O uso de microrganismos na biotecnologia tem grande importância e interesse econômico no Brasil. Entre esses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae tem grande destaque nos processos fermentativos para produção de pães, bebidas e álcool combustível. Dimorfismo em S. cerevisiae (alteração na morfologia celular de células brotantes para estruturas filamentosas) tem sido observado em condições de deficiência de nitrogênio, carbono e presença de álcoois superiores. Isso pode ser um tipo de defesa da levedura, que ao encontrar um meio prejudicial ao seu desenvolvimento, através da alongação das células, crescimento hifal e da invasão do meio, cria novos mecanismos para encontrar alimento para o seu desenvolvimento. Neste trabalho, dezessete linhagens (haplóides e diplóides) de S. cerevisiae isoladas do processo fermentativo industrial para produção de etanol foram caracterizadas quanto à filamentação induzida por deficiência de carbono (crescimento invasivo), nitrogênio e presença de álcoois superiores, em meio de cultura sólido. Objetivou-se também avaliar a indução da filamentação por álcool isoamílico em condições de fermentação e seus efeitos sobre os parâmetros fermentativos. A maioria das linhagens apresentou filamentação em resposta aos álcoois isoamílico, butanol e isobutanol, não respondendo ao metanol, sendo mais marcante em linhagens haplóides. O álcool isoamílico foi o indutor mais eficiente em meio (YEPD), linhagens diplóides apresentaram crescimento invasivo, embora esse tipo de filamentação seja mais comum em linhagens haplóides. Resultados semelhantes foram observados quando se utilizou frutose e manose em substituição à glicose no meio de cultura. As linhagens não filamentaram em meio de cultura deficiente em nitrogênio (SLAD). A linhagem CCA193 (PE-02), extensivamente utilizada nas destilarias da região, foi escolhida para a indução da filamentação por álcool isoamílico em condições de fermentação (meio de caldo de cana e sistema de reciclo celular). A adição de 0,1% desse álcool superior afetou significativamente os parâmetros fermentativos, induzindo filamentação após o terceiro ciclo fermentativo, coincidindo com a recuperação da viabilidade celular, número de células viáveis, produção de etanol e diminuição do Brix residual, embora não se comparando aos valores alcançados ao final do sexto ciclo no tratamento sem álcool isoamílico. Os resultados obtidos indicaram que a filamentação induzida por álcoois superiores e deficiência de nutrientes (especialmente carbono) é um processo comum em linhagens industriais de S. cerevisiae e pode contribuir para a manutenção/sobrevivência das células em condições adversas. / The use of microorganisms in biotechnology is an important and economical area of interest in Brazil. Among these, the yeast Saccharomyces cerevisiae is specially remarkable in baking industry and alcohol fermentation. Dimorphism in S. cerevisiae (cell morphology alterations from budding cells to filamentous structures) has been observed in conditions of nitrogen and carbon deprivation and presence of fusel alcohoes. This can be a defense mechanism that allows the yeast to forage for nutrients through cell elongation, hyphal growth and medium invasiveness. In this work seventeen industrial strains of S. cerevisiae (haploid and diploid) isolated from the fermentative process for alcohol production were characterized for filamentation induced by carbon (invasive growth) and nitrogen deprivation and presence of fusel alcohol, in solid culture media. The induction of filamentation by isoamyl alcohol in fermentation condition was also aimed, evaluating its effects on the fermentative parameters. The majority presented filamentation induced by isoamyl alcohol, butanol and isobutanol, but not by methanol. The isoamyl alcohol was the most effective inducer in rich medium (YEPD), diploid strains showed invasive growth, although this kind of filamentous growth be common in haploid strains. Similar results were observed when fructose and mannose were utilized replacing glucose in the culture medium. In nitrogen-deficient medium (SLAD) the strains did not filament. The yeast strain CCA193 (PE-02), extensively used in the alcohol units, was chosen for filamentation induction by isoamyl alcohol in fermentation conditions (sugar cane juice medium and cell recycle system). The addition of 0.1% of this higher alcohol affected significantly the fermentative parameters, however filamentation was induced after the third fermentative cycle, coincident with the cell viability, viable cell number, ethanol production recuperation and residual Brix decrease, though the values were not comparable to the treatment without isoamyl alcohol by the sixth cycle.The results obtained indicate that the filamentation induced by higher alcohol and nutrient deprivation (specially carbon) is a common process in industrial strains of S. cerevisiae and can contribute for the cell maintenance/survival in adverse conditions.

Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2016-09-08T14:22:01Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ivon P. Lôbo.pdf: 3344901 bytes, checksum: 7e73b89d7c92c4df99ab47eb630bca7c (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Reis (vanessa.jamile@ufba.br) on 2016-09-08T14:40:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ivon P. Lôbo.pdf: 3344901 bytes, checksum: 7e73b89d7c92c4df99ab47eb630bca7c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T14:40:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ivon P. Lôbo.pdf: 3344901 bytes, checksum: 7e73b89d7c92c4df99ab47eb630bca7c (MD5) / Dentre os parâmetros estabelecidos para garantia da qualidade do biodiesel, o teor de ésteres destaca-se por refletir a pureza do biocombustível a ser misturado ao diesel mineral. Com esse objetivo, é preconizado pela Resolução 07/08 da ANP o método cromatográfico EN ISO 14103, que se baseia na comparação da área total dos picos dos ésteres com a área relativa ao padrão heptadecanoato de metila (C17:0-Me). Este método apresenta inconvenientes como o alto custo do padrão C17:0-Me e a sua aplicabilidade na quantificação de ésteres com cadeia carbônica com menos de 16 carbonos. Essa limitação é decorrente da maior deficiência de carbono para os ésteres de cadeia curta, resultando em respostas diferenciadas no FID. Outro ponto que deve ser destacado é que o C17:0-Me poderá estar presente em biodieseis de diferentes óleos e gorduras e poderá acarretar em erros de quantificação. Neste trabalho, foram propostos Fatores de Correção Split (FRS), baseados na razão entre a proporção de carbonos ativos na molécula do éster e na sua resposta relativa no GC FID. O propósito desses fatores é corrigir as respostas no FID para ésteres com cadeia menor que 16 carbonos e a discriminação das massas dos ésteres mais pesados, no momento da injeção split. Os FRS mostraram uma correlação linear com as respectivas massas molares, permitindo assim realizar previsão dos FRS dos ésteres do biodiesel, a partir dos FRS de três padrões adicionados a amostra. Os padrões internos empregados foram C12:0-Et, C14:0-Et e C18:1-Et nas análises de biodieseis metílicos e C12:0-Me, C14:0-Me e C18:0-Me para os biodieseis etílicos. Utilizando FRS para a análise de uma amostra sintética simulando o biodiesel de babaçu, onde estavam presentes ésteres de cadeia curta em concentrações significativas, os erros de previsão (EP%) foram respectivamente 1,4; 2,7; 1,4; 2,2; e 3,2%, para os ésteres C6:0-Et, C8:0-Et, C10:0-Et, C12:0-Et, C14:0-Et; contra 24,4; 13,5, 6,2; 2,4 e 2,0% para os mesmos ésteres determinados via padrão C17:0-Me. Para amostras reais de biodieseis de dendê, soja e pinhão manso, onde os ésteres mais leves estão presentes em concentrações não superiores a 1%, os resultados das análises realizadas através dos FRSPreditos e via padrão C17:0-Me não apresentaram diferenças significativas, conforme a avaliação do método de referência EN ISO 14103. Mesmo utilizando uma quantidade maior de padrões internos, o método proposto apresenta um custo mais baixo que o método oficial, permitindo inclusive a quantificação de C17:0-Me que possa vir está presente na amostra do biodiesel. O método mostrou-se confiável, sendo aplicável a análise de biodieseis metílico e etílicos de óleos e gorduras, onde a concentração de ésteres com cadeia carbônica menor que C16 não seja superior a 1%. / Among the parameters set for quality assurance of biodiesel, the ester content stands out because it reflects the purity of the biofuel to be blended with mineral diesel. With this objective, it is recommended by Resolution 07/08 of the ANP the chromatographic method EN ISO 14 103, which is based on a comparison of the total area of the peaks of the esters with the area on the standard methyl heptadecanoate (C17:0-Me). This method has drawbacks such as high cost of the standard C17:0-Me and its applicability in the quantification of esters with chains with less than 16 carbons. This limitation is due to higher carbon deficiency for short chain esters, resulting in differential responses on the FID. Another point to be stressed is that the C17:0-Me may be present in biodiesel of different oils and fats and can cause errors in measurement. In this work, split response factors (SRF) have been proposed, based on the ratio between the proportion of active carbons in the ester molecule and its response on the GC FID. The purpose of these factors is the correct answers to the FID chain esters with less than 16 carbons and discrimination of the masses of heavier esters, during the split injection. The SRF showed a linear correlation with their molecular weights, thus allowing prediction of SRF held the esters of biodiesel, from the FRS three patterns added to the sample. The internal standards used were C12 :0- Et, Et and C14 :0-C18 :1-Et in the analysis of methyl biodiesels and C12 :0-Me, Me, and C14 :0-C18 :0-Me for ethyl biodiesels. Using SRF to the analysis of a sample simulating synthetic biodiesel from babassu, where were these short chain esters in high concentrations, the prediction errors (PE%) were respectively 1.4, 2.7, 1.4, 2.2 , and 3.2% for C6 :0-Et ester, C8 :0-Et, C10 :0-Et, Et :0-C12, C14 :0-Et, against 24.4, 13.5, 6 , 2, 2.4 and 2.0% for the same esters determined via standard C17 :0-Me. For samples of palm, soybean and jatropha biodieseis, where the lighter esters are present in concentrations not exceeding 1%, the results of analysis performed by SRF predicted and by standard route C17:0-Me showed no significant differences, as evaluation of the reference method EN ISO 14 103. Even using a larger amount of internal standards, the proposed method has a lower cost than the official method, permitting a quantification of C17 :0-Me which may present in the sample of biodiesel. This method was reliable and applicable to analysis of methyl and ethyl esters oils and fats, where the concentration of esters with carbon chain less that C16 is not more than 1%.

