O objetivo deste estudo foi avaliar se a sobrecarga de sal durante a gestação interfere na liberação de renina renal e circulante e a sua relação com a COX-2 e nNOS no rim após estimulo ou inibição do sistema renina angiotensina (SRA) nas proles femininas adultas. Ratas fêmeas Wistar receberam dieta normossódica (1,3%), hipersódica 4,0% ou hipersódica 8,0%NaCl durante a gestação. Ao nascimento, as proles receberam dieta normossódica. As proles com 12 semanas de vida foram submetidas ao teste de restrição (0,15%) ou a sobrecarga de sódio (8,0%NaCl). Foram avaliados pesos corpóreos, a pressão arterial, atividades da renina plasmática e renal; porcentagem de ramos vasculares com grânulos de renina, nitrito sérico; expressão do mRNA e protéica de renina, COX-2 e nNOS no córtex e medula renal. A pressão arterial, peso corpóreo, atividade da renina plasmática e renal não foram diferentes entre os grupos. A prole HR1 apresentou modulação do SRA, enquanto que prole HR2 não apresentou modulação adequada frente à restrição ou sobrecarga de sódio. Além disso, a expressão do mRNA da renina, COX-2 e nNOS foi estimulada na medula, e diminuída no córtex renal das proles HR1 diante da restrição ou sobrecarga de sódio. Em conclusão, a sobrecarga de sódio durante a gestação modifica as respostas do sistema renina-angiotensina, da COX-2 e da nNOS diante de subseqüente restrição e sobrecarga de sódio nas proles femininas adultas. / The objective was to evaluate whether mother high salt diet interferes in circulating and local renin release and its relation to kidney COX-2 and nNOS under RAS stimulation or inhibition by sodium in female offspring. Female rats were fed a normal (1,3%NaCl, NSD) or high 1 (4,0%, HSD1) or high 2 (8,0%, HSD2) diet throughout pregnancy. Mating occurred on the 12th week of age. From birthday, the offspring received normal salt diet. In adult offspring; plasma, renal renin activity, granulated renin cell, serum Nox, medullar and cortical renin, COX-2 and nNOS mRNA and protein expression were measured in basal condition and after one week of RAS stimulation or inhibition by sodium. Results: In basal condition, renin activity was not different among groups; however HSD1 offspring was more responsive to RAS stimulation or inhibition. Medulla COX-2 and nNOS mRNA of HSD1 offspring were decreased in basal conditions and they were more responsive to RAS stimulation or inhibition. Enhanced responses of circulating and local renin, COX-2 and nNOS to RAS stimulation or inhibition by sodium in offspring from maternal high salt diet during pregnancy lead to activation of renin angiotensin system, prostaglandin and nitric oxide pathways, and could be origin of hypertension in late life.

