by Clifford Sanders. / Thesis (M.S.)--Florida Atlantic University, 2009. / Includes bibliography. / Electronic reproduction. Boca Raton, Fla., 2009. Mode of access: World Wide Web. / Ethylene is the simplest alkene. The carbon-carbon double bond is ubiquitous in the field of chemistry. Ethylene serves as the basis for understanding these molecules. Thus, the assignment of the electronic transitions in ethylene is an important endeavor that many scientists have undertaken, but are yet to decipher theoretically or experimentally. Synchrotron Radiation in the vacuum ultraviolet region allows for magnetic circular dichroism (MCD) measurements of ethylene and other simple alkenes. Studies of ethylene and propylene revealed that the páap* (AgáaB1u ethylene notation) transition is not the lowest energy transition. The páa3s(R) (AgáaB3u ethylene notation) is the lowest energy transition. To further this investigation, MCD and absorption measurement were carried out on isobutene. The isobutene spectra clearly showed four electronic transitions in the 156 to 212 nm wavelength region. These four isobutene transitions have been assigned as páa3s, páap*, páa3p(Sv (Band páa3px proceeding from lower energy to higher energy. The present results support the assignments in ethylene and propylene.

Neste trabalho, apresentamos resultados da caracterização Magneto-Óptica de íons terras-raras (Nd3+ e Yb3+) em monocristais de niobato de lítio (LiNbO3). Medidas de Dicroísmo Circular Magnético (MCD) e de Emissão Circularmente Polarizada em Presença de Campo Magnético (MCPE) foram realizadas pela primeira vez nesses sistemas. Os resultados foram obtidos à temperatura de 2K, e em campos magnéticos de até 5 T. Através desses estudos, foi possível identificar os números quânticos cristalinos (&#956) dos subníveis Zeeman desses íons. A partir da dependência do sinal de MCD com a intensidade de campo magnético, determinou¬se o fator giromagnético efetivo g// do estado fundamental de cada íon, obtendo-se os valores: g//Nd = (1,4 &#177 0,1) e g//Yb = (4,7 &#177 0,1). Esses valores foram confirmados através de medidas de espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR), realizadas a baixa temperatura (4-8 K), em banda X. Os espectros de EPR foram tomados em função da orientação relativa do campo magnético externo com o eixo c cristalino dos cristais, em 3 planos perpendiculares entre si. Os espectros de EPR mostram a existência de diferentes sítios ocupados pelos íons terras-raras. O sítio mais populado tem simetria axial, e para esse centro determinaram-se os fatores g efetivos g//Nd = (1,440 &#177 0,005) e g//Nd = (2,959 &#177 0,004), para o íon Nd3+, e g//Yb = (4,705 &#177 0,008) e g//Yb = (2,693 &#177 0,005) para o íon Yb3+. Espectros de MCD e MCPE obtidos para um cristal de rubi ilustram as convenções utilizadas e atestam que o sistema experimental funciona adequadamente. Os espectros obtidos nessa amostra também são originais, tendo sido resolvidas as transições permitidas com luz circularmente polarizada entre os subníveis Zeeman correspondentes aos níveis de energia 4A2 e &#8254E (2E) do íon Cr3+. / In this work we present Magneto-Optícal characterizations of rare-earth ions (Nd3+ e Yb3+) in lithium niobate (LiNbO3) single crystals. Magnetic Circular Dichroism (MCD) and Magnetic Circularly Polarized Emission (MCPE) measurements were performed for the first time on those systems. Spectra were obtained at 2K and at magnetic field strength up to 5T. From these studies, it was possible to assign the crystal quantum number (&#956) of the Zeeman sublevels of these ions, so that the sign and allowance of the electronic transitions could be predicted. From the dependence of suitable MCD spectral lines on the magnetic field strength, the effective parallel gyromagnetic factor (g//) of the ground state for each of the rare earth ions has been determined to be: g//Nd = (1,4 &#177 0,1) e g//Yb = (4,7 &#177 0,1). These values are in dose agreement to those obtained by means of Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy, at 4-8 K, and at X-band frequency. EPR spectra were recorded as a function of the external magnetic field orientation relative to the c crystalline axis in three mutual perpendicular planes. These spectra show evidence of multiple sites occupied by the rare-earth ions. For the most intense line seen in the spectra of each ion, it could be clearly assigned a site with axial symmetry, with effective g factors of g//Nd= (1,440 &#177 0,005) and g//Nd = (2,959 &#177 0,004), for the Nd3+3+ ion, and g//Yb = (4,705 &#177 0,008) and g//Yb= (2,693 &#177 0,005) for the Yb3+ ion. MCD and MCPE spectra recorded for a ruby crystal shows the experimental conventions used so far in this work, as well as assure that the experimental system works properly. These results are original ones, by means of which, the spectral transitions between the Zeeman sublevels of the 4A2 and &#8254E (2E) of the Cr3+ ions in ruby could be resolved.

