O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

Syftet med arbetet har varit att studera hemtagningen av varor ifrån Asien till Sverige, och ta fram olika förbättringsförslag på hur importföretag inom klädindustrin kan minska lagerhållna volymer samt genomflöde i sina centrallager. Detta har gjorts med hjälp av ett textilföretag i, Borås, som tillverkar och importera alla sina produkter ifrån Asien. Textilföretaget vill vara anonyma, därför har författaren av rapporten valt att kalla det för Företag X. Företag X omsätter cirka 500 miljoner, och i dagsläget mellanlandar allt gods i deras centrallagret i Borås. Delar av godset är redan vid produktion öronmärkt till specifik återförsäljare, därför har författaren valt att koncentrera sig på just dessa flöden i rapporten för att avgränsa arbetet något. Rapportens syfte är med andra ord att ta fram olika scenarier som visar på hur detta gods kan levereras direkt ut till respektive återförsäljare, utan att behöva ta omvägen via Borås.För att hitta för- och nackdelar med de olika scenarier gjordes det inledningsvis en litteraturstudie för att skapa en gedigen informationsgrund att utgå ifrån. Sedan genomfördes ett flertal studiebesök och semistrukturerade intervjuer med inblandade parter i försörjningskedjan. Respondenterna var många och från flera olika företag och positioner, allt för att få resultatet så gynnsamt som möjligt för alla inblandade.Analysen visar på tre olika scenarier, utifrån Företag X’s förutsättningar och arbetets avgränsningar, som alla bidrar till att Företag X kan minska sina lagerhållna volymer samt genomflöde i sitt centrallager.Scenario 1 innebär att återförsäljaren tar över ansvaret av godset redan i en hub i Asien. Godset sorteras ut till respektive återförsäljare redan i fabriken alternativt i en hub/terminal i Asien, innan återförsäljaren möter upp och tar över ansvaret vid hubben. Det är då upp till återförsäljaren hur den vill frakta godset från Asien till Sverige, och Företag X släpper där med allt ansvar. Detta scenario innebär att försörjningskedjan är kort och kostnadsfokuserad och Företag X kommer kunna minska de kostnader som uppstår kring frakt och hemtagning av godset.Scenario 2 innebär att återförsäljaren tar över ansvaret för godset vid en terminal/hub i Göteborg. Godset har då cross-dockats (sorterats upp till respektive återförsäljare) antingen i en hub/terminal i Asien eller så görs det i terminalen/hubben i Göteborg. Från hubben i Göteborg är det sedan återförsäljarens ansvar att sköta frakten till sitt eget lager.Scenario 3 är likvärdigt hur det ser ut för Företag X idag, att återförsäljaren tar över ansvaret för godset först när det anlänt till deras lastbrygga. Skillnaden är dock att det gods som redan är öronmärkt till återförsäljare inte mellanlandar i centrallagret i Borås. Istället cross-dockas godset i en hub i Asien, alternativt i en hub i Göteborg.Författaren anser dock att Företag X själva ska göra en djupare efterforskning innan ett scenario eventuellt implementeras, då författaren av rapporten inte hade tillgång till all inköp- och försäljningsdata.vEn slutsats som har dragits och som presenteras i resultatet är att scenario 3 bör vara mest gynnsamt för Företag X i dagsläget och även på lång sikt. De behåller då maximal kontroll av leveransen, vilket innebär att pris- och tillverkningsinformation inte riskerar att hamna i fel händer, vilket skulle kunna resultera i kundbortfall och nya starka konkurrenter. / The purpose of this report was to study the imports of goods from Asia to Sweden, and to present improvements on how companies in the textile industry can reduce their inventory volumes and goods flow in their central warehouse. The study has been done with a little help from a textile company in Borås, which manufactures and imports all their products from Asia. The textile company wants to be anonymous, therefore the author of this report has chosen to entitle it as Company X. Company X has a turnover of approximately 500 million SEK, and they currently interlining all their goods in their central warehouse in Borås. Parts of the goods are already earmarked for specific retailers, therefore the author has chosen to concentrate on these flows only, to delimit the work a bit. In other words, the purpose of the report is to provide different scenarios that show how the goods can be delivered directly to their retailers, without having to take the route through Borås.In order to find the pros and cons of the different scenarios, a literature study was initially made to create a solid