O objetivo deste estudo foi avaliar se a sobrecarga de sal durante a gestação interfere na liberação de renina renal e circulante e a sua relação com a COX-2 e nNOS no rim após estimulo ou inibição do sistema renina angiotensina (SRA) nas proles femininas adultas. Ratas fêmeas Wistar receberam dieta normossódica (1,3%), hipersódica 4,0% ou hipersódica 8,0%NaCl durante a gestação. Ao nascimento, as proles receberam dieta normossódica. As proles com 12 semanas de vida foram submetidas ao teste de restrição (0,15%) ou a sobrecarga de sódio (8,0%NaCl). Foram avaliados pesos corpóreos, a pressão arterial, atividades da renina plasmática e renal; porcentagem de ramos vasculares com grânulos de renina, nitrito sérico; expressão do mRNA e protéica de renina, COX-2 e nNOS no córtex e medula renal. A pressão arterial, peso corpóreo, atividade da renina plasmática e renal não foram diferentes entre os grupos. A prole HR1 apresentou modulação do SRA, enquanto que prole HR2 não apresentou modulação adequada frente à restrição ou sobrecarga de sódio. Além disso, a expressão do mRNA da renina, COX-2 e nNOS foi estimulada na medula, e diminuída no córtex renal das proles HR1 diante da restrição ou sobrecarga de sódio. Em conclusão, a sobrecarga de sódio durante a gestação modifica as respostas do sistema renina-angiotensina, da COX-2 e da nNOS diante de subseqüente restrição e sobrecarga de sódio nas proles femininas adultas. / The objective was to evaluate whether mother high salt diet interferes in circulating and local renin release and its relation to kidney COX-2 and nNOS under RAS stimulation or inhibition by sodium in female offspring. Female rats were fed a normal (1,3%NaCl, NSD) or high 1 (4,0%, HSD1) or high 2 (8,0%, HSD2) diet throughout pregnancy. Mating occurred on the 12th week of age. From birthday, the offspring received normal salt diet. In adult offspring; plasma, renal renin activity, granulated renin cell, serum Nox, medullar and cortical renin, COX-2 and nNOS mRNA and protein expression were measured in basal condition and after one week of RAS stimulation or inhibition by sodium. Results: In basal condition, renin activity was not different among groups; however HSD1 offspring was more responsive to RAS stimulation or inhibition. Medulla COX-2 and nNOS mRNA of HSD1 offspring were decreased in basal conditions and they were more responsive to RAS stimulation or inhibition. Enhanced responses of circulating and local renin, COX-2 and nNOS to RAS stimulation or inhibition by sodium in offspring from maternal high salt diet during pregnancy lead to activation of renin angiotensin system, prostaglandin and nitric oxide pathways, and could be origin of hypertension in late life.

Sabe-se que algumas alterações nutricionais maternas durante o período perinatal estão associadas com doenças metabólicas na vida adulta das proles, tais como diabetes melito tipo 2, resistência à insulina, obesidade e hipertensão arterial. O período da gestação em que estas alterações nutricionais influenciam a prole na idade adulta ainda não está elucidado. Modificações epigenéticas têm sido propostas como mecanismos responsáveis por estas desordens metabólicas. Ratas Wistar de doze semanas de idade foram alimentadas com dieta com conteúdo baixo (HO - 0,15% NaCl) ou normal (NR - 1,3% NaCl) de sódio desde o primeiro dia de gestação até o nascimento da prole ou HO durante a primeira (HO10) ou segunda (HO20) metade da gestação. O peso corpóreo e a ingestão de água e ração foram avaliados semanalmente durante a gestação. Teste de tolerância à insulina (ITT) e à glicose (GTT) e HOMA-IR foram realizados nas proles adultas. Expressão gênica por qRT-PCR e metilação do DNA na região promotora dos genes foram mapeadas utilizando tratamento com bissulfito de sódio e avaliadas por pirosequenciamento. O ganho de peso materno foi menor no HO e HO20 na terceira semana de gestação em comparação com NR e HO10. O peso ao nascimento da prole foi menor em machos e fêmeas dos grupos HO e HO20 em relação ao NR e HO10. O HOMA-IR foi maior nos machos com 12 semanas de idade do grupo HO em comparação com NR e com 20 semanas de idade do grupo HO10 em comparação com NR e HO20. Nas fêmeas com 12 semanas de idade o HOMA-IR foi maior no HO10 comparado com HO. Os níveis de insulina no