Usando-se a técnica de dicroísmo ótico induzido sobre a banda de absorção ótica em 272m devido o íon Pb++ em NaCl estabelecemos a simetria desse defeito. O momento dipolar com a vacância na posição 110 foi de 3.65 e &#197. Usando-se a mesma técnica além de I.T.C. conseguimos a reorientação dipolar do dipolo I.V. na temperatura de 77&#176K. Essa relaxação é atribuída ao fato do íon Pb++ estar em estado eletrônico excitado. / Using the electric induced dichroism effect on the optical absorption band at 272m due to the Pb++ ion in NaCl, the symmetry of I.V. dipole was discussed. The electric dipole moment for the vacancy in the (110) position was measured and found to be 3.65 &#197. Using the same technique and I.T.C. measurements we found reorientation in temperatures as low as 77&#176K. This relaxation is attributed to be I.V. dipole with the Pb++ ion in an electronic excited state.

Utilizando cristais de KCl:SH- dopados com centros F2+ na ausência de centros F e F2, permitiu-nos estudar o Dicroísmo Circular Magnético (DCM) em absorção das transições 1s ?g(493?m) e 1s ?g - 2py?w (509 ?m) como função do campo magnético de 0 < H < 48 KG e temperatura entre 1.5 < T < 77K. A transição 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) em absorção não apresentou DCM dentro do limite de detecção de nosso equipamento (1.2 X 10-4); o mesmo aconteceu com a transição (2p?w- 1s ?g) em emissão (1.2 X 10-4). Irradiando com luz polarizada na banda ?, os centros F2+ se .reorienta ao longo da direção [110] em até 1.5 K, apresentando uma forte birrefringência. Medidas em absorção com centros F2+ alinhados em várias geometrias, permitiu estudar a contribuição ao DCM de cada orientação do defeito. Apresentamos um modelo teórico em bom acordo com os resultados experimentais. Utilizando uma técnica de Detecção óptica de EPR, determinamos o fator de Landé para o estado fundamental (g =1.965 ± 0.007) e o tempo de relaxação spin-rede do estado fundamental a H = 3.2 KG, que é típico do processo direto T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT). / Using KCl:SH- doped with F2+ centers without F and F2, we studied the Magnetic Circular Dichroism (MCD), in absorption of yhe transition 1s ?g(493?m) and 1s ?g - 2py?w (509 ?m) as a function of the magnetic field 0 < H < 48 KG and temperature 1.5 < T < 77K. The transition 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) does not present any MCD within the limit of detection of our equipament (1.2 X 10-4); No dichroism has been observed in emission in the 2p?w- 1s ?g transition (1.2 X 10-4). F2+ centers reorient along the [110] direction down to 1.5 K by polarized light excitation in the ? bands and present a strong birefringence. Measurements in absorption with aligned F2+ in various geometry allows as to determine the contribution of each orientation to the DCM. A theorical model is presented in good agrement with the experimental results. The optical detection of the EPR in X-band give the Landé factor af the graund state is g =1.965 ± 0.007) and the spin-lattice relaxation measured at H = 3.2 KG is typical of a direct process T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT).

