d’adduits BPDE-ADN et la fréquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus élevées de BaP testées, suggérant une induction du métabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des ÉCS, nous obtenons une courbe dose-réponse linéaire, indiquant la production d’un autre type de lésions devant être réparées par le système de réparation par recombinaison homologue. Ces lésions pourraient être des bris à l’ADN ou des bases oxydées (8-OH-dG), ce qui est suggéré par l’analyse des corrélations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-réponse des hommes et des femmes montre que des différences existent entre les sexes. Ainsi, les ÉCS, les AC et les MN sont significativement augmentés chez les hommes à la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique présente, est non significative. Des différences interindividuelles sont également observées et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les ÉCS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectuées ont permis d’établir que quatre facteurs (niveau d’exposition au BaP, adduits BPDE-ADN, fréquence des AC et nombre de MN par cellule micronucléée) expliquent jusqu’à 59 % de la variabilité observée dans le test des ÉCS, alors qu’aucun facteur significatif n’a pu être identifié dans le test des AC et des MN. L’analyse du mécanisme de formation de nos biomarqueurs précoces permet de suggérer que les bris à l’ADN et les bases oxydées devraient être classées comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs d’exposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, étant donné qu’ils causent la formation des biomarqueurs de génotoxicité (ÉCS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer l’action clastogénique du BaP en plus de mettre en évidence des effets aneugènes affectant surtout la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugènes, reliés à l’étape de progression dans la cancérogenèse, pourraient être particulièrement importants puisque l’exposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs années, voire des décennies. La compréhension des mécanismes régissant la formation des biomarqueurs étudiés dans cette étude, ainsi que des relations existant entre eux, peut être appliquée à de nombreux contaminants connus et émergents de notre environnement et contribuer à en évaluer le mode d’action. / Benzo-a-pyrene (BaP) is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) classified as carcinogenic to human, and is present throughout our environment. Metabolic activation of BaP leads to production of BaP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE), considered as its ultimate carcinogenic metabolite. BPDE can bind to DNA, forming BPDE-DNA adducts at the origin of BaP-induced DNA damage and carcinogenesis. BPDE-DNA adducts and DNA damages (DNA single-strand breaks [SSBs], chromosomal aberrations [CAs], sister chromatid exchanges [SCEs] and micronuclei [MNs]) are measured in human lymphocytes exposed to low BaP concentrations, taken from non-smoking healthy young subjects. Following BaP exposure, BPDE-DNA adduct levels, as well as CA and MN frequencies raise significantly, and then decrease to the higher BaP concentrations tested, suggesting metabolic enzyme saturation or induction of BaP phase II metabolism. As for SCEs test, a linear dose response curve is obtained, suggesting that production of additional DNA lesions requiring homologous recombination repair may occur. These lesions could be DNA breaks or oxidized DNA bases (8-OH-dG), as indicated by correlation analysis performed between our biomarkers. Additionally, when comparing the dose-response curves for men and women separately, some differences show up. Indeed, SCEs, CAs, and MNs are significantly increased in men at the lowest BaP concentration tested, while in women, this increase is present but not significant. Interindividual differences are also present and are more considerable for BPDE-DNA adducts, MNs and CAs, whereas they are very low for SCEs. Statistical analysis showed that four factors (BaP exposure level, BPDE-DNA adducts, CA frequency and number of MN per micronucleated cell) significantly explained up to 59 % of observed variability in SCE test, while no such factors could explain the observed variability in CA and MN test. Following analysis of mechanisms underlying the formation of early biomarkers, we suggest a modification of the Exposure-Disease Continuum of BaP. We propose that DNA breaks and oxidized DNA bases should be classified as biomarkers of biologically effective dose (part of the exposure biomarkers), as their presence are at origin of early biomarkers of genotoxicity (SCEs, CAs and MNs). On the other hand, CA and MN tests confirmed clastogenic properties of BaP, and highlighted aneugenic effects influencing mostly chromosome segregation during cell division. These aneugenic effects, linked to the progression step of carcinogenesis, could be of particular importance given that exposure to BaP and other PAHs (smoking, occupational exposure) are chronic and may last for decades. Understanding the mechanisms playing a role in early biomarkers formation, as well as the relations existing between them, can be largely applied in our environment to many known and emerging contaminants, thus contributing to characterize their mode of action.

