Utilizando cristais de KCl:SH- dopados com centros F2+ na ausência de centros F e F2, permitiu-nos estudar o Dicroísmo Circular Magnético (DCM) em absorção das transições 1s ?g(493?m) e 1s ?g - 2py?w (509 ?m) como função do campo magnético de 0 < H < 48 KG e temperatura entre 1.5 < T < 77K. A transição 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) em absorção não apresentou DCM dentro do limite de detecção de nosso equipamento (1.2 X 10-4); o mesmo aconteceu com a transição (2p?w- 1s ?g) em emissão (1.2 X 10-4). Irradiando com luz polarizada na banda ?, os centros F2+ se .reorienta ao longo da direção [110] em até 1.5 K, apresentando uma forte birrefringência. Medidas em absorção com centros F2+ alinhados em várias geometrias, permitiu estudar a contribuição ao DCM de cada orientação do defeito. Apresentamos um modelo teórico em bom acordo com os resultados experimentais. Utilizando uma técnica de Detecção óptica de EPR, determinamos o fator de Landé para o estado fundamental (g =1.965 ± 0.007) e o tempo de relaxação spin-rede do estado fundamental a H = 3.2 KG, que é típico do processo direto T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT). / Using KCl:SH- doped with F2+ centers without F and F2, we studied the Magnetic Circular Dichroism (MCD), in absorption of yhe transition 1s ?g(493?m) and 1s ?g - 2py?w (509 ?m) as a function of the magnetic field 0 < H < 48 KG and temperature 1.5 < T < 77K. The transition 1s ?g, 2p? (1.4 ?m) does not present any MCD within the limit of detection of our equipament (1.2 X 10-4); No dichroism has been observed in emission in the 2p?w- 1s ?g transition (1.2 X 10-4). F2+ centers reorient along the [110] direction down to 1.5 K by polarized light excitation in the ? bands and present a strong birefringence. Measurements in absorption with aligned F2+ in various geometry allows as to determine the contribution of each orientation to the DCM. A theorical model is presented in good agrement with the experimental results. The optical detection of the EPR in X-band give the Landé factor af the graund state is g =1.965 ± 0.007) and the spin-lattice relaxation measured at H = 3.2 KG is typical of a direct process T1-1 = 4.3 X 10-2cotgh(g?H/2kT).

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Clovis Ryuichi Nakaie / Banca: Hosana Maria Debonsi Navickiene / Resumo: Este trabalho descreve a sintese, a relacao estrutura-funcao, a interacao com membranas e a atividade biologica de um peptideo proveniente da regiao amino-terminal da proteina Esticolisina II (St II). Esta proteina e uma citolisina pertencente a familia das actinoporinas, obtida da anemona marinha Stichodactyla heliantus. Estudos estruturais e biologicos da proteina nativa indicam que a regiao amino-terminal da St II participa do processo de formacao de poros em membranas. Deste modo, visando compreender o comportamento e a importancia dessa regiao para a atividade biologica da St II, 3 analogos contendo os 30 primeiros residuos que compoem a extremidade amino-terminal da St II foram sintetizados e analisados. Os peptideos foram obtidos mediante sintese em fase solida modificando-se um residuo de leucina ou isoleucina por triptofano nas posicoes 2, 7 ou 24. Os estudos conformacionais foram realizados atraves das tecnicas de fluorescencia e dicroismo circular. Para avaliar o comportamento estrutural dos peptideos em solucao, foram realizados estudos de variacao de pH, forca ionica e titulacao com um agente indutor de estrutura, o trifluoroetanol (TFE). Na interacao com mimeticos de membranas, os peptideos foram titulados por tres tipos de detergentes: dodecil-sulfato de sodio (SDS), HPS (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano-sulfonato) e LPC (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3- fosfocolina). Complementando o estudo acima, tambem foram realizados experimentos utilizando acrilamida como agente supressor de fluorescencia. Os resultados obtidos demonstram que a estrategia de sintese de peptideos em fase solida atraves do protocolo Fmoc/tBu, utilizada na sintese dos peptideos deste trabalho, foi viavel. O processo de purificacao dos peptideos atraves de HPLC tambem se mostrou eficiente e viabilizou a obtencao do material com alto indice de pureza. / Abstract: In this study, we describe the synthesis, the relation function-structure, the interaction with membranes and the biological activity of the N-terminus region of the protein Sticholysin II (St II). This protein is a citolisin, which belongs to the family of the actinoporins, purified from the sea anemone Stichodactyla heliantus. According to biological and structural studies of the native protein, the N-terminus region of St II is involved on the pore formation process in membranes. In order to elucidate the function and the importance of this region to the biological activity of St II, three analogs containing the first 30 residues of the N-terminus region of St II were synthesized and analyzed. The peptides were obtained by solid phase synthesis and altered through the substitution of a leucine or isoleucine for a tryptophan on the positions 2, 7 and 24. Circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence studies have been carried out to investigate conformational properties of the peptides. In order to evaluate the structural modification on aqueous solution, studies were performed in order to evaluate the pH, ionic