information base. Then several visits at Company X and semi structured interviews were conducted with different stakeholders in the supply chain. There were several respondents from different companies and positions, all to make the results of the study as beneficial as possible for all involved.The analysis shows three different scenarios, based on Company X's prerequisites and work delimitations, which all contributes to a reduce of Company X stored volumes and goods flow in its central warehouse.Scenario 1: The retailer takes over the responsibility of the goods already in a hub in Asia. The goods are sorted out to respective retailer already in the factory or in a hub/terminal in Asia, before the retailer meets up and take over the responsibility of the goods at the hub. Then it is up to the retailer how they want to ship the goods from Asia to Sweden, and at that time Company X releases all the responsibility. This scenario means that the supply chain is short and cost-focused, and Company X will be able to reduce their costs that arise from shipping the goods.Scenario 2: The retailer takes over the responsibility for the goods at a terminal/hub in Gothenburg. Before that, the goods have been cross-docked (sorted out to respective retailers) either in a hub/terminal in Asia or in the terminal/hub in Gothenburg. From the hub in Gothenburg it is the retailer’s responsibility to handle the freight to their own warehouse.Scenario 3: Is equivalent to what it looks like for Company X today, where the retailer takes over the responsibility for the goods when it arrives at their own warehouse. The difference is that the goods do not pass at the central warehouse in Borås. Instead, the goods are cross-docked in a hub in Asia, alternatively in a hub in Gothenburg, before it delivers to the retailers.The author of this report believes that Company X must do a deeper investigation before a scenario may be implemented, as the author of the report did not have access to all purchase- and sales data.viiOne conclusion that has been drawn is that scenario 3 should be most favourable to Company X both at the present and at a long term. They retain the maximum control of delivery, which means that information about price and manufacturing does not end up in wrong hands, which could lead to a loss of customer and new stong competitors.

Neste trabalho são apresentados os resultados das determinações cristalinas, estruturais e supramoleculares, por difração de raio X, bem como os estudos de \"docking\" , de oito compostos derivados da 1,4-quinona. As estruturas resolvidas e refinadas mostraram a existência de ligações de hidrogênio, não convencionais intra e intermoleculares. Estas últimas permitiram entender o empacotamento cristalino em cada composto. Os resultados cristalográficos foram comparados com aqueles encontrados na literatura. Mas as estruturas correspondentes aos compostos AC1 (6,7-bis-fenilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diona) e AC6 (6,7-bis-metilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diol) possuem esqueletos químicos ainda não descritos na cristalografia. Os estudos de \"docking\" foram realizados utilizando as conformações cristalográficas dos oito compostos e da estrutura cristalográfica da tripanotiona redutase, uma proteína, dimérica, envolvida no sistema anti-stress oxidativo no Tripanosoma cruzi, parasita responsável pela enfermidade de Chagas. Foram, então, gerados complexos proteína-ligante no sítio da interface entre monômeros. Os complexos resultantes foram agrupados de acordo com orientações preferenciais e em cada grupo, a estrutura com menor energia total foi selecionada como representante do conjunto e analisado em tela gráfica. Para cada uma das moléculas foram realizados estudos detalhados das suas interações com todos os aminoácidos que as rodeavam. Finalmente, levando em conta as energias envolvidas e as interações foi possível escolher aquela que mostra o melhor encaixe. Dentre todas as moléculas, a AC8 [4a,8a-Dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-metano-naftaleno-5,8,-diona] foi considerada como a mais promissora, a qual apresentou melhores resultados, um maior número de interações favoráveis com menor energia. / In this work the results of the crystal structure and supramolecular determination by X-ray diffraction together with docking studies, of eight compounds derived from 1,4-quinone, are presented. The solved and refined structures showed the existence of non-conventional hydrogen bonds, intra and inter-molecular. These