La cocontraction spastique, anomalie ubiquitaire de la commande motrice dans la population parétique, est l'une des formes d'hyperactivité musculaire handicapant le plus sévèrement le mouvement volontaire du sujet atteint de parésie spastique, au membre supérieur comme à la marche. Expliquée par une mauvaise distribution de la commande descendante, la cocontraction spastique est une contraction exagérée du muscle antagoniste, déclenchée par la commande sur l'agoniste, qui vient créer un couple d'opposition voire d'inversion du mouvement désiré. Ce phénomène longtemps sous estimé par cliniciens et chercheurs a été peu caractérisé d'un point de vue biomécanique et physiologique. Cette thèse a eu pour objectif de participer à cette caractérisation, au sein d'une population de sujets atteints d'une parésie spastique. Le présent travail a permis : l'étude des réactivités des cocontractions antagonistes face à des changements de la commande centrale (différents niveaux d'efforts) et des changements périphériques (muscle antagoniste relâché ou étiré) en condition statique (isométrique) ; sa quantification en condition dynamique (phase oscillante de la marche) et enfin sa sensibilité à un agent bloqueur de la jonction neuromusculaire (toxine botulique). Les résultats de ces études permettront aux cliniciens de mieux évaluer et intégrer dans leur examen le phénomène de cocontraction spastique, en dirigeant peut-être leur réflexion vers de nouvelles mesures thérapeutiques. Pour le biomécanicien et le neurophysiologiste, plusieurs outils d'évaluation sont présentés avec un canevas d'indices dynamométriques et électromyographiques susceptibles de faciliter la recherche ultérieure sur le phénomène de cocontraction spastique en particulier, et sur la parésie spastique de façon plus générale.

Les circuits neuronaux sous-tendant la locomotion requièrent d'intégrer à la fois des stimuli sensoriels et l'état physiologique. Cependant, la manière dont ces circuits fonctionnent pendant la locomotion active reste peu comprise. La larve de poisson zèbre est un organisme vertébré idéal pour étudier cette question de part son répertoire locomoteur simple et son accessibilité à la manipulation génétique. Dans le Chapitre 1, je décris le logiciel que nous avons développé afin de nous permettre de traquer les comportements et caractériser automatiquement les modules locomoteurs à haut débit. Les interneurones V2a sont des neurones excitateurs de la moelle épinière et du cerveau postérieur caractérisés par l'expression du facteur de transcription chx10. Afin de tester leur implication dans la locomotion, j'ai, dans le Chapitre 2, validé l'utilisation d'une toxine génétiquement encodée dans le but d'inhiber la population chx10 positive in vivo. Par analyse comportementale, enregistrements de locomotion fictive et imagerie calcique, nous avons montré que les V2as sont impliqués différemment dans la locomotion lente et rapide. Les neurones contactant le liquide céphalorachidien (NcLCRs) relaient des informations sensorielles aux circuits moteurs. Par ciblage génétique, imagerie calcique, pharmacologie et électrophysiologie, j'ai, dans le Chapitre 3, investigué le rôle de l'activité spontanée dans les NcLCRs. J'ai montré que l'ouverture de canaux PKD2L1 représentait une source intrinsèque d'activité spontanée dans les NcLCRs. Ces résultats offrent une meilleure compréhension de la manière dont les interactions dynamiques structurent les sorties locomotrices in vivo. / The neural networks that underlie locomotion are complex and require integration of sensory input and physiological state. However, how these networks function during active locomotion to incorporate sensory input from the environment and the internal state of the animal remains poorly understand. The zebrafish larva is an ideal vertebrate to study these questions thanks to its simple locomotor repertoire, transparency, and amenability to genetic manipulation. In Chapter 1, I describe a program to track behavior at high speeds and automatically characterize locomotor patterns in a high-throughput manner. V2a interneurons are excitatory interneurons in the spinal cord and hindbrain identified by the chx10 transcription factor. In Chapter 2, I validated the use of a genetically-encoded botulinum toxin to silence the chx10 population in vivo. Using fictive locomotor recordings and calcium imaging, I demonstrated that silencing V2as leads to decreased activity in primary motor neurons during fast swimming, corresponding to a lower swimming frequency in V2a-silenced larvae. Cerebrospinal fluid-contacting neurons (CSF-cNs) are intraspinal neurons that relay sensory information to motor circuits. CSF-cNs in diverse species express GABA and the transient receptor potential channel PKD2L1. In Chapter 3, I used genetic targeting, calcium imaging, pharmacology, and electrophysiology to investigate the role of spontaneous activity in CSF-cNs. I showed that single channel opening of PKD2L1 represents an intrinsic source of spontaneous activity in CSF-cNs. These tools and results will allow a more complete picture of how dynamic interactions shape locomotor output in vivo.