strength and addition of the secondary structural-inducing solvent TFE. The interaction studies with micelles were performed using three different surfactants: sodium dodecil-sulfate (SDS), N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammoniumpropanesulfonate (HPS) and lysophosphatidylcholine (LPC), and using acrylamide as a fluorescence suppression agent. We have demonstrated that on solid phase peptides synthesis using the Fmoc/tBu strategy is a success. The purification process of peptides through HPLC, has also revealed to be efficient, once the material was obtained with high purity level above 95%. The experiments of hemolytic activity showed that the three peptides have activities in æM concentration, this results reinforce the idea that the 30 residues of the N-terminus region have an important role on pore formation in membranes. / Mestre

Resumo: Este trabalho abordou a determinação quali e quantitativa de enantiômeros de catequinas em extratos e infusões das folhas de espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae), tais como: B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia e B. verbascifolia. O trabalho descreve a determinação rápida e eficiente de catequina, ent- catequina, epicatequina e ent-epicatequina por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos e dicrísmo circular, usando coluna de fase estaconária quiral. O método possui alta seletividade e permite identificar inequivocadamente diastereômeros de catequinas em matrizes complexas como extratos vegetais, com limites de detecção (0,42 a 0,77 μg mL-1 ) e quantificação (1,27 a 2,32 μg mL-1 ) satisfatórios para as condições analisadas, e valores de precisão (0,3 to 4,8%) e exatidão (70,0 a 110,2%) recomendados pela ANVISA. Com exceção da espécie B. intermedia, quatro espécies do gênero apresentaram em seus extratos e infusões os diastereômeros catequina, epicatequina e ent-epicatequina. Experimentos para avaliar a epimerização da catequina indicaram que a incomum ent-epicatequina não é um artefato, podendo ser um produto do metabolismo de espécies do gênero Byrsonima. Enantiômeros da catequina apresentam diferentes atividades farmacológicas, o que pode causar a ocorrência de efeitos colaterais diversos, danosos à saúde humana. Portanto, esses resultados podem alertar quanto ao consumo indiscriminado de plantas medicinais pela população e contribuir para criação de políticas mais rigorosas no controle de qualidade de fitoterápicos no Brasil / Abstract: This work deals with the qualitative and quantitative determination of catechin and epicatechin enantiomers both in extracts and infusions from the leaves of the Byrsonima (Malpighiaceae) species (B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia and B. verbascifolia). This work describes a simple and reliable analytical high performance liquid chromatographic (HPLC) method coupled with photodiode array detector and circular dichroism for simultaneous determination of catechin, ent-catechin, epicatechin and ent-epicatechin. The direct separation was obtained in normal phase by HPLC using chiral stationary phase. The method has high selectivity. Regardless of variations in retention time, it was possible to identify unequivocally the enantiomers of catechin and epicatechin in complex matrices like plant extracts with satisfactory limit of detection (0.42 to 0.77 μg mL-1 ) and limite of quantification (1.27 to 2.32 μg mL-1 ). Under the conditions used, precision values were 0.3 to 4.8%, whereas accuracy values were 75.0 to 110.2%, recommended by ANVISA. Aside from B. intermedia specie, the other four Byrsonima species presented catechin, epicatechin and ent-epicatechin diastereomers both in methanolic extract and infusions. Experiments were carried out for verification the possibility of catechin epimerization. It was observed that the unusual ent- epicatechin was not an artifact, but product of Byrsonima species metabolism. Enantiomers of catechin present dissimilar pharmacological activities, which may cause the occurrence of various side effects, harmful to human health. Therefore, these results may warn about the indiscriminate use of medicinal plants by the population and contribute to the quality control of Brazilian herbal medicines / Orientador: Wagner Vilegas / Coorientador: Lourdes Campaner dos Santos / Banca: Mary Rosa Rodrigues de Marchi / Banca: Maysa Furlan / Banca: José Arimatéia Dantas Lopes / Banca: Suzana da Costa Santos / Doutor

Orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Angela Regina Araujo / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Daniel Rinaldo / Banca: Edson Rodrigues Filho / Resumo: Levando em consideração a diversidade química das estirilpironas isoladas de Cryptocarya mandioccana, este trabalho teve por objetivo estudar o mecanismo de fragmentação de 6 dessas substâncias por ESI-MS/MS e por GC-EI-MS e também determinar a configuração absoluta dos centros metínicos hidroxilados e do centro C6 do anel pirônico. Foram isoladas seis estirilpironas polihidroxiladas: desacetilcriptocarialactona (1), criptomoscatona D1 (2), criptomoscatona E2 (3), criptomoscatona E1 (4), criptomoscatona E3 (5) e criptomoscatona F1 (6). As análises por ESI-MS/MS e os cálculos teóricos indicaram que em fase gasosa os sítios de protonação e cationização das estirilpironas ocorrem no oxigênio carbonílico, similarmente aos anéis lactônicos descritos