O uso de microrganismos na biotecnologia tem grande importância e interesse econômico no Brasil. Entre esses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae tem grande destaque nos processos fermentativos para produção de pães, bebidas e álcool combustível. Dimorfismo em S. cerevisiae (alteração na morfologia celular de células brotantes para estruturas filamentosas) tem sido observado em condições de deficiência de nitrogênio, carbono e presença de álcoois superiores. Isso pode ser um tipo de defesa da levedura, que ao encontrar um meio prejudicial ao seu desenvolvimento, através da alongação das células, crescimento hifal e da invasão do meio, cria novos mecanismos para encontrar alimento para o seu desenvolvimento. Neste trabalho, dezessete linhagens (haplóides e diplóides) de S. cerevisiae isoladas do processo fermentativo industrial para produção de etanol foram caracterizadas quanto à filamentação induzida por deficiência de carbono (crescimento invasivo), nitrogênio e presença de álcoois superiores, em meio de cultura sólido. Objetivou-se também avaliar a indução da filamentação por álcool isoamílico em condições de fermentação e seus efeitos sobre os parâmetros fermentativos. A maioria das linhagens apresentou filamentação em resposta aos álcoois isoamílico, butanol e isobutanol, não respondendo ao metanol, sendo mais marcante em linhagens haplóides. O álcool isoamílico foi o indutor mais eficiente em meio (YEPD), linhagens diplóides apresentaram crescimento invasivo, embora esse tipo de filamentação seja mais comum em linhagens haplóides. Resultados semelhantes foram observados quando se utilizou frutose e manose em substituição à glicose no meio de cultura. As linhagens não filamentaram em meio de cultura deficiente em nitrogênio (SLAD). A linhagem CCA193 (PE-02), extensivamente utilizada nas destilarias da região, foi escolhida para a indução da filamentação por álcool isoamílico em condições de fermentação (meio de caldo de cana e sistema de reciclo celular). A adição de 0,1% desse álcool superior afetou significativamente os parâmetros fermentativos, induzindo filamentação após o terceiro ciclo fermentativo, coincidindo com a recuperação da viabilidade celular, número de células viáveis, produção de etanol e diminuição do Brix residual, embora não se comparando aos valores alcançados ao final do sexto ciclo no tratamento sem álcool isoamílico. Os resultados obtidos indicaram que a filamentação induzida por álcoois superiores e deficiência de nutrientes (especialmente carbono) é um processo comum em linhagens industriais de S. cerevisiae e pode contribuir para a manutenção/sobrevivência das células em condições adversas. / The use of microorganisms in biotechnology is an important and economical area of interest in Brazil. Among these, the yeast Saccharomyces cerevisiae is specially remarkable in baking industry and alcohol fermentation. Dimorphism in S. cerevisiae (cell morphology alterations from budding cells to filamentous structures) has been observed in conditions of nitrogen and carbon deprivation and presence of fusel alcohoes. This can be a defense mechanism that allows the yeast to forage for nutrients through cell elongation, hyphal growth and medium invasiveness. In this work seventeen industrial strains of S. cerevisiae (haploid and diploid) isolated from the fermentative process for alcohol production were characterized for filamentation induced by carbon (invasive growth) and nitrogen deprivation and presence of fusel alcohol, in solid culture media. The induction of filamentation by isoamyl alcohol in fermentation condition was also aimed, evaluating its effects on the fermentative parameters. The majority presented filamentation induced by isoamyl alcohol, butanol and isobutanol, but not by methanol. The isoamyl alcohol was the most effective inducer in rich medium (YEPD), diploid strains showed invasive growth, although this kind of filamentous growth be common in haploid strains. Similar results were observed when fructose and mannose were utilized replacing glucose in the culture medium. In nitrogen-deficient medium (SLAD) the strains did not filament. The yeast strain CCA193 (PE-02), extensively used in the alcohol units, was chosen for filamentation induction by isoamyl alcohol in fermentation conditions (sugar cane juice medium and cell recycle system). The addition of 0.1% of this higher alcohol affected significantly the fermentative parameters, however filamentation was induced after the third fermentative cycle, coincident with the cell viability, viable cell number, ethanol production recuperation and residual Brix decrease, though the values were not comparable to the treatment without isoamyl alcohol by the sixth cycle.The results obtained indicate that the filamentation induced by higher alcohol and nutrient deprivation (specially carbon) is a common process in industrial strains of S. cerevisiae and can contribute for the cell maintenance/survival in adverse conditions.