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), agents responsables du botulisme, sont les substances les plus toxiques actuellement connues. L'utilisation d'anticorps neutralisants pour l'immunothérapie passive est la seule solution retenue et accréditée par la FDA à l'heure actuelle. L'immunisation génétique par électroporation intramusculaire d'ADN s'est révélée être une alternative crédible à l'immunisation protéique pour produire des anticorps dirigés contre les sérotypes A et E des BoNTs avec un pouvoir neutralisant suffisamment élevé pour satisfaire aux exigences de la Pharmacopée Européenne. Cependant, les résultats se sont avérés décevants dans le cas du sérotype B, troisième type antigénique associé au botulisme humain. Comprendre la raison de la faible immunogénicité de BoNT/B en vaccination ADN et l'optimiser pour produire des anticorps neutralisants dirigés contre cette dernière ont constitué les deux objectifs de mon travail. En combinant différentes approches, nous avons montré que, contrairement à BoNT/A, la sécrétion de l'antigène BoNT/B est inhibée. Nous avons identifié le réticulum endoplasmique (RE) comme étant l'organite de rétention. Nous avons étudié un lien empirique entre la séquence protéique antigénique de BoNT/B et son accumulation intracellulaire et avons conclu que le mauvais repliement de la protéine antigénique était responsable de sa rétention dans le RE. Parmi les stratégies testées afin d'augmenter l'immunogénicité de BoNT/B en vaccination ADN, l'ajout de sites de N-glycosylation a permis de multiplier par 10 le pouvoir neutralisant des anticorps et l'utilisation des dérivés d'acides biliaires comme adjuvants de formulation est prometteuse. / Botulinum neurotoxins (BoNT) have been characterized to be the most potent toxic substances identified so far. Passive immunization with antiBoNT antisera is the only treatment for botulism to have gained FDA approval. We have previously shown that genetic immunization by the non-viral intramuscular DNA electroporation technique is an effective alternative to recombinant proteins immunization to raise high titer neutralizing antibodies against BoNT serotype A and E. The neutralizing titers obtained were high enough to fit the European Pharmacopeia while it did not for type B, commonly linked to human disease as well. Finding out why BoNT/B immunogenicity is low after DNA vaccination and how we could improve it for generation of high-titer neutralizing antiBoNT/B antiserum were the two main goals of my work. Combining different approaches, we have first shown that BoNT/B antigen secretion was inhibited, while it did not for BoNT/A. We identified the endoplasmic reticulum to be the organelle of retention. Then, we studied an empirical link between BoNT/B antigenic protein sequence and intracellular accumulation. We concluded that protein misfolding could be the reason for BoNT/B retention in the endoplasmic reticulum. Among different strategies tested to improve BoNT/B immunogenicity in DNA vaccination, addition of N-glycosylation sites yielded 10 fold higher neutralizing antibodies titers. Finally, bile salts could be promising adjuvants for plasmid DNA vaccines.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), toxines les plus efficaces connues, sont responsables du botulisme. Elles inhibent la libération d'acétylcholine aux jonctions neuromusculaires causant des paralysies flasques. Lors de l'intoxication, la BoNT se lie à ses récepteurs à la surface des neurones, puis est internalisée par endocytose. L'interaction de son domaine de translocation avec la membrane à l'intérieur de compartiments cellulaires acides permet le passage du domaine catalytique dans le cytosol. Le domaine de translocation de BoNT/A (Tm) a été exprimé à partir d'un gène de synthèse. L'insertion de Tm dans la membrane et son activité sont dépendantes du pH et apparaissent dès pH 5,5. Aucun changement de structure n'est détecté par spectroscopie. Cependant, la formation d'une structure quaternaire n'est pas exclue. L'activité de Tm est aussi sensible à la courbure de la membrane, ce qui pourrait permettre une régulation supplémentaire de sa fonction.<br /><br />L'apomyoglobine appartient à la famille des protéines à repliement de type globine, comme certaines toxines bactériennes. Son interaction avec la membrane présente de fortes homologies avec celle du domaine de translocation de la toxine diphtérique. Ce processus à deux étapes (liaison puis insertion) est dépendant du pH et requiert le passage par un état partiellement replié. Pour chaque étape, les régions impliquées ont été localisées par des expériences d'échanges Hydrogène/Deuterium analysées par spectrométrie de masse. La liaison à la bicouche se fait par une hélice amphiphile, puis une hélice hydrophobe intervient pour l'insertion. Cette dernière n'est accessible qu'après formation de l'état partiellement replié.