soro foram maiores tanto nos machos com 20 semanas de idade do grupo HO10 comparado com NR quanto nas fêmeas com 12 semanas de idade do grupo HO10 comparado com HO. A área sob a curva do GTT indicou intolerância à glicose nos machos do grupo HO. A porcentagem de metilação das ilhas CpG no promotor dos genes de Igf1, Igf1r, Ins1, Ins2 e Insr no fígado de machos e fêmeas neonatais e no fígado, tecido adiposo branco e músculo em machos com 20 semanas de idade foi influenciada pela baixa ingestão de sal durante a gestação. Nenhuma destas alterações foi identificada nas fêmeas com 20 semanas de idade. Em conclusão, a baixa ingestão de sal na segunda metade da gestação é responsável pelo baixo peso ao nascimento em ambos os sexos. A intolerância à glicose observada na prole adulta ocorreu somente se a dieta hipossódica é dada durante a gestação inteira. Por outro lado, a resistência à insulina em resposta ao consumo de dieta hipossódica durante a gestação está relacionada com o momento em que ocorre este insulto e com o envelhecimento da prole. Também foi observado que alterações na metilação do promotor do gene Igf1 está correlacionado com o baixo peso ao nascimento em resposta a ingestão de dieta hipossódica durante a gestação / It is known that some maternal nutritional alterations during pregnancy are associated with metabolic disorders in adult offspring, such as insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, obesity and arterial hypertension. The period of pregnancy in which these nutritional alterations influence adult offspring remains uncertain. Epigenetic changes are proposed to underlie these metabolic disorders. Twelve-week-old female Wistar rats were fed a low-salt (LS - 0.15% NaCl) or normal-salt (NS - 1.3% NaCl) diet since the first day of gestation until delivery or LS during the first (LS10) or second (LS20) half of gestation. Body weight, food and water intake were weekly evaluated during gestation. Blood glucose, insulin (ITT) and glucose (GTT) tolerance tests, HOMA-IR were performed in adult offspring. Gene expression and DNA methylation were mapped using bisulfite treatment evaluated by pyrosequencing in the male and female neonates and adult offspring. Weight gain was lower in LS and LS20 dams than in NS and LS10 dams in the third week of pregnancy. Birth weights were lower in male and female LS20 and LS rats compared with NS and LS10 neonates. HOMA-IR was higher in 12-week-old LS males compared with NS and in 20-week-old male LS10 rats compared with NS and LS20 rats. In 12-week-old LS10 females, HOMA-IR was higher than in LS. Serum insulin levels were higher in 20 week-old LS10 male compared with NS rats and in 12-week-old LS10 female compared to LS rats. The area under the curve of GTT indicated glucose intolerance in 12- and 20-week-old LS male. Methylation of CpG islands of the Insr, Igf1, Igf1r, Ins1 and Ins2 genes in liver in neonates male and female offspring and liver, white adipose tissue and muscle in 20-week-old male offspring were influenced by low-salt intake during pregnancy. None of these alterations was identified in 20-week-old females. In conclusion, low-salt diet consumption in the second half of pregnancy can result in low birth weights in the males and females offspring. Glucose intolerance observed in adult offspring occurred only if low salt intake was given throughout pregnancy. However, insulin resistance in response to low salt intake during pregnancy is related to the time at which this insult occurs and to the age of the offspring. Alterations in the DNA methylation of Igf1 were observed to be correlated with low birth weight in response to low salt feeding during pregnancy