last ones gave an insight about the crystal packing in each compound. The crystallographic results have been compared with those found in the literature. It should pointed out that structures of compounds AC1 (6,7-bis-phenylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methano-naphthalene-5,8-dione) and AC6 (6,7-bis-methylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methane-naphthalene-5,8-diol) have chemical skeletons which were not described before in crystallography. The docking studies have been carried out using the crystallographic conformations of the eight compounds and the crystallographic structure of trypanothione reductase, a dimmeric protein, involved in the anti-stress oxidative system of the Trypanosoma cruzi, the parasite responsible for the Chagas disease. The compounds were docked in the dimmer interface, which is the most likely binding site. The resulting complexes have been clustered together according with their orientation and of each group the one with the lowest total energy was chosen as representative of the cluster and analyzed in graphical screen. Thus, for that complex a detailed study of its interactions with all the neighbor amino acids was done. Finally, taking in account the energies and the interactions it was possible to choose the one that showed the best docking result. Amongst all molecules, the AC8 [4a,8a-dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-methane-naftaleno-5,8,-diona] was considered as the most promising, which presented better results, a bigger number of favorable interactions with lesser energy.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3640.pdf: 5869617 bytes, checksum: 4643e7ab6ff128afd74bd3d51d8588f3 (MD5) Previous issue date: 2011-03-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / This study, based on molecular docking, describes the search for the most favorable conformations when complexes between herbicides, used in soybean cultivation, and an enzyme involved in the detoxification process are formed and based on these results some guidelines for the developing of new compounds are proposed. The glutathione transferase Tau, GmGSTU4-4, from soybean was the target protein, and diclofop, fluazifop, Clethodim, clomazone, diquat, paraquat, atrazine, diuron, bentazone, acifluorofem, fomesafem, sulfentrazone, glyphosate and clorimurom, the 14 herbicides studied. These last ones were chosen based on the list of those that are used in soybean crops and are registered with the Ministry of Agriculture and Supply of Brasil. For all of them the GmGSTU4-4-herbicide complexes were obtained. The protein binding site, analyzed by molecular visualization, presents an almost cylindrical shape, open and exposed to the solvent and is composed of two sites G and H. Three water molecules were observed in the G-site in that participate in molecular interactions with several of the studied herbicides, This finding suggests that new compounds that could, and should, be developed need to have in their structure chemical groups capable of interacting with the water, both as donors and acceptors of hydrogen bonds. Another interesting finding was that the largest herbicides may occupy both the G and H sites, and seem to be most promising in the activity of detoxification. / Este estudo, baseado em docking molecular, descreve a busca das conformações mais favoráveis para a formação dos complexos alvo-ligante com herbicidas utilizados no cultivo de soja e uma enzima envolvida no processo de desintoxicação, e baseado nestes resultados são propostas algumas diretrizes para o desenvolvimento de novos compostos. A proteína estudada foi a glutationa transferase Tau de soja, a GmGSTU4-4. Foram estudados 14 herbicidas: diclofope, fluazifope, cletodim, clomazona, diquate, paraquate, atrazina, diurom, bentazona, acifluorofem, fomesafem, sulfentrazona, clorimurom e glifosato. A escolha dos herbicidas se baseou na lista daqueles que são utilizados na cultura da soja e estão registrados no Ministério da Agricultura e Abastecimento do Brasil. Foram obtidos os complexos GmGSTU4-4-herbicidas. O sítio de ligação analisado por visualização molecular mostra uma forma quase cilíndrica, aberta e exposta ao solvente e composto de dois sítios G e H. No sítio G foram observadas três moléculas de água que participam de interações moleculares com vários dos herbicidas estudados o que sugere que novos compostos poderiam ser desenvolvidos observando a necessidade da presença de grupos químicos capazes de interagir com a água, tanto como doadores como aceptores de ligações de hidrogênio. Os herbicidas maiores podem ocupar os sítio G e H e parecem ser mais promissores na atividade de desintoxicação.