Notre objectif était de rechercher une méthode d’évaluation musculaire afin de déterminer des facteurs de non réponse tissulaire à une injection de toxine botulique (TB) dans un muscle spastique, chez l’adulte post AVC et chez l’enfant paralysé cérébral (PC). Une étude de reproductibilité et 3 revues systématiques de la littérature ont été réalisées. Les mesures échographiques de l’épaisseur et de l’angle des pennation des fibres du muscle gastrocnémien médial en 2D sont reproductibles. La mesure du module d’élasticité par Shear Wave Ultrasound Elastography délivre une information fiable sur la rigidité du muscle gastrocnémien médial spastique au repos.L’analyse du devenir du muscle post-injection rapporte que la TB participe au remodelage du muscle spastique avec une atrophie persistante, répétition d’injections dépendante.L’étude de l’impact des traitements adjuvants à la TB chez l’enfant PC montre que le renforcement musculaire intensif, y compris des muscles injectés, permet de lutter contre l’atrophie sans renforcer la spasticité. Les plâtres d’allongement permettent d’optimiser le fonctionnement articulaire mais les preuves sur la diminution de la raideur musculaire restent faibles. Dans la description des facteurs pronostics d’efficacité, plus de la moitié des patients identifiés comme secondairement non-répondeurs à la TB dans la spasticité des membres ne sont pas immunisés contre la TB. Les anticorps neutralisants ne sont donc pas la principale cause de non-réponse secondaire. Une évaluation de la qualité musculaire échographique comme facteur pronostic de réponse à la TB et pour mesurer l’impact des traitements adjuvants devrait être réalisée régulièrement afin de déterminer à quel moment ces traitements ne sont plus favorables au système musculaire. / The aim was to investigate a muscle evaluation method to determine tissue factors leading to non-responsiveness to an injection of botulinum toxin (BTX) into a spastic muscle in adult post stroke and children with cerebral palsy (CP). A reproducibility study and 3 systematic literature reviews were carried out. 2D ultrasound measurements of thickness and pennation angle of medialis gastrocnemius muscle fibers are reproducible. Measurement of the modulus of elasticity by shear wave ultrasound elastography provides a reliable information about the rigidity of the spastic medial gastrocnemius muscle at rest.Analysis of the post-injection muscle fate found that BTX participates in the remodeling of the spastic muscle with persistent atrophy that is dependent on the repetition of the injections.Analysis of the impact of BTX adjuvant therapies in CP children showed that intensive muscle strengthening, including of the injected muscles, may help combat atrophy without increasing spasticity. Stretching casts are used to optimize joint function, but there is little evidence for a reduction in muscle stiffness. In the description of prognostic efficacy factors, more than half of patients identified as secondariy non-responders to BTX in limb spasticity tests were not immunized against BTX. Neutralizing antibodies were therefore not the main cause for secondary non-responsiveness. An ultrasound evaluation of muscle quality as a prognostic factor for BTX response and to measure the impact of adjuvant treatments must be regularly performed to determine when these treatments are no longer favourable for the muscle system.

