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Transporteur mitochondrial d'ADP/ATP : étude par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse et caractérisation de mutations pathogènesRey, Martial 10 December 2009 (has links) (PDF)
Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.
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Approche biophysique de l'étude de l'insertion du domaine de translocation de la toxine botulique dans les membranesMontagner, Caroline 17 December 2007 (has links) (PDF)
Les neurotoxines botuliques (BoNTs), toxines les plus efficaces connues, sont responsables du botulisme. Elles inhibent la libération d'acétylcholine aux jonctions neuromusculaires causant des paralysies flasques. Lors de l'intoxication, la BoNT se lie à ses récepteurs à la surface des neurones, puis est internalisée par endocytose. L'interaction de son domaine de translocation avec la membrane à l'intérieur de compartiments cellulaires acides permet le passage du domaine catalytique dans le cytosol. Le domaine de translocation de BoNT/A (Tm) a été exprimé à partir d'un gène de synthèse. L'insertion de Tm dans la membrane et son activité sont dépendantes du pH et apparaissent dès pH 5,5. Aucun changement de structure n'est détecté par spectroscopie. Cependant, la formation d'une structure quaternaire n'est pas exclue. L'activité de Tm est aussi sensible à la courbure de la membrane, ce qui pourrait permettre une régulation supplémentaire de sa fonction.<br /><br />L'apomyoglobine appartient à la famille des protéines à repliement de type globine, comme certaines toxines bactériennes. Son interaction avec la membrane présente de fortes homologies avec celle du domaine de translocation de la toxine diphtérique. Ce processus à deux étapes (liaison puis insertion) est dépendant du pH et requiert le passage par un état partiellement replié. Pour chaque étape, les régions impliquées ont été localisées par des expériences d'échanges Hydrogène/Deuterium analysées par spectrométrie de masse. La liaison à la bicouche se fait par une hélice amphiphile, puis une hélice hydrophobe intervient pour l'insertion. Cette dernière n'est accessible qu'après formation de l'état partiellement replié.
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Final state effects in neutron Compton scattering measurementsFielding, Andrew L. January 1997 (has links)
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Rekombinantní expresse chloridového kanálu z E. coli a jeho strukturní charakterizace / Recombinant expression of chloride channel from E. coliand its structure characterizationHausner, Jiří January 2014 (has links)
Chloride channel family has been shown to play a significant role in physiological homeostasis processes. The function mechanism of these proteins has not yet been clearly understood. Their deficiency or mutation causes serious human illnesses. Our understanding of the chloride channels' transporting mechanisms can lead to better treatment of these illnesses. As mammalian chloride channels are difficult to prepare in laboratory, the experiments are usually done on homologous chloride channels from prokaryotic organisms. The structures of prokaryotic chloride channels have been solved and moreover they are produced with high yields. Most experiments currently use protein crystallography and provide a static picture of the system. This thesis is focused on the study of structural changes of an E. coli chloride channel using hydrogen/deuterium exchange. This method enables us to monitor dynamic conformation changes dependent on pH and exchanged ions. The measurements were done for the protonated (pH 4.5) and deprotonated state (pH 7.5) and/or in the presence of various anions: Cl− , SCN− , I− , F− , TAR. (tartaric anion). The obtained results justified the theories explaining the function of chloride channel as Cl− /H+ antiporter and provided new findings. Subject words biochemistry, protein...