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3649.pdf: 6160139 bytes, checksum: e2fc962eefef9b03fa83e0311a505531 (MD5) Previous issue date: 2010-11-23 / Financiadora de Estudos e Projetos / In this research molecular docking was used to study enzime-ligand complexes of Cyclooxygenase 1 (COX-1) and Cyclooxygenase 2 (COX-2) with pyrimidine derivatives, aiming at understanding the possible mechanisms of action of these compounds and, thus, suggest modifications that could increase their specificity. The chosen ligands were a series of 25 substituted pyrimidines with known activity. The three-dimensional structures of these compounds were obtained by molecular modeling and that of the enzymes from the PDB and PDBSum under the codes 2OYE and 1CX2 for COX-1 and COX-2 respectively. The binding sites chosen for the docking studies were 20 Å around the crystallographic ligands IM8-700 (2OYE) and SC-558 (1CX2). In the COX-1 formed complexes the SO2Me moiety is positioned in such a way as to form hydrogen bonds with Ile517 and Phe518. The benzo[b]thiophen-2-ylmethyl-[2-(4-methanesulfonylphenyl)-6-trifluoromethylpyrimidin-4- yl]amine formed the most favorable complex with COX-1. In COX-2, the enzyme-ligand interaction pattern shows the SO2Me group in the side pocket, forming hydrogen bonds with His90 and Arg513 and the different substituent groups of the pyrimidine ring form hydrogen bonds with Arg120 and Tyr355. The presence of a small lipophilic pocket in COX-2 and the docking results suggest that the ligands 2, 15, 17, 22 and 23 may have their activity enhanced by the addition of a hydrophobic group on the phenyl or thiophenyl rings so this group can interact within this pocket. In both cases the mechanism of inhibition is probably competitive. As the search for new anti-inflammatory drugs must deal with a subtle balance of COX-2 and COX-1 inhibitions, the ligands 2 and 22 that showed better results for COX-2 rather than for COX-1 would be the most promising ones and therefore, those that should be tested in vivo. / Neste trabalho, o docking molecular foi utilizado para o estudo da formação de complexos alvoligante das enzimas Ciclooxigenase 1 (COX-1) e Ciclooxigenase 2 (COX-2) com derivados pirimidínicos, com a finalidade de entender os possíveis mecanismos de ação e, assim, propor modificações nos compostos visando diminuir prováveis efeitos colaterais. Os ligantes escolhidos foram uma série de 25 pirimidinas substituídas com atividade conhecida. As estruturas tridimensionais destas moléculas foram obtidas por modelagem molecular e as das enzimas dos bancos de dados PDB e PDBSum sob o código 2OYE e 1CX2 para COX-1 e COX- 2 respectivamente. Os sítios de ligação escolhidos para os cálculos de docking foram de 20 Å ao redor dos ligantes cristalográficos IM8-700 (2OYE) e SC-558 (1CX2). Das pirimidinas analisadas as que formaram complexo com a COX-1 se orientaram com a porção SO2Me formando ligações de hidrogênio com a Ile517 e Phe518. Sendo o benzo[b]tiofen-2-ilmetil-2-(4- metanosulfonilfenil)-6-trifluorometilpirimidina-4-il]amina o mais favorável para a formação de complexo com a COX-1. Para a COX-2, os compostos que se ligaram mostram um padrão que inclui ligações de hidrogênio entre a porção SO2Me e a His90 e Arg513 do bolso lateral e entre a Arg120 e Tyr355 com os grupos substituintes do anel pirimidínico. A presença de um pequeno bolso lipofílico na COX-2 e os resultados de docking permitem sugerir que os ligantes 2, 15, 17, 22 e 23 poderiam mostrar melhor atividade mediante a adição de um grupo hidrofóbico no anel fenila ou tiofenila para que este grupo se posicione dentro desse bolso. Em ambos os casos o tipo de inibição provável é o competitivo. Como a busca por novos fármacos antiinflamatórios deve lidar com um equilíbrio entre a inibição de COX-2 e COX-1, os ligantes 2 e 22 que apresentaram resultados favoráveis para a COX-2 e não tanto para a COX-1 seriam os mais promissores e, portanto, aqueles que poderiam ser testados in vivo.