Metaloproteases/desintegrinas (MD) isoladas de venenos de serpentes são potentes inibidores de agregação plaquetária e de adesão celular, processos envolvidos em doenças como trombose e câncer. As MD pertencem a classe PIII das SVMPs (´snake venom metalloproteinases´) que são constituídas por três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) e rico em cisteína (C). A função dos três domínios nas atividades das moléculas ainda não é totalmente conhecida, e estudos com o objetivo de esclarecer suas funções são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Algumas proteínas da classe PIII apresentam elevada atividade auto-proteolítica (liberando peptídeo constituído dos domínios D e C) enquanto que em outras PIII esta atividade não é menos evidente. Neste trabalho nós estudamos MD isoladas de veneno de Bothrops jararaca (bothropasina) e Bothrops alternatus (alternagina) em relação aos seus processos de autólise. Alternagina e bothropasina apresentaram diferentes comportamentos em relação à auto-proteólise, apesar do elevado grau de identidade entre as duas moléculas. Nesse trabalho, caracterizamos a estabilidade química e o comportamento de desenovelamento da proteína alternagina nativa pela guanídina HCl usando emissão de fluorescência intrínseca em combinação com espectroscopia de dicroísmo circular ´far´-UV. As amostras de alternagina, purificadas do veneno liofilizado, foram monitoradas por dicroísmo em comprimento de onda de 220nm e os resultados mostraram estruturas intermediárias no processo de desnaturação da proteína. Estudos semelhantes foram feitos com a bothropasina, com o objetivo de relacionar seus diferentes comportamentos auto-proteolíticos com os processos de desnaturação. Nas duas proteínas ocorreu uma alta correlação entre os estudos de auto-proteolise e de desnaturação. As MD isoladas de B. jararaca, jararagina e bothropasina, são isoformas descritas na literatura como isoláveis através de diferentes cromatografias. Neste trabalho, utilizamos os diferentes protocolos descritos para verificar a porção da isoforma majoritária no veneno. As amostras de proteína serão analisadas por espectrometria de massas, uma vez que a região N-terminal das proteínas está bloqueada. / Metalloproteinases/disintegrin (MD) isolated from snake venom are potent inhibitors of platelet aggregation and cell adhesion, processes involved in illnesses as cancer and thrombosis. MD belong to the PIII class of the metalloproteinase/disintegrin gene family and they are constituted by three domains: the catalytic domain, metalloprotease; disintegrin-like (D) and cysteine-rich (R). Some MD proteins are rapidly processed (producing the disintegrin-like/ cysteine-rich domains), while others MD are processed slowly. In this work, we studied the autolysis process of the MD isolated from the venom of Bothrops jararaca (bothropasin) and Bothrops alternatus (alternagin). Despite high sequence identity, alternagin and bothropasin showed different autolysis processes. The processing of the alternagin produces an intermediate with molecular mass of 43kDa whereas in the processing of the bothropasin this intermediate is almost not observable. In this work we studied alternagin and bothropasin under the viewpoint of chemical stability and the unfolding process to guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) using dichroism circular and fluorescence spectrometry. The CD spectra (220nm) of the alternagin purified from the lyophilized venom showed an intermediate structure in the unfolding process. These studies were performed on bothropasin with the goal to relate the autolysis and unfolding process. These studies revealed a high correlation between both proteins . The MD isolated from B. jararaca, jararagin and bothropasin, are isophorms purified from different chromatograph processes reported in the literature. In this work, different purification processes were used to check the major isophorm. Due to the blocked N-terminal region, these proteins will be assessed by mass spectrometry.