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Cristallisation des caoutchoucs chargés et non chargés sous contrainte : Effet sur les chaines amorphesMarchal, Jeanne 21 June 2006 (has links) (PDF)
Nous avons étudié les propriétés de cristallisation sous traction du 1,4 poly-cis-isoprène naturel (CN) en<br />fonction de la température, du taux de réticulation et du pourcentage de charge ajoutée (noir de carbone). Le<br />taux de cristallinité a été mesuré par diffraction X et l'orientation des chaînes polymères dans la phase<br />amorphe par RMNdu deutérium. Nous avons pu établir que l'hystérésis mécanique observée lors d'un cycle<br />de traction était essentiellement due au phénomène de cristallisation sous traction. Dans le cas des<br />échantillons non chargés, le début de la cristallisation se traduit par un adoucissement de la contrainte ; ceci<br />est observé jusqu'à une cristallinité de 15% environ, au-delà de laquelle on observe au contraire un<br />durcissement apparaissant à une extension critique qui varie selon le matériau et les adjuvants contenus dans<br />le caoutchouc. Durant la phase de décharge, on observe fréquemment une instabilité géométrique<br />correspondant à la séparation macroscopique d'une phase amorphe et d'une phase semi-cristalline<br />(« striction inverse ») ; cet effet a été étudié en détail. Il est vraisemblable que le même phénomène de<br />micro-striction se produise localement dans les matériaux où la striction inverse n'est pas visible. Dans le<br />cas des matériaux chargés, seule la phase de durcissement est visible.<br />La quantité d'énergie dissipée H liée à l'hystérésis mécanique n'est fonction que du taux de cristallinité<br />maximale Cmax atteint durant le cycle. Nous avons montré que la composante viscoélastique de cette<br />hystérésis est faible (Hvisco<10% lorsqu'il y a cristallisation) : la résistance à la rupture de ces matériaux est<br />donc essentiellement due à la cristallisation sous contrainte.<br />Nous avons en outre pu établir que dans les matériaux chargés, l'effet de durcissement dû à la cristallisation<br />était fortement amplifié par la présence des charges.<br />Dans la cas de matériaux non chargés, la RMN a permis de mettre en évidence la relaxation des chaînes due<br />à la cristallisation : ce phénomène est observé y compris dans la phase de durcissement.<br />Des études complémentaires ont été menées sur d'autres types d'élastomères : polybutadiène,<br />polychloroprène, butyl ... Le lien entre renforcement et cristallisation a pu également y être mis en<br />évidence.
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Etude moléculaire et isotopique en deutérium de la matière organique insoluble des chondrites carbonéesRemusat, Laurent 11 1900 (has links) (PDF)
Les chondrites carbonées peuvent contenir jusqu'à 4% en masse de carbone, principalement présent sous la forme d'une fraction organique insoluble (MOI) enrichie en deutérium par rapport aux échantillons organiques terrestres. Cet enrichissement a été interprété comme la signature de processus interstellaires. La MOI est constituée d'unités aromatiques assez petites (de 2 à 3 cycles contigus) reliées entre elles par des chaînes aliphatiques courtes et ramifiées. La MOI d'Orgueil et de Murchison a été étudiée par des dégradations thermique et chimique, ainsi que par spectroscopie. Il apparaît à travers les données récoltées que les chaînes aliphatiques contiennent moins de 7 carbones et qu'elles sont très ramifiées. Par ailleurs, elles peuvent contenir des fonctions éther et ester. Ces chaînes peuvent lier deux ou trois unités aromatiques entre elles. Les chaînes aliphatiques non liantes (avec une extrémité libre) sont plus courtes: moins de 3 carbones. Les données acquises nous ont aussi permis de montrer que l'azote était contenu dans des hétérocycles. Cette observation, ainsi qu'une comparaison de données isotopiques, implique qu'il n'y a pas de lien génétique entre la MOI et les acides aminés présents dans la fraction soluble des météorites. Ceci n'exclut pas que d'autres classes de composés solubles puissent dériver de la MOI par altération hydrothermale sur le corps parent, ce qui indiquerait une origine complexe pour la fraction soluble. Le rapport isotopique D/H des briques élémentaires de la MOI d'Orgueil, obtenues par pyrolyse et dégradation chimique, a été interprété en considérant la macromolécule avant sa dégradation. Les résultats montrent que la MOI est un produit solaire et qu'elle s'est enrichie en D à la périphérie de la nébuleuse protosolaire sous des conditions proches du milieu interstellaire. Cette conclusion est majeure pour la MOI, qui a pu être la plus grosse partie de la matière organique abiotique sur la Terre primitive.