na literatura. O mecanismo de fragmentação proposto para as estirilpironas cationizadas com Na+ é comum a todas, apresentando perda neutra de C10H12O [M+Na148]+ e as substâncias tri-hidroxildas sofreram uma segunda fragmentação com perda neutra de acetaldeído [M+Na14844]+. Nos espectros de massas de íons totais não é observado o íon referente às moléculas protonadas [M+H]+, mas sim o íon [M+HH2O]+ referente à perda de água, portanto uma dissociação na fonte. Assim como para a espécie cationizada, este íon foi submetido à CID e no espectro MS/MS é observado novas eliminações de água referentes as perdas das demais hidroxilas, íons [M+HnH2O]+, e posteriormente abertura do anel pirônico e eliminação de mais uma molécula de água, seguida de CO [M+HnH2OCO]+. A derivação das estirilpironas com MSTFA permitiu analisá-las por CG-MS, porém em quase todos os casos não foi possível detectar o íon molecular. O pico base sempre é referente ao cátion de TMS (m/z 73), comum para substâncias derivadas com este reagente, enquanto que os outros íons fragmentos são resultantes da clivagem homolítica... / Abstract: Taking into account the chemical diversity of styrylpyrones isolated from Cryptocarya mandioccana, this work aimed to study the mechanism of fragmentation of six compounds belonging to this class by means of ESI-MS/MS and GC-EI-MS analysis and also to assign the absolute configuration of hydroxylated methinic centers and that at C6 in the pyrone ring. Six styrylpyrones poli-hydroxilated: desacetilcryptocaryalactone (1), cryptomoscatone D1 (2), cryptomoscatone E2 (3), cryptomoscatone E1 (4), cryptomoscatone E3 (5), e cryptomoscatone F1 (6) were isolated. Analysis by ESI-MS/MS and data from theoretical calculations in gas phase suggest the carbonyl oxygen as protonation and cationization site of the styrylpyrones, which is in accordance to data reported for the lactone rings. The fragmentation mechanism proposed for cationized styrylpyrones with Na+ is common to compounds 1-6, with loss of neutral C10H12O [M+Na148]+. Tri-hydroxylated substances showed a second fragmentation with loss of an acetaldehyde unit [M+Na14844]+. Although it was not possible to observe the protonated molecule ions [M+H]+ in the MS total ion spectrum, the ion [M+HH2O]+ referring to water loss was observed, which indicates in-source dissociation. As for the cationized species, this ion was subjected to CID process and the MS/MS spectrum showed an additional water loss related to a second hydroxyl group, ions [M+HnH2O]+. It was then followed by pyrone ring-opening and eliminations of a water molecule and CO [M+HnH2OCO]+. Derivatization of the styrylpyrones with MSTFA was conducted to allow the analysis by GC-MS. On the mass spectra, in almost all cases, it was not possible to detect the molecular ion, and the base peak was always related to cation TMS (m/z 73). This ion is common for substances derived with this reagent, while the others ions are fragments resulting from the homolytic β cleavage with... / Doutor

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: Amando Siuiti Ito / Banca: Sebastião R. Taboga / Banca: Manoel de Arcísio Miranda Filho / Banca: Marcia Perez dos Santos Cabrera / Resumo: Peptídeos bioativos são de grande interesse como substitutos de antibióticos e quimioterápicos convencionais já que, alguns deles apresentam atividades antimicrobiana, antifúngica e/ou anticâncer. Eles são predominantemente catiônicos e sua atividade tem se mostrado ser modulada por interações eletrostáticas, contribuições hidrofóbicas e por características elásticas da membrana, o seu alvo. O peptídeo mastoparano Polybia MP1 (MP1) possui dois resíduos ácidos (D2 e D8) e três resíduos básicos (K4, K5 and K11), que somados ao C terminal amidado conferem a ele uma carga elétrica líquida relativamente baixa, Q= +2. Nesta tese, foi analisada a importância da sequência de aminoácidos do MP1, da sua carga elétrica líquida e da sua hidrofobicidade média na interação com distintas membranas modelo, já que a presença de resíduos ácidos é rara dentre os peptídeos bioativos e além disto, o MP1 apresenta elevadas atividades antimicrobiana e anticâncer sem ser hemolítico. Para entender a sua especificidade e o seu mecanismo de ação em células bacterianas e de câncer, a atividade e a afinidade do MP1 foi acessada através de espectroscopia de fluorescência e de dicroísmo circular, medidas de potencial eletrocinético e de espalhamento de luz dinâmico e microscopia confocal. Estas técnicas permitiram a observação da estruturação do peptídeo, da sua partição da água para a interface de membranas modelo, da sua atividade lítica e da agregação dos lipossomos devido a sua adição. Assim, foi possível estimar as contribuições energéticas envolvidas no sistema além das dimensões dos danos causados pelo MP1 na superfície da membrana. MP1 mostrou que sua baixa carga elétrica líquida e a presença de dois resíduos ácidos na sua sequência de aminoácidos apresentam um papel importante em modular a sua estruturação e a sua atividade em uma ampla gama de composições lipídicas. Isso é atribuído... / Abstract: Bioactive peptides are of high interest as substitutes of conventional drugs since some of them present antimicrobial, antifungal and/or anticancer action. They are predominantly cationic and it has been shown that their activity is modulated by electrostatic interactions, hydrophobic