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6068.pdf: 11514210 bytes, checksum: 8c9214a7a0368fd3be3320eb3e04318d (MD5) Previous issue date: 2013-08-13 / The non steroidal anti-inflammatory drugs have been known for over 100 years and has been widely used by mankind. However cause adverse effects, since gastrointestinal complications to cardiac diseases many of these symptoms related to its nonspecific action in biological systems. Thus, the proposal of a drug delivery system for loading these drugs to the site of inflammation, could reduce these unwanted effects in the body due to the limitation of more targeted effects beyond its site of action.In this study, the graphene and graphite plates were used as carriers, since studies demonstrate the usefulness of other conformational structures of carbon as drug carriers for the treatment of cancer, for example. Two models were studied for the plates by softwares of molecular docking: template sandwich, which comprises two carbon plates, with ligant between them, and the model surfing with one carbon plate comprising the ligant. The compounds were obtained from data banks, such as CSD, PDB and SD, the plates were obtained by molecular modeling. The analysis of intermolecular interactions, essential knowledge for understanding the structures obtained was done using molecular imaging with high resolution. The experimental results showed that the in silico model sandwich was the most favorable for this system, providing stability and protection for the ligand that this does not become detached from the plates during the path taken in the body to the desired location. / Os anti-inflamatórios não esteroidais são conhecidos há mais de 100 anos e vem sendo amplamente utilizados pela humanidade. No entanto, causam efeitos adversos, desde problemas gastrointestinais até complicações cardíacas, muitos desses sintomas relacionados com sua ação inespecífica nos sistemas biológicos. Dessa forma, a proposta de um sistema de drug delivery para o carreamento desses fármacos até o local da inflamação, poderia reduzir esses efeitos indesejados no organismo devido a limitação de alvos mais específicos além do seu local de ação. No presente estudo, foram utilizadas placas de grafeno e grafite como carreadores, uma vez que estudos demonstram a utilidade de outras estruturas conformacionais do carbono como carreadores de fármaco para o tratamento de câncer, por exemplo. Foram estudados dois modelos para as placas por meio de software de docking molecular: modelo sandwich, o qual engloba duas placas de carbono, com os ligantes entre elas, e o modelo surf, com uma placa de carbono comportando o ligante. Os compostos estudados foram obtidos dos bancos de dados como CSD, SD e PDB e as placas foram obtidas por modelagem molecular. A análise das interações intermoleculares, conhecimento essencial para o entendimento das estruturas obtidas, foi feita utilizando visualização molecular de alta resolução. Os resultados dos experimentos in silico mostraram que o modelo sandwich foi o mais favorável para esse sistema, posto que confere estabilidade e proteção ao ligante para que este não se desprenda das placas durante o caminho percorrido pelo organismo até o local desejado.

O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-07-29T17:57:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) MMR-TESE.pdf: 16044503 bytes, checksum: 1c3b4963930b3b75a91e718bd1893e50 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T17:57:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) MMR-TESE.pdf: 16044503 bytes, checksum: 1c3b4963930b3b75a91e718bd1893e50 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Facepe / Este trabalho apresenta uma metodologia in silico para o estudo de complexos de inclus o utilizados na inova o terap utica. Um complexo de inclus o formado por um host (hospedeiro), e por um guest (h spede). Neste trabalho, o host estudado a ciclodextrina (e seus derivados) e o guest, um ligante (f rmaco, em potencial), formando o complexo host:guest. O objetivo desse projeto desenvolver uma plataforma (CycloMolder) capaz de realizar estudos in silico dos complexos de inclus o de forma autom tica e precisa, fazendo uso de uma interface gr fica de usu rio. Esse objetivo foi tra ado para facilitar os estudos de modelagem molecular para este tipo de sistema qu mico, com interesse farmac utico. A plataforma composta por dois m dulos: CycloGen e CycloDock. O primeiro m dulo (CycloGen) constr i modelos com mais de uma estrutura para representar um derivado de ciclodextrina. O segundo m dulo (CycloDock) realiza o c lculo de docking molecular entre as mol culas host e guest, utilizando o programa Autodock Vina e apresenta os resultados obtidos, incluindo gr ficos que mostram a distribui o energ tica e as intera es intermoleculares do complexo. O programa CycloMolder foi testado atrav s de estudos de casos inspirados em problemas farmac uticos reais. Os testes realizados destacaram a import