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La deutération dans les protoétoiles de faible masseParise, Bérengère 20 September 2004 (has links) (PDF)
Malgré la faible abondance du deutérium dans l'Univers (D/H ~ 1.5 10e-5), des molécules deutérées sont détectées en grande abondance dans les régions de formation d'étoiles, avec un fractionnement (rapport de l'abondance de la molécule deutérée à celle de son isotope principal) supérieur de plusieurs ordres de grandeur à l'abondance cosmique du deutérium. Ces molécules deutérées représentent des sondes précieuses pour déterminer les conditions physiques régnant lors de la formation d'une étoile. L'incorporation préférentielle d'atomes de deutérium dans les molécules est une conséquence de la différence d'énergie de point zéro entre une espËce deutérée et son isotope principal. Les températures indiquées par les fractionnements observés en phase gazeuse étant bien plus faibles que la température actuelle du gaz, il est généralement admis que ces molécules ont été formées lors d'une phase antérieure froide et dense (phase de coeur préstellaire), par des réactions en phase gazeuse ou à la surface des grains, puis stockées dans les manteaux de glace des grains. Elles sont libérées en phase gazeuse quand la protoétoile nouvellement formée chauffe son enveloppe et évapore les glaces. Nous étudions dans cette thèse les processus physico-chimiques menant à un tel degré de deutération dans les environnements des protoétoiles de faible masse, progéniteurs d'étoiles telles que notre soleil. Nous présentons dans un premier temps des observations de molécules deutérées (en particulier eau, formaldéhyde et méthanol) dans les enveloppes de gaz et de poussière entourant les jeunes protoétoiles. Des observations dans le domaine millimétrique ont permis de mettre en évidence un fort degré de deutération du méthanol dans le gaz constituant l'enveloppe. En particulier, l'isotope triplement deutéré a été détecté avec un fractionnement CD3OH/CH3OH de 1%. Les fractionnements observés sont compatibles avec un scénario de formation du formaldéhyde et du méthanol à la surface des grains de poussière. L'analyse de l'émission de l'eau dans ces memes environnements conduit paradoxalement à un fractionnement environ dix fois plus faible, en accord avec la limite supérieure sur le fractionnement de l'eau dans les glaces constituant les manteaux des grains de poussière, déterminée par des observations dans le proche infrarouge. Nous présentons enfin un modèle de chimie à la surface des grains se proposant de comprendre pourquoi le deutérium est préférentiellement incorporé dans les molécules de formaldéhyde et de méthanol plutot que dans l'eau.
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L'ABONDANCE DU DEUTÉRIUM, DE L'ULTRAVIOLET AU VISIBLEHebrard, Guillaume 06 December 2000 (has links) (PDF)
Dans le cadre du modèle standard du Big Bang, le deutérium est l'élément dont l'abondance primordiale est la plus sensible à la densité baryonique de l'Univers. Cet élément est uniquement créé lors de la nucléosynthèse primordiale, quelques minutes après le Big Bang ; aucune théorie standard n'en prédit actuellement d'autres sources significatives. Au contraire, étant brûlé dans les étoiles, son abondance D/H décroît au cours de l'évolution cosmique. Les mesures de D/H apportent ainsi des contraintes sur les modèles de Big Bang et d'évolution chimique des galaxies. On peut distinguer trois types de mesures de D/H : les abondances primordiale, proto-solaire et interstellaire, respectivement représentatives de l'Univers il y a environ 15 milliards d'années, 4.5 milliards d'années et à l'époque actuelle. Si l'évolution du deutérium semble qualitativement claire, les résultats concernant ces trois types d'abondance ne convergent pas pour l'instant vers trois valeurs bien définies. Les travaux entrepris durant cette thèse sont reliés à la mesure de l'abondance interstellaire du deutérium. Celle-ci s'obtient habituellement par l'observation spectroscopique en absorption des séries de Lyman de l'hydrogène et du deutérium. Ces observations se font dans le domaine ultraviolet, au moyen d'observatoires spatiaux. Les résultats présentés ici ont été obtenus avec le Télescope spatial Hubble puis le satellite FUSE, récemment mis en orbite. D'autre part, une nouvelle méthode d'observation du deutérium a été proposée, dans le domaine visible à partir de télescopes au sol. Ce travail a mené aux premières détections et à l'identification de la série de Balmer du deutérium, observée en émission dans des régions HII avec le Télescope Canada-France-Hawaii et le Very Large Telescope.