contributions and the elastic features of the membranes their target. The mastoparan peptide Polybia MP1 (MP1) possesses two acidic residues (D2 and D8) and three basic ones (K4, K5 and K11), which together with the amidation of the C-terminal confers to it a relatively low net charge Q=+2. In this thesis, we analyzed the importance of the MP1 amino acid sequence, charge and hidrophobicity to the interaction with distinct model membranes, since the presence of acidic residues is a rare characteristic among the bioactive peptides and, beyond this, MP1 presents high antimicrobial and anticancer activities without being hemolytic. In search of understand its specificity and mechanism of action for bacteria and cancer cells, the activity and affinity of MP1 was assessed through circular dichroism and fluorescence spectroscopy, electrophoretic and dynamic light scattering measurements, and confocal microscopy. These techniques allowed the observation of the peptide structuration, the peptide partitioning from water to the model membranes interface, the peptide lytic activity, and the liposome aggregation due to peptide addition. From this, it was possible estimate the energetic contributions involved in the system, besides the dimension of the damages caused by MP1 on the membranes surface. MP1 showed that its low net charge and the presence of two acidic residues play an important role in modulating its structuration and activity in a wide range of lipid compositions, by equilibrating electrostatic and non-electrostatic contributions giving basis to understand its action as bioactive... / Doutor

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: Alexandre Suman de Araujo / Banca: Fernando Luis Barroso da Silva / Resumo: Peptdeos antimicrobianos possuem em geral cadeias curtas, carga líquida positiva devido ao excesso dos res duos b asicos e são ricos em amino acidos hidrof obicos. Possuem um grande potencial farmacológico, com atividade antimicrobiana modulada por interações eletrost aticas e hidrof obicas. Neste trabalho utilizou-se o pept deo sintético L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT ���� NH2), que devido aos res duos de acido asp artico e lisinas constituintes de sua cadeia, possui carga liquida +3, em pH neutro. Foram analisadas as insuficiências do pH e da carga de ves culas aniônicas na adsorçãao do pept deo. Este estudo utilizou medidas de potencial eletrocin etico de ves culas e experimentos de titulação monitorados por dicro smo circular (CD). A adsorção do L1A a LUVs de POPC e misturas POPC/POPG em diferentes proporções de POPG, foi medida nos pHs 4, 7 e 10. Os espectros de dicro smo circular dos peptídeos, na presença de vesícula, apresentaram caracter sticas de estruturas helicoidais, enquanto apresentaram estruturas desordenadas em tampão. As frações de hélices obtidas são maiores quando o pept deo adsorve em ves culas com maiores quantidades de POPG, indicando forte contribuição eletrost atica. As constantes aparentes de adsorção dos pept deos as membranas modelo foram calculadas atrav es da elipticidade de CD normalizada em 222 nm, obtidas por titulações de pept deo com ves culas. A a - nidade do pept deo a ves culas aniônicas e signi cativamente maior do que a ves culas zwitteriônicas, o que refor ca a import^ancia das interçõeoes eletrost aticas no processo de adsorção do pept deo na bicamada. O efeito conjunto de carga das ves culas e de pH resultaram em signi cativa regulação de carga do pept deo resultando em valores de carga efetiva alta em pH 4,0 devido a protonação dos res duos de asp artico. Em pH 10,0 a pequena carga efetiva calculada deve-se as desprotona ações do N-terminal e das lisinas... / Abstract: Antimicrobial peptides have in general short chains, positive net charge due to the excess of basic residues and are rich in hydrophobic amino acids. They have pharmacological potential as antimicrobial agents and their activity is modulated by electrostatic and hydrophobic interactions. In this work, we used the synthetic peptide L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT ���� NH2) that due to its acid and basic residues have an net charge +3, at neutral pH. The e ects of the pH and of the charges of anionic vesicles on the adsorption of L1A were analized. This study used measurement of electrokinetic potential of vesicles and titration experiments monitored by circular dichroism spectroscopy (CD). Adsorption of L1A to POPC and POPC/POPG LUVs in di erent POPG contents were assessed in the pH 4.0, 7.0 and 10.0. Circular dichroism spectra of the peptides in the presence of vesicles showed to features of helical structures; while random coil structures were observed at bu er for all the used pHs. The helical content was evaluated and showed to increase when the peptide adsorbs into vesicles with increasing amounts of POPG, indicating that there is a strong electrostatic contribution. Partition coe cients were calculated through the normalized CD ellipticities at 222 nm and showed that the a nity of the peptide for anionic model membranes is e ectively higher than those found for zwitterionic ones. It reinforces the importance of the electrostatic contribution to the process of peptide-lipid interaction. The coupled e ect of the vesicle charge and pH lead to signi cant charge regulation of the peptide resulting in high values of e ective charge at pH 4.0 due to the deprotonation of aspartic acid residues. At pH 10.0 the estimated e ective charge is small as a consequence of the deprotonation of both N-terminus and the lysines. The electrostatic and interfatial free energies seems to be additive only at pH 4.0, especially for the bilayers with higher content... / Mestre