Os estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação. / Our current understanding of the protein folding mechanism is the result of intense study employing biophysical, biochemical and theoretical methods. \"In vitro\", the initial state of the protein in this puzzle is its unfolded form. In the present work we have studied the refolding, after thermal denaturation, of the glycoprotein frutalin, a member of the lectin class. The main characteristic of these proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine with glycocomponents of the cell surface, leading to their biological properties. Frutalin is a tetrameric lectin extracted from the seeds of Artocarpus incisa. It is D-galactose specific and its native CD spectrum was identified as being dominated by ? -sheet. The thermal unfolding and refolding steps were measured by CD and fluorescence spectroscopies together with the loss of hemagglutinating activity. The unfolding conditions used were 60°C for 30 to 60 minutes, depending on the protein storage time. The results indicate that refolding is promoted by the freezing process in the presence of 0,1 M D-galactose-PBS followed by three-fold concentration in a Centriprep 3. Positive hemagglutination occurred for both the native and refolded forms. Refolding of denatured frutalin also occurred with PBS containing 0,1 M D-glucose. When the unfolded form was concentrated before freezing in PBS without D-galactose or in PBS containing xylose, refolding did not occur. These results show that the refolding of frutalin is dependent on the binding of D-galactose or D-glucose, and demonstrate the importance of freezing in order to obtain the biologically activity form. An analysis of secondary structure using the CCA program showed an important result: the native form, presented 85% ? -sheet/ ?-turns, while in the refolded form, this content fell to 73%. These results show that the refolded form is very similar to the native protein, which is in agreement with the hemagglutination results.

O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros. / Protein refolding is currently a fundamental problem in biophysics and molecular biology. We have studied the refolding process of jacalin and frutalin. They are tetrameric lectins that present structural homology, buti jacalin shows a more marked biological activity than the latter. These proteins, despite their homology, have different unfolding/refolding behaviors as function of temperature and chemical agents. Both proteins were unfolded induced by guanidine hydrochlroide and their dnaturation curves mesuared by fluorescence emission and CD. Fluorescence measurments of frutalin gave values of conformational stability of 17.12 kJ/mol and 12.32 kJ/mol, in the presence and absence of D-Galactose, while jacaline gave values of 8.12 kJ/mol for NI transition and 5.61 kJ/mol for IU transition in PBS. In sugar presence the values are similar. In the frutalin studies were separeted the native, unfolded, refolded and a distinct molecular form denoted misfolded, by Size Exclusion Chromatography. These forms were analyzed for hemagglutination activity, CD and fluorescence spectroscopy. All the results obtained confirmed the successful refolding of the both lectins and the refolded monomers, after adopting their native three-dimensional structures, spontaneously assembled to form tetramers.

Zinc is the second most abundant transition metal in biological systems. This cation is required for the catalytic activity of hundreds of enzymes which mediate protein synthesis, DNA replication and cell division. Despite the central importance of zinc in cellular homeostasis, the mechanism of zinc uptake, compartmentalization and efflux is unknown. Recently, a family of proteins, called ZIP, has been shown to control zinc uptake. Mutations in one of the genes coding for these proteins (ZIP4) can lead to potentially life-threatening diseases like Acrodermatitis Enteropathica and high levels of ZIP4 have been detected in patients suffering from pancreatic cancer. Therefore our goal is to investigate the mechanism of ZIP4 transport and regulation. It was previously shown that the intracellular loop between transmembrane III and IV (M3M4) of ZIP4 is ubiquitinated in the presence of high intracellular zinc which lead to protein degradation. Our initial hypothesis was that the large intracellular domain of ZIP4 (M3M4) is a sensor which detects the intracellular concentration of zinc and regulates the surface expression of ZIP4. In order to test this hypothesis we expressed and purified the M3M4 domain to examine the ability of M3M4 to bind zinc. Our results have demonstrated that M3M4 binds zinc with a 2:1 zinc:protein stoichiometry with nanomolar affinity. We have also shown that upon binding of zinc, M3M4 undergoes a large conformational change.