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Water Relaxation Processes as Seen by NMR Spectroscopy Using MD and BD SimulationsÅman, Ken January 2005 (has links)
<p>This thesis describes water proton and deuterium relaxation processes, as seen by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, using Brownian Dynamics (BD) or Molecular Dynamics (MD) simulations. The MD simulations reveal new detailed information about the dynamics and order of water molecules outside of a lipid bilayer. This is very important information in order to fully understand deuterium NMR measurements in lipid bilayer systems, which require an advanced analysis, because of the complicated water motion (such as tumbling and self-diffusion). The BD simulation methods are combined with the powerful Stochastic Liouville Equation (SLE) in its Langevin form (SLEL) to give new insight into both <sup>1</sup>H<sub>2</sub>O and <sup>2</sup>H<sub>2</sub>O relaxation. The new simulation techniques which combine BD and SLEL can give important new information in cases where other methods do not apply. The deuterium relaxation is described in the context of a water/lipid interface and is in a very elegant way combined with the simulation of diffusion on curved surfaces developed by our research group. <sup>1</sup>H<sub>2</sub>O spin-lattice relaxation is described for paramagneticsystems. With this we mean systems with paramagnetic transition metal ions or complexes, that are dissolved into a water solvent. The theoretical description of such systems are quite well investigated but such systems are not yet fully understood. An important consequence of the Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) calculations when using the SLEL approach combined with BD simulations is that we obtain the electron correlation functions, which describe the relaxation of the paramagnetic electron spins. This means for example that it is also straight forward to generate Electron Spin Resonance (ESR) lineshapes.</p>
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Water Relaxation Processes as Seen by NMR Spectroscopy Using MD and BD SimulationsÅman, Ken January 2005 (has links)
This thesis describes water proton and deuterium relaxation processes, as seen by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, using Brownian Dynamics (BD) or Molecular Dynamics (MD) simulations. The MD simulations reveal new detailed information about the dynamics and order of water molecules outside of a lipid bilayer. This is very important information in order to fully understand deuterium NMR measurements in lipid bilayer systems, which require an advanced analysis, because of the complicated water motion (such as tumbling and self-diffusion). The BD simulation methods are combined with the powerful Stochastic Liouville Equation (SLE) in its Langevin form (SLEL) to give new insight into both 1H2O and 2H2O relaxation. The new simulation techniques which combine BD and SLEL can give important new information in cases where other methods do not apply. The deuterium relaxation is described in the context of a water/lipid interface and is in a very elegant way combined with the simulation of diffusion on curved surfaces developed by our research group. 1H2O spin-lattice relaxation is described for paramagneticsystems. With this we mean systems with paramagnetic transition metal ions or complexes, that are dissolved into a water solvent. The theoretical description of such systems are quite well investigated but such systems are not yet fully understood. An important consequence of the Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) calculations when using the SLEL approach combined with BD simulations is that we obtain the electron correlation functions, which describe the relaxation of the paramagnetic electron spins. This means for example that it is also straight forward to generate Electron Spin Resonance (ESR) lineshapes.
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