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Patrícia Soares Santiago / Banca: Ederlan de Souza Ferreira / Resumo: Devido ao avanço científico e tecnológico, notável sucesso tem sido alcançado na identificação de novos compostos antitumorais. Entretanto, problemas associados à baixa estabilidade e seletividade tem limitado o sucesso da grande maioria destes compostos. Dentre as estratégias para aumentar a estabilidade de moléculas bioativas, a bioconjugação em domínios de ligação a albumina (DLA) tem se mostrado promissor para ampliar o tempo de vida médio de moléculas susceptíveis à degradação proteolítica. Neste trabalho, a estrutura e a atividade de um composto contendo um peptídeo citotóxico, um DLA e um sítio de clivagem específico foram avaliadas. Motivado pela perspectiva do peptídeo melitina apresentar atividade antitumoral, o nosso grupo de pesquisa avaliou a síntese e atividade biológica deste composto com o peptídeo RQKRSLGG-WQRPSSW. O peptídeo obtido foi testado contra tipos de celulas tumorais e não tumorais (linhagem MCF-7 e HaCaT, respectivamente), mostrando-se potente, porém tóxico. Nos estudos de dicroísmo circular, os peptídeos não apresentaram estrutura secundária em solução aquosa. Em presença de miméticos de membrana, os peptídeos adquiriram uma estrutura em α-hélice exceto o peptídeo sítio de clivagem-DLA. Estudos de vazamento de carboxifluoresceína em LUVs (POPC:POPS), através da técnica de espectroscopia de fluorescência, mostraram que o peptídeo completo tem capacidade de permeabilização similar ao da melitina e que é dependente da concentração. Os resultados de f... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the scientific and technological advanced permitted remarkable successful in the field of identification of new antitumour compounds. However, problems associated with low stability and selectivity have been a restriction in the successf ul of majority of this compounds. Inside the strategic for increase the stability of bioactive molecules, bioconjugation with albumin - binding domain (ABD) have been promising for increasing t he lifetime of molecules susceptible for the proteolytic degradat ion. Herein, structure and activity of a compound containing a cytotoxic peptide, ABD, and cleavage site were evaluated. The ABD (WQRPSSW) can give more stability for molecules, while the cle avage site RQKRSLGG can give more selectivity to the peptide. Thi s sequence is degraded for the protease Kallikrein 4 (KLK4), which occurs in elevated quantity in the tumours cells, releasing the cytotoxic compound, especially in the microenvironments of t hese cells, promoting the higher selectivity. Inspired for the pe rspective of Melittin peptide holds a promising antitumour activity, our research group evaluated the synthesis and biological activity with this peptide containing the sequence RQKRSLGG - WQRP SSW. The peptide was evaluated against diversity of tumours and n o tumours cells (MCF - 7 and HaCaT respectively), presenting effective activity but toxic. In circular dichroism studies the peptides did not show second structure in aqueous solution. In the p resence of membrane mimet... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Banca: Julio Cesar Borges / Resumo: Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo levaram à identificação da proteína RVB-1 de Neurospora crassa como capaz de se ligar a um fragmento de DNA contendo o motif STRE (Stress Responsive Element). Este elemento de DNA, em Saccharomyces cerevisiae, é descrito estar presente na região promotora de genes responsivos a estresse, incluindo o estresse térmico. Uma busca nos bancos de dados de proteínas mostrou que a RVB-1 apresenta homologia estrutural à proteína RuvBL1 de humanos. Além disso, esta proteína é descrita possuir uma proteína paráloga, RuvBL2 ou Rvb2 de humano e S. cerevisiae, respectivamente, cuja proteína ortóloga em N. crassa foi denominada RVB-2. As proteínas RuvBLs foram encontradas estarem associadas a vários processos celulares, muito provavelmente devido as suas capacidades de formar grandes complexos proteicos e possuírem atividade ATPásica. Neste trabalho, estas proteínas foram parcialmente caracterizadas do ponto de vista funcional, bioquímico e biofísico. Os resultados obtidos por microscopia de fluorescência mostraram que ambas apresentam localização nuclear quando o fungo foi exposto a estresse térmico. A análise da expressão da proteína RVB-V5 mostrou estar aumentada, nessa mesma condição ambiental, quando analisada por Western blot. As duas proteínas foram produzidas na forma recombinante em Escherichia coli, tanto isoladamente quanto juntas, e a análise da expressão mostrou alta estabilidade em solução quando ambas foram produzidas em uma me... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Previous work by our group identified the Neurospora crassa RVB - 1 protein as able of binding to a DNA fragment containing the Stress Responsive Element (STRE). In Saccharomyces cerevisiae, this element is present in the promoter region of genes responsive to stress, including heat stress. RVB - 1 shows structural homology to human RuvBL1 protein, and is described to have a paralog, the RuvBL2 or Rvb2 protein in human and S. cerevisiae, respect ively. The N. crassa orthologous protein was identified and named RVB - 2. The RuvBLs proteins have been found to be associated with diverse cellular processes, most likely due to their ability to form large protein complexes and to have ATPase activity. In this work, these proteins were functional, biochemical and biophysically characterized. The fluorescence microscopy results showed that both proteins present nuclear localization in the fungus exposed to heat stress. Analyses of protein expression by Weste rn blot showed an increased expression of the RVB - 1 - v5 protei n in this same condition . The two proteins were produced in Escherichia coli, and expression analyses showed higher stability in solution when both were produced together. Both proteins showed in vitro interaction by pulldown analysis. The RVB - 1/2 complex has the secondary structure mostly formed by α - helices as analysis by CD. The size - exclusion chromatography suggested that the complex present different oligomeric structures when analyzed in the absence a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Estudos anteriores mostram que o polímero Nafion® pode causar deslocamento do equilíbrio conformacional de proteínas em valores de pH que não o fisiológico. Nesse sentido, o Nafion® não só pode ser utilizado como uma sonda interessante para estudos estruturais de proteínas, mas, também, é importante entender seu papel na conformação da proteína. Portanto, a Albunina do Soro Bovino (BSA) foi escolhida como modelo para o estudo dos efeitos do Nafion® na conformação helicoidal de proteínas. A finalidade deste trabalho é entender as alterações na conformação e vizinhanças aromáticas da BSA, na faixa de pH de 2 a 12, na presença e ausência de Nafion®, que pode também revelar o papel do polímero na exposição dos aromáticos e nos processos de transferência de energia. As alterações da estrutura secundária foram medidas por Dicroísmo Circular e os espectros de fluorescência no estado estacionário foram usados para analisar as mudanças nas vizinhanças dos aromáticos. Os resultados mostraram a diminuição discreta do conteúdo helicoidal da conformação da BSA na região extremamente básica, pH 11 em relação à conformação em pH 7. Já na região ácida, pH 2, embora haja considerável diminuição do conteúdo helicoidal, a BSA ainda mantém quase 50% de sua conformação secundária regular. Em relação aos ambientes dos aromáticos triptofano e tirosina, a eficiência quântica da emissão de fluorescência diminui em regiões ácidas e básicas, indicando que, nessas estruturas, os aromáticos encontram-se em restrição conformacional em relação ao observado na proteína nativa. Estes resultados apontam para a mudanças na conformação da BSA em ambas as regiões: ácidas e básicas, incluindo mudanças das estruturas secundárias e nas vizinhanças dos aromáticos. A adição do Nafion®, por outro lado, acentua o deslocamento para o azul e diminuição da exposição dos aminoácidos, tanto em solução quanto em estado sólido. A estrutura secundária da proteína é completamente modificada pelo polímero na região ácida, e esta conformação é mantida nas regiões neutra e básica, sugerindo que o Nafion® não estabiliza estruturas helicoidais / Previous studies have shown that Nafion® can disturb the conformational equilibrium of some proteins when at pH other than physiological ones. In this sense, Nafion® can used to study protein conformation, but is also important to understand its interaction with the proteins. In this work, Bovine Serum Albimun (BSA) was chosen as a model to understand the modifications caused by Nafion® at helicoidal proteins conformation. More specifically, the aim encloses the understanding of changes in BSA secondary conformation and aromatic vicinities, at pH range from 2 to 12, in the Nafion®s presence and absence. Secondary changes were measured by Circular Dichroism and steady-state fluorescence was used to study the aromatic vicinities. Results have shown small differences at helix content in the extremely basic pH (pH 11) when compared to BSA conformation at pH 7 (native one). At pH 2, on the other hand, although a decreasing in helical content was observed, BSA was able to keep almost 50% of secondary regular conformation. Regarding the aromatic vicinities (tryptophans and tyrosines) the fluorescence emission quantum eficience decreased in both regions (acid and basic), suggesting that the aromatics in these conformations are found in a more restrict environment. Nafion®, when added, promoted a decreasing in aromatic exposition, both in solution and solid state, while the secondary structure is completelu modified by its presence in all pH range, suggesting that helical conformations are not stabilized by Nafion®