A restrição crônica de sal na dieta tem sido recomendada como medida não medicamentosa do tratamento da hipertensão arterial sistêmica. Entre os efeitos observados desta medida terapêutica tem sido descrita uma redução dos valores da pressão arterial (PA), tanto em indivíduos normotensos e pacientes hipertensos, assim como em animais de laboratório. Outros efeitos observados são alterações do metabolismo de carboidratos e de lípides. Tanto em indivíduos normotensos e pacientes hipertensos, assim como em animais de laboratório foram observadas maiores concentrações de peptídeo C e de insulina, sem alteração da glicemia e com redução da captação periférica de glicose pelos tecidos, caracterizando um estado de resistência à insulina. No metabolismo de lípides, uma outra conseqüência da restrição crônica de sal é a maior concentração plasmática de colesterol total e triacilgliceróis. Apesar da demonstração dos efeitos do sal sobre o metabolismo de carboidratos e lípides em humanos e animais existem dados conflitantes na literatura, com resultados opostos a estes descritos. Para melhor compreensão deste fenômeno, foi desenvolvido um estudo em nosso laboratório, o qual demonstrou que ratos Wistar machos que receberam restrição crônica de sal na dieta apresentaram maiores insulinemias medidas durante um teste de tolerância à glicose e sem a constatação de resistência à insulina em adipócitos isolados avaliada pela EC50 Entretanto, o que não ficou esclarecido neste estudo é se este quadro era restrito ao tecido estudado ou se ocorria no animal como um todo, ou seja, se era um fenômeno generalizado. Tendo em vista estes resultados, um outro estudo foi desenvolvido em nosso laboratório. Analisando o animal intacto, foi verificado que a restrição crônica de sal em ratos Wistar estava associada a uma menor sensibilidade à insulina medida por meio de um clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (CLAMP) em animais anestesiados. Também foi observado maior peso corpóreo (PC) e maior massa dos tecidos adiposos. No intuito de se compreender quais eram os mecanismos envolvidos na menor sensibilidade à insulina durante a restrição de sal na dieta, também foi feito o pareamento de peso entre os animais que receberam dietas hipo (HO), normo (NR) ou hipersódica (HR) e mesmo sem diferença entre os PC, os animais sob restrição salina mantiveram-se insulino resistentes. Em uma nova etapa foi feito o bloqueio do sistema renina angiotensina com o uso de captopril (inibidor da enzima conversora de angiotensina) ou losartan (antagonista do receptor ATI de angiotensina II) tendo sido verificado que o captopril melhorou a sensibilidade à insulina, o que não ocorreu com o uso de losartan. Outra conseqüência da restrição crônica de sal na dieta é a maior atividade do sistema nervoso simpático (SNS) e uma menor atividade da via L-arginina (LA) / óxido nítrico (NO). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se o SNS e a via LA/NO são mecanismos envolvidos na menor sensibilidade à insulina durante a restrição crônica de sal. Para o desenvolvimento deste estudo, ratos Wistar machos receberam dieta HO, NR ou HR desde o desmame aos 21 dias de vida até completarem 12 semanas. Ao tornarem-se adultos, os ratos foram submetidos ao implante cirúrgico de cateteres e três a cinco dias após era realizado um CLAMP em ratos acordados. No dia do experimento, após um jejum de seis horas se realizava a coleta de sangue e medidas metabólicas e hemodinâmicas. Neste momento, um grupo de ratos recebeu prazosin e propranolol para o bloqueio do SNS e outro grupo recebeu veículo. Um terceiro grupo de animais recebeu LA e outro grupo recebeu D-arginina (DA). Um quinto grupo de animais que consumiu apenas a dieta HR recebeu diltiazem (bloqueador de canal de cálcio). Quarenta e cinco minutos após a infusão das drogas o CLAMP foi iniciado. Foram medidos PC, glicemias, insulinemias, lípides, nitrato/nitrito (NOx), PA sistólica (PAS), diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC). O PC foi maior na dieta HO do que na NR e HR. Também foi observado maior PC na dieta NR do que HR. Em situação basal observaram-se maiores valores de glicemia e insulinemia durante a restrição salina em comparação aos ratos em dieta NR e HR. A PAS e PAD foram maiores na dieta HR em comparação aos ratos em dieta NR e HO, enquanto a FC foi maior nos ratos em dieta HO em comparação àqueles sob dietas NR e HR. Também foram observadas maiores concentrações plasmáticas de colesterol total (COL) e triacilgliceróis (TAG) durante a restrição salina. Os animais controle apresentaram menor sensibilidade à insulina em comparação àqueles em dieta NR ou HR. O bloqueio do SNS corrigiu o efeito do sal sobre a captação de glicose, não sendo mais observada diferença entre as dietas. O bloqueio do SNS não influenciou a glicemia mas reduziu a maior insulinemia nos ratos em dieta HO, não sendo mais observada diferença