ncia da gera o de mais de uma configura o para representar significativamente um derivado de ciclodextrina, e tamb m mostrou o potencial anal tico do programa, proporcionado pela automa o do estudo de modelagem, execu o dos c lculos e an lise dos resultados. De forma geral, o programa CycloMolder atinge seus objetivos, automatizando e simplificando os estudos in silico dos complexos de inclus o, contribuindo desta forma para a inova o terap utica. / This work presents an in silico methodology for study of inclusion complexes used in therapeutic innovation. An inclusion complex is formed by a host and a guest. In this work, the host is the cyclodextrin and their derivatives and the guest is a potential drug, forming a host:guest complex. The goal of this work is to development a platform (CycloMolder) able to perform in silico studies of inclusion complexes in an automated and precise fashion, making use of a graphical user interface. The platform (CycloMolder) consists of two modules: CycloGen and CycloDock. The first module (CycloGen) builds models with more than one chemical structure to represent a cyclodextrin derivative. The second module (CycloDock) performs the molecular docking calculations between the host and guest molecules, using the AutoDock Vina program, and displays the results, including graphs showing the energy distribution and intermolecular interactions present in the host:guest complexes. The CycloMolder program was tested through case studies inspired by real pharmaceutical problems. The tests highlighted the importance of generating more than one chemical structure to better represent a ciclodextrin derivative, also showed the analytical potential of the program, provided by the automation of the modeling study, execution of calculations and analysis of results. Overall, the CycloMolder program achieves its goals by automating and simplifying the in silico studies of inclusion complexes, thus contributing to the therapeutic innovation.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-18T17:34:04Z No. of bitstreams: 2 Tese - Benedito R Neto da Silva Neto - 2013.pdf: 6956298 bytes, checksum: 49e69215087afc3b1ae2471385d29585 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-18T17:34:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Benedito R Neto da Silva Neto - 2013.pdf: 6956298 bytes, checksum: 49e69215087afc3b1ae2471385d29585 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-18T17:34:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Benedito R Neto da Silva Neto - 2013.pdf: 6956298 bytes, checksum: 49e69215087afc3b1ae2471385d29585 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-05-02 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The thermally dimorphic fungal pathogen Paracoccidioides is the agent of paracoccidioidomycosis. This disease is characterized by a granulomatous inflammation with clinical forms ranging from a benign localized infection to a disseminated one. The triazole drugs are broad-spectrum antifungal agents and are currently used to treat infections caused by various pathogenic yeast and molds. The mechanism of action of azoles has been elucidated in some fungi, although little is known in Paracoccidioides. Here we aim to investigate the mechanism of action of itraconazole on Paracoccidioides by using Representational Difference Analysis from Paracoccidioides yeast cells grown in the absence and presence of itraconazole for 1 and 2 h. Among the Paracoccidioides genes up-regulated by itraconazole were those mainly involved in cellular transport, metabolism/energy, transcription, cell rescue, defense and virulence. ERG11, ERG6, ERG3, ERG5 and ERG25 were up-regulated when evaluated in a timely manner. In vivo infection experiment in mice corroborated in vitro results. The glyoxylate cycle and its key enzymes isocitrate lyase and malate synthase (MLS) play a crucial role in the pathogenicity and virulence of various fungi such as the human pathogens. Here, we describe a study conducted to develop rational ligands as candidates to inhibit receptor PbMLS. The important step in the search for ligands for this receptor based on structural homology, molecular docking and molecular dynamics involving scanning virtual (virtual screening) through the program AutoDock Vina. Identified from the database of natural compounds (ZINC data bank) potential candidate ligands to inhibit the activity of PbMLS when compared to the original binder. This process led us to monoterpene indole alkaloids of the genus Palicourea (Rubiaceae) comprises about 