O produto de redução da nicotinamida adenina dinucleotídio (NADH) foi convertido no seu derivado hidratado NADH-X (6-hidroxi-l,4,5,6-tetraidronicotinamida adenina dinucleotídio) por ação de íons polibásicos tais como: fosfato, arsenato etc, ou por ação enzimática da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD). A cinética da hidratação foi acompanhada pelo aumento de absorbância (&#916;A285 nm) e o aparecimento de um efeito Cotton a 285 nm , notando-se que quando se parte do anômero &#946; da coenzima, o efeito Cotton positivo só se desenvolve nos estágios finais da reação na presença de enzima. Com base nesses resultados postulou-se a formação de um intermediário que se transforma num produto final, o qual mostra um efeito Cotton positivo a 285 nm. Supõe-se que essa última transformação seja uma epimerização &#946;&#8594;&#945;, de maneira que a adição de água não afeta inicialmente a configuração do átomo C1, da ribose. Contudo, após a hidratação, o produto se transforma no epímero &#945;, que é termodinamicamente mais estável. Na ausência da enzima, o efeito Cotton aparece em estágios anteriores, sugerindo que a hidratação, sendo lenta, dá oportunidade à epimerização. Consequentemente não há tanto acúmulo deste intermediário, que apresenta efeito Cotton praticamente nulo. A hidratação do anômero &#945;-NADH, na presença de GDP, mostrou um aumento de absorbância a 285 nm mais rápido do que para a forma &#946;. Por outro lado, o efeito Cotton positivo só começou a aparecer após desenvolvimento de 60% do &#916;A285 nm. Isto indicou que também para &#945;-NADH há formação de um intermediário, o qual apresenta um efeito Cotton nulo. Quando &#946;-NADH foi hidratado na ausência da enzima, observou-se um comportamento semelhante, porém, menos marcante com relação ao aparecimento do efeito Cotton. O fato de GPD e íons polibásicos produzirem efeitos semelhantes sobre os anômeros &#945; e &#946;, sugere que a ação enzimática da GPD não é estereoespecífica, produzindo uma mistura de epímeros em C6. Explica, também, o efeito Cotton nulo quando já se tem grande parte da hidratação efetuada. Desta maneira pôde-se afirmar (i) que o intermediário é uma mistura de epímeros em C6; (ii) que com o tempo predomina o epímero termodinamicamente mais estável. Os mesmos estudos foram desenvolvidos com NADPH, desamino-NADH e NMNH, para esclarecimentos a respeito da influência de grupos fosfato, amino e açúcar na catálise da hidratação e dos centros responsáveis pelo efeito Cotton positivo a 285 nm, nos piridinos nucleotídios. Observou-se que NADPH tem comportamento semelhante ao &#946;-NADH, indicando que o grupo fosfato não tem papel importante nas catálises química e enzimática. No caso do mononucleotídio e desamino-dinucleotídio não houve diferença significativa entre as velocidades de hidratação química e enzimática, o que siginifica ser importante a presença do amino grupo da adenina para catálise enzimática no caso de NADH. Os derivados acima, também, apresentaram efeito Cotton positivo nos estágios finais da reação. Com base no fato, que o mononucleotídio também apresentou efeito Cotton positivo, de mesma intensidade dos dinucleotídios, pôde-se afirmar que o açúcar ligado ao anel da nicotinamida é o responsável pela dissimetria do produto formado. Traçou-se o espectro de absorção circular dicróica do isômero 1,6-NADH, ainda desconhecido, para obter-se informações a respeito da sua estrutura. Através dos valores de elipticidades molares, concluiu-se que é mais rígida do que a do 1,4-NADH, presumivelmente, devido a ligação simples, que une os anéis piridínico e ribosídico, ter rotação mais impedida, como consequência da maior proximidade do par de hidrogênios da piridina, com a ribose. O estudo da adição de CN- aos piridinos nucleotídios e compostos relacionados, usando técnica de dicroismo circular, mostrou haver estereosseletividade na adição. O espectro de absorção circular dicróica do aduto &#946;-NAD+/CN- mostrou uma banda negativa larga com máximo em torno de 330 nm. Esta banda é assimétrica, o que permite um desdobramento em outras duas, com máximos a 325 e a 345 nm, de intensidade semelhantes. Em analogia com a redução dos piridinos nucleotídios, que ocorre nas posições 2, 4 e 6, pôde-se afirmar que a adição de CN-, também, ocorre em outras posições e não exclusivamente em 4. A banda de dicroismo circular na região de 345 nm, pareceu indicar a presença do isômero 1,6. O fato deste estar em concentração baixa a ponto de não ser detectável espectrofotometricamente, indicou que a força rotacional é bem maior do que para o isômero 1,4. Tal fato deve estar relacionado com a maior proximidade do CN- ao anel carboidrático. No aduto da forma &#945; do piridino nucleotídio, o espectro de dicroismo circular apresentou uma banda negativa, com máximo de 342 nm e uma inflexão a 325 nm. Essa assimetria mostrou, claramente, a existência dos dois isômeros e, que a adição de CN- em C6 é bastante estereosseletiva. Além da estereosseletividade, pode estar contribuindo, também a menor mobilidade rotacional do anel diidronicotinamídico, quando se tem aduto em C6. A estereosseletividade da adição de cianeto veio corroborar com a proposição de um equilíbrio rápido entre as conformações aberta e fechada para os piridino nucleotídios. A possível existência de uma transição fraca, associada ao núcleo diidronicotinamídico, foi confirmada detectando-se um efeito Cotton associado a ela. Esse efeito foi observado para &#945;-NADH, &#946;-NADH e seus correspondentes adutos de CN-. Realizando-se o mesmo estudo para o complexo de &#946;-NADH.Cu++, verificou-se que o efeito Cotton é 15 vezes mais intenso, confirmando assim, a detecção pioneira dessa transição fraca, presumivelmente de natureza singlete-triplete. / The reduction product of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is converted into the hydration product NADH-X (6-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydronicotinamide adenine dinucleotide) by the action of polybasic ions such as phosphate, arsenate etc., or by enzymatic catalysis with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). The hydration kinetics were followed by the increase in absorbance at 285 nm. Starting with the &#946;-anomer of the coenzyme, the transition at 285 nm begins to exhibit a positive Cotton effect only in the later stages of the reaction. On the basis of the results, the formation of an interrnediate not exhibiting a Cotton effect at 285 nm is postulated. Since the hydration would not be expected to change the configuration at C1, of the ribose, the appearance of the Cotton effect is presumably due to an epimerization from the &#946;-epimer to the thermodynamically more stabe &#945;-epimer. In the absence of enzyme, the Cotton effect appears at somewhat lower conversions, suggesting that the slower hydration reaction provides greater opportunity for the occurrence of the epimerization. The increase in absorbance at 285 nm is more rapid for the hydration of the &#945;-anomer of NADH than for the &#946;-form in the presence of GPD. A positive Cotton effect is only observed for the forrner after the reaction has gone to about 60% completion. This indicates that an intermediate not exhibiting a Cotton effect is also formed in the case of &#945;-NADH. Similar behavior was observed in the non-enzymatic hydration, however, as in the case of &#946;-NADH, the onset of the Cotton effect occurred at lower conversions. The fact that GPD and polybasic ions produce similar effects on both the &#945; and &#946; anomers suggests that the enzymatic action of GPD is non-stereospecific, producing a mixture of epimers at C6. This also explain the absence of a Cotton effect even though significant hydrations has occurred. Thus we conclude (i) that the intermediate is a mixture of C6 epimers and (ii) that the more thermodynamically stable epimer predominates at long reaction times. The same studies were carried out with NADPH, deamino-NADH and NMNH to clarify the catalytic influence of the phosphate, amino, and sugar groups on the hydration and to identify the centers responsible for the positive Cotton effect at 285 nm in pyridine nucleotides. The observation that the behavior of NADPH is similar to that of &#946;-NADH indicates that the phosphate group does not play an important role in the chemical and enzymatic catalysis. In the case of NMNH and deamino-NADH there is no significant difference between the rates of the chemical and enzymatic hydration, which implies that the presence of the amino group of adenine is important in the enzymatic catalysis of the hydration of NADH. The above derivatives also present positive Cotton effects in the later stages of the reaction. Since that mononucleotide exhibits a positive Cotton effect of intensity equal to that of the dinucleotides, it can be concluded that the sugar attached to the nicotinamide ring is responsible for the assymetry of the product. The previously unknown circular dichroic absorption spectrum of 1,6-NADH was determined in order to gain insight into its structure. From the values of the molar ellipticity it is concluded that the assymetric center of 1,6-NADH is more rigid than that of. 1,4-NADH. This is presumably due to a greater hindrance to rotation about the single bond between the pyridine and ribose rings in 1,6-NADH. A circular dichroic study of the addition of CN- to pyridine nucleotides and related compounds demonstrated the stereoselectivity of the addition. The circular dichroic absorption spectrum of the B-NAD+/CN- adduct exhibits a broad assymetric negative band with a maximum at about 330 nm. This band was interpreted in terms of two bands of similar intensity with maxima at 325 and 345 nm. By analogy with the reduction of pyridine nucleotides,which occurs at position 2,4 and 6, it is concluded that CN- addition also occurs at positions other than C4. The band at 345 nm was attributed to the 1,6-isomer. The fact that this isomer could not be detected by conventional absorption techniques indicates that it is present in low concentrations relative to the 1,4-isomer. It must have therefore has a much greater rotational strength, which is reasonable in view of the proximity of the CN- to the carbohydrate ring. The circular dichroic absorption spectrum of the &#945;-NAD+/CN- adduct exhibited a negative band with a maximum at 342 nm and an inflection at 325 nm. This assymetry clearly demonstrated the presence of two isomers and the stereoselectivity of CN- addition at C6. Although the l,6-adduct could not be detected by conventional absorption techniques, the stereoselectivity of the addition and a large rotational strength contribute to its circular dichroic intensity. The stereoselectivity of the CN- addition corroborates the existence of a rapid conformational equilibrium between the folded and unfolded forms of pyridine nucleotides. A Cotton effect associated with the weak electronic transition attributed to the dihydronicotinamide nucleus was observed for &#945;-NADH, &#946;-NADH, and the corresponding CN- adducts, confirming the existence of the transition. For the &#946;-NADH.CU++ complex, the Cotton effect was found to be 15 times more intense, thus confirming the original detection of this weak transition, which presumably has singlet-triplet character.