Montamos um espectrômetro o qual nos permite obter dados de atividade ótica Dispersão Rotatória (DRO) e Dicroísmo Circular (DC) simultaneamente. O sistema ótico consiste de uma fonte de luz, um monocromador, um suporte para amostra, um analisador gigante e um detector de luz. O analisador girante é sustentado por um mancal pneumático e gira usando um motor de passo, o qual é controlado por um microcomputador. Um outro motor de passo também controlado por microcomputador é usado para girar a grade de difração do monocromador. Para obter os espectros de DRO e DC, o monocromador pára em um certo comprimento de onda, enquanto o eixo de transmissão do analisador é posicionado em &#946= 0&#176, 45&#176, 90&#176 e -45&#176 relativo ao eixo de transmissão do polarizador. O microcomputador através do detector de luz lê as quatro intensidades de luz e usando um formalismo desenvolvido por nós, relaciona-as à elipticidade e a rotação ótica naquele comprimento de onda. O monocromador é então girado a um novo comprimento de onda e o procedimento é repetido. No final, os espectros de DC e DRO podem ser mostrados em uma Tabela ou com um Gráfico. Além de funcionar como um espectropolarímetro, o equipamento pode ser usado também como um espectrofotômetro, para acompanhar cinética de reação, para medir dicroísmo linear, etc... Devido à relação sinal/ruído, temos nos ângulos medidos, uma resolução de 1&#186 / We have assembled a spectrometer which provides the optical activity data Optical Rotatory Dispersion (ORD) and Circular Dichroism (CD) simultaneously. The Optical System consists of a source of light, a monochromator, a polarizer, a sample holder, a rotating analyzer and a light detector. The rotating analyzer is supported by a pneumatic bearing and rotates using a step motor which is controlled by a microcomputer. Another spet motor also controlled by the microcomputer is used to rotate the diffraction grating of the monochromator. To obtain the ORD and CD spectra, the monochromator stops at a certain wave length, while the transmission axis of the analyzer is positioned at &#946= 0&#176, 45&#176, 90&#176 e -45&#176 relative to the transmission axis of the polarizer. The microcomputer through the light detector reads the four light intensities and using the formalism developed by us relates them to the elipticity and optical rotation at that wavelength. The monochromator is then rotated to a new wavelength and the procedure is repeated. At the end the CD and ORD spectra can be shown in a Table or as a graph. Besides functioning as a spectropolarimeter, the equipment can be use also as a regular spectrometer, to follow kinetic of recreations, to measure linear dichroism, etc Due to the signal/noise ratio we have in the measured angles a resolution of 1&#176

The work presented in this thesis deals with the structural and functional properties of peptides at surfaces. The interaction of peptides with surfaces is an ever so common occurrence in our every day life, from the bug squashed on the windshield of our car to the barnacle on our boat, and from the blood plasma used in the hospital to the proteins in our cells. The effect these occurrences has on our lives is diverse, the bug is annoying whereas the barnacle settlement of ship hull is costly for marine transportation, the blood plasma contains components of vital importance for our immunological defense system and the proteins in our cells are crucial for regulatory processes and life.One part of this thesis, performed as a part of the EU-founded project AMBIO, deals with the concept of marine biofouling. A number of short peptides have been designed, synthesized, and used to investigate their effect on the settlement on marine biofoulers, such as the Ulva linza algae and the Navicula diatom, on template surfaces coated with thin layers of these molecules. The surfaces have been thoroughly investigated with respect of their physio-chemical properties before and after submersion in artificial seawater and ultimately in suspensions containing the organisms. The most interesting results were obtained with an arginine-rich peptide coating that when introduced to Ulva linza zoospores, displayed extensive settlement, compared to reference surfaces. In addition, a large fraction of the settled spores had an abnormal morphology.The other part of this thesis is focused on designed peptides that when adsorbed on a negatively charged surface adopts a well-defined secondary structure, either α-helical or β-sheet. Precisely placed amino acids in the peptides will strongly disfavor structure in solution, primarily due to electrostatic repulsion, but when the peptides are adsorbed on the negatively charged surfaces, they adopt a well-defined secondary structure due to ion pair bonding. These interactions have been thoroughly investigated by systematic variations of the side-chains. In order to determine the factors contributing to the induced structure, several peptides with different amino acid sequences have been synthesized. Factors that have been investigated include 1) the positive charge density, 2) distribution of positive charges, 3) negative charge density, 4) increasing hydrophobicity, and 5) incorporating amino acids with different helix propensities. Moreover, pH dependence and the effect of different interaction partners have also been investigated. It has also been shown that the system can be modified to incorporate a catalytic site that is only active when the helix is formed. This research will increase our understanding of peptide-surface interactions and might be of importance for both bionanotechnology and medicine.