230 species from shrubs and small trees distributed mainly in tropical regions. From the molecular docking fifteen compounds were tested as to its effectiveness in inhibiting the activity of PbMLS. The specific activity of PbMLS was affected by the compounds. Four indol alkaloids showed ability to reduce the enzyme activity. Since PbMLS is a linked surface protein that behaves as an anchorless adhesin, and PbICL is here described as adhesin, we also investigated if those compounds inhibit the adhesion of the protein to extracellular. Twodimensional gel electrophoresis we used to investigate the proteins expressed differentially during treatment with itraconazole and amphotericin B. Gels of three independent biological replicates were digitalized and the images were analyzed using the ImageMaster 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). Spot intensities were normalized and the statistics analyses were estimated by one-way ANOVA. The spots of interest were excised, in-gel digested with trypsin, and the peptides were then analyzed by MS and/or MS/MS and and sequenced. The results obtained here should assist in understanding the mode of action of drugs in Paracoccidioides, and outline studies identifying compounds with antifungal activity. / O fungo patógeno termodimórfico Paracoccidioides é o agente da paracoccidioidomicose. Esta doença é caracterizada por uma inflamação granulomatosa onde as formas clínicas vão da infecção localizada benigna a uma uma disseminada. As drogas triazólicas são antifúngicos de amplo espectro e são usadas atualmente para tratar infecções causadas por vários fungos patogênicos e fungos. O mecanismo de ação dos azólicos foi elucidado em alguns fungos, embora pouco se sabe em Paracoccidioides. Aqui, em primeiro lugar pretendemos investigar o mecanismo de ação do itraconazol em Paracoccidioides usando análise de diferença representacional de Paracoccidioides células de levedura crescidas na ausência e na presença de itraconazol por 1 e 2 horas. Entre os genes Paracoccidioides up-regulados pelo itraconazol foram os envolvidos, principalmente no transporte celular, metabolismo/energia, transcrição, defesa e virulência. ERG11, ERG6, ERG3, ERG5 e ERG25 foram regulados quando avaliados de forma temporal. Experimentos de infecção em camundongos corroborou resultados in vitro. O ciclo do glioxilato e suas enzimas chave isocitrato liase (ICL) e malato sintetase (MLS) desempenham um papel fundamental na patogenicidade e virulência de vários fungos, assim como patogênese em humanos. Neste trabalho, descrevemos um estudo realizado para desenvolver ligantes racionais como candidatos pra inibir o receptor PbMLS. Apresentamos um passo importante na busca de ligantes para este receptor baseando-se em homologia de estruturas, dinâmica molecular e acoplamento molecular envolvendo varredura virtual (virtual screening) por meio do programa AutoDock Vina. Identificamos a partir de banco de compostos naturais (data bank ZINC) potenciais ligantes candidatos a inibir a atividade de PbMLS quando comparados ao ligante original. Este processo nos conduziu aos alcalóides indólicos monoterpênicos do gênero Palicourea (Rubiaceae) que compreende cerca de 230 espécies entre arbustos e pequenas árvores distribuídas, principalmente, nas regiões tropicais.A partir da ancoragem molecular quinze compostos foram testados quanto à sua eficácia na inibição da atividade de PbMLS. A atividade específica de PbMLS foi afetado pelos compostos. Quatro alcalóides indólico mostraram capacidade de reduzir a atividade da enzima. Desde que PbMLS é uma proteína associada à superfície que se comporta como uma adesina ancorada também foi investigado se os compostos inibem a adesão da proteína às matrizes extracelulares. O processo de eletroforese em gel bidimensional foi utilizado para investigar as proteínas diferencialmente expressas durante o tratamento com itraconazol e anfotericina B. Gel de três réplicas biológicas independentes foram digitalizadas e as imagens foram analisadas usando o software 6.0 Platinum 2D ImageMaster (GE Healthcare). Intensidades dos spots foram normalizados e foram estimadas as análises estatísticas por ANOVA one-way. Os spots de interesse foram excisadas do gel digerida com tripsina e os péptidos foram analisados por MS e / ou MS / MS e sequenciados. Os resultados obtidos aqui devem ajudar na compreensão do mecanismo de ação de drogas em Paracoccidioides, e delinear estudos de identificação de compostos com atividade antifúngica.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.