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancérogène pour l’homme, qui contamine toutes les sphères de notre environnement. Son métabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) est considéré comme son cancérogène ultime. Le BPDE se lie à l’ADN, formant des adduits qui doivent être réparés et qui seraient responsables des dommages à l’ADN et de la cancérogenèse induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages à l’ADN (bris simple-brin [BSB] à l’ADN, aberrations chromosomiques [AC], échanges entre chromatides-sœurs [ÉCS] et micronoyaux [MN]) ont été mesurés dans les lymphocytes humains exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en santé. Suite à l’exposition au BaP, le niveau d’adduits BPDE-ADN et la fréquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus élevées de BaP testées, suggérant une induction du métabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des ÉCS, nous obtenons une courbe dose-réponse linéaire, indiquant la production d’un autre type de lésions devant être réparées par le système de réparation par recombinaison homologue. Ces lésions pourraient être des bris à l’ADN ou des bases oxydées (8-OH-dG), ce qui est suggéré par l’analyse des corrélations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-réponse des hommes et des femmes montre que des différences existent entre les sexes. Ainsi, les ÉCS, les AC et les MN sont significativement augmentés chez les hommes à la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique présente, est non significative. Des différences interindividuelles sont également observées et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les ÉCS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectuées ont permis d’établir que quatre facteurs (niveau d’exposition au BaP, adduits BPDE-ADN, fréquence des AC et nombre de MN par cellule micronucléée) expliquent jusqu’à 59 % de la variabilité observée dans le test des ÉCS, alors qu’aucun facteur significatif n’a pu être identifié dans le test des AC et des MN. L’analyse du mécanisme de formation de nos biomarqueurs précoces permet de suggérer que les bris à l’ADN et les bases oxydées devraient être classées comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs d’exposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, étant donné qu’ils causent la formation des biomarqueurs de génotoxicité (ÉCS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer l’action clastogénique du BaP en plus de mettre en évidence des effets aneugènes affectant surtout la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugènes, reliés à l’étape de progression dans la cancérogenèse, pourraient être particulièrement importants puisque l’exposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs années, voire des décennies. La compréhension des mécanismes régissant la formation des biomarqueurs étudiés dans cette étude, ainsi que des relations existant entre eux, peut être appliquée à de nombreux contaminants connus et émergents de notre environnement et contribuer à en évaluer le mode d’action. / Benzo-a-pyrene (BaP) is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) classified as carcinogenic to human, and is present throughout our environment. Metabolic activation of BaP leads to production of BaP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE), considered as its ultimate carcinogenic metabolite. BPDE can bind to DNA, forming BPDE-DNA adducts at the origin of BaP-induced DNA damage and carcinogenesis. BPDE-DNA adducts and DNA damages (DNA single-strand breaks [SSBs], chromosomal aberrations [CAs], sister chromatid exchanges [SCEs] and micronuclei [MNs]) are measured in human lymphocytes exposed to low BaP concentrations, taken from non-smoking healthy young subjects. Following BaP exposure, BPDE-DNA adduct levels, as well as CA and MN frequencies raise significantly, and then decrease to the higher BaP concentrations tested, suggesting metabolic enzyme saturation or induction of BaP phase II metabolism. As for SCEs test, a linear dose response curve is obtained, suggesting that production of additional DNA lesions requiring homologous recombination repair may occur. These lesions could be DNA breaks or oxidized DNA bases (8-OH-dG), as indicated by correlation analysis performed between our biomarkers. Additionally, when comparing the dose-response curves for men and women separately, some differences show up. Indeed, SCEs, CAs, and MNs are significantly increased in men at the lowest BaP concentration tested, while in women, this increase is present but not significant. Interindividual differences are also present and are more considerable for BPDE-DNA adducts, MNs and CAs, whereas they are very low for SCEs. Statistical analysis showed that four factors (BaP exposure level, BPDE-DNA adducts, CA frequency and number of MN per micronucleated cell) significantly explained up to 59 % of observed variability in SCE test, while no such factors could explain the observed variability in CA and MN test. Following analysis of mechanisms underlying the formation of early biomarkers, we suggest a modification of the Exposure-Disease Continuum of BaP. We propose that DNA breaks and oxidized DNA bases should be classified as biomarkers of biologically effective dose (part of the exposure biomarkers), as their presence are at origin of early biomarkers of genotoxicity (SCEs, CAs and MNs). On the other hand, CA and MN tests confirmed clastogenic properties of BaP, and highlighted aneugenic effects influencing mostly chromosome segregation during cell division. These aneugenic effects, linked to the progression step of carcinogenesis, could be of particular importance given that exposure to BaP and other PAHs (smoking, occupational exposure) are chronic and may last for decades. Understanding the mechanisms playing a role in early biomarkers formation, as well as the relations existing between them, can be largely applied in our environment to many known and emerging contaminants, thus contributing to characterize their mode of action.