Un 1er travail a étudié les effets osseux mandibulaires de l’injection unilatérale dans les muscles masticateurs de toxine botulique (BTX) chez le rat adulte. Ceci entraine une perte osseuse mandibulaire condylienne et alvéolaire homolatérale importante. Une hypertrophie osseuse de l’enthèse d’insertion mandibulaire du muscle digastrique a été observée et pourrait correspondre à une étiologie pour les tori. Les effets de la BTX sur le cartilage articulaire condylien mandibulaire dans le même modèle animal ont été recherchés par analyse microtomographique du cartilage articulaire après augmentation de contraste à l’acétate d’uranyle. Aucune différence d’épaisseur cartilagineuse n’a été mise en évidence entre les groupes contrôles et BTX.Le 3ème travail a consisté en l’étude histologique et microtomographique des tori mandibulaires chez l’homme.Les tori sont différents des exostoses des os longs par plusieurs caractéristiques (dont l’absence de Fe et Al dans la matrice osseuse) et une asymétrie du remodelage osseux a été mise en évidence.La 4ème partie a consisté en l’étude de la qualité osseuse et de la microvascularisation alvéolaire dans un modèle animal d’ostéonécrose mandibulaire (ONM) aux bisphosphonates (BP). Des signes cliniques et microtomographiques d’ONM ont été observés dans la majorité des cas. La minéralisation osseuse était plus élevée après imprégnation en BP. La microvascularisation osseuse alvéolaire apparaissait augmentée après avulsion dentaire chez les animaux contrôles mais pas chez les animaux ayant reçu des BP témoignant ainsi d’un effet anti angiogénique in vivo des BP qui pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l’ONM. / First, bone changes at the mandible were studied after a unilateral botulinum toxin (BTX) injection in masticatory muscles in adult rats. A major alveolar and condylar bone loss was evidenced. The occurrence of a hypertrophic bone metaplasia at the digastric muscle enthesis was evidenced as well. This could constitute an etiological factor for tori. Then, condylar articular cartilage changes at the mandible were studied in the same BTX animal model, using microtomography after contrast enhancement of cartilage with uranyl acetate. Cartilage thickness measurement showed no difference when comparing control and BTX groups.A third work studied mandibular tori in human using histologic and microtomographic techniques. Tori appeared different from long bone exostoses by several characteristics (absence of Fe and Al in the bone matrix) and a specific asymmetric bone remodeling was evidenced.The fourth part consisted in the study of alveolar mandibular vascularization and quality of the bonematrix in an animal model of osteonecrosis of the jaws(ONJ) after bisphosphonates (BP) injections. Clinical and microtomographic signs of ONJ were found in mostof the cases. An increased mineralization of the alveolar bone was observed after BP impregnation. Microvascularization was increased after tooth extraction in the alveolar bone of control animals but it was impaired in ZA treated rats. Such an in vivo antiangiogenic effect of BPs could play a role in the pathophysiology of ONJ.

Le travail de cette thèse a permis de comparer les adaptations mises en place par le système nerveux après différentes méthodes d’altération et de récupération. Nos deux premières études portaient sur l’altérations de la réponse des afférences musculaires suite à une injection de toxine botulique. La troisième étude analysait la relation entre le phénotype musculaire et la réponse des afférences métabosensibles. Les deux dernières études analysaient si le vieillissement et l’activité physique altéraient la boucle sensori-motrice et la réponse des afférences métabosensibles. Les résultats de ce travail de thèse indiquent que la réponse des afférences mécano- et métabosensibles ont des profils de récupération qui diffèrent et que la réponse des afférences métabosensibles est dépendante en partie du phénotype musculaire. Enfin, le vieillissement induit une altération la boucle sensori-motrice, et l’entrainement permet de récupérer selon les muscles. L’activité des afférences métabosensibles est aussi altéré par les vieillissement mais l’entrainement ne permet pas de récupération. / This thesis work compared nervous system adaptations after different methods of alteration and recovery. The two first studies were about muscle afferents response alterations following botulinum toxin injections. The third study analyzed the relation between muscle phenotype and metabosensitive response. The two last studies analyzed whether aging and physical activity could alter the metabosensitive response and the sensory-motor loop. Results indicate that mechano- and metabosensitive afferents response have different recovery pattern and that metabosensitive afferents response is in part dependent on the muscle phenotype. Aging results indicate an alteration of the sensory-motor loop and depending on the muscle, training allows a recovery. Metabosensitive afferents response is also altered but training does not induce a recovery.