entre as dietas quanto às insulinemias ao início do CLAMP. A infusão de LA melhorou a menor captação periférica de glicose nos ratos em dieta HO, sem influência sobre os animais tratados com dieta NR ou HR. Diltiazen não modificou a sensibilidade à insulina apesar de ter reduzido a PA em intensidade semelhante ao bloqueio do SNS. O bloqueio do SNS reduziu os valores de PAS e PAD nas três dietas, com queda mais intensa dos seus valores nos animais sob sobrecarga salina, logo ao início do CLAMP. Diltiazen reduziu a PAS e PAD. DA não influenciou (p>0,05) os valores de PAS e PAD. Já a infusão de LA promoveu redução dos valores de PAS e PAD somente em ratos em sobrecarga salina e reduziu os maiores valores de FC observados nos ratos durante a restrição de sal na dieta. O bloqueio do SNS e a infusão de LA reduziram os maiores valores de TAG ao término do CLAMP, o que não foi observado nos grupos veículo e DA. Não foi observada modificação da concentração plasmática de COL entre os grupos independentemente dos fármacos ministrados. Durante a restrição salina foi observado menor concentração plasmática de NOx em comparação à sobrecarga salina. A infusão de LA promoveu um incremento na concentração plasmática de NOx ao término do CLAMP nas três dietas, o que não foi observado nos ratos tratados com DA. Ao término do CLAMP não foram observadas diferenças na concentração de NOx plasmático entre as dietas nos animais que receberam LA. A concentração plasmática de NOx nas três dietas foi menor nos ratos que receberam DA. Assim, o bloqueio do SNS e a ativação da via LA/NO melhoraram os efeitos metabólicos decorrentes da restrição crônica de sal. / Chronic dietary salt restriction is recommended as non-pharmacological measure of hypertension treatment. One of the observed effects of this therapeutic measure is the blood pressure (BP) decrease in normotensive subjects and in hypertensive patients, and also in laboratory animals. Another side effects observed are disorders of carbohydrate and lipid metabolism. Salt restriction induced higher C-peptide and insulin levels, without changes on plasma glucose, and lower glucose uptake by the tissues in normotensive subjects and in hypertensive patients, and also in laboratory animals, suggesting an insulin resistant state. Other consequences of salt restriction are higher plasma levels of cholesterol and triacylglycerols. Some studies have disclosed opposite results. With the objective to better understand these phenomena, a study was developed in our laboratory, that showed that male Wistar rats on chronic salt restriction presented higher insulin plasma levels measured during a glucose tolerance test, without insulin resistance in isolated adipocytes measured by the EC50 of the insulin - glucose uptake curve. It was not clear in this study if this phenomenon was restricted to the evaluated tissue or if it was a phenomenon in the whole animal. With these results, another study was developed in our laboratory. Analyzing the whole animal, chronic salt restriction in male Wistar rats was associated with lower insulin sensitivity measured by a euglycemic hyperinsulinemic clamp (CLAMP) in anesthetized rats. Higher body weight (BW) and adipose tissue mass was also observed. With the objective to understand the involved mechanisms in the lower insulin sensitivity due to dietary salt restriction, weight was paired among animals on low (LSD), normal (NSD) or high (HSD) salt diet, and even without BW difference, salt restricted animals were still insulin resistants. In another step, renin angiotensin system blockade with captopril (angiotensin enzyme conversion inhibitor) or losartan (angiotensin II type I receptor antagonist) was performed. It was observed that captopril, but not losartan, improved insulin sensitivity. Another consequence of salt restriction is a higher sympathetic nervous system (SNS) and a lower L-arginine (LA) / nitric oxide (NO) pathway activity. The objective of this study was to verify if SNS and LA / NO are mechanisms involved in the lower insulin sensitivity due to chronic salt restriction. Male Wistar rats received LSD, NSD, or HSD since weaning until adulthood. In the 12th week of age, catheters were inserted and three to five days latter, a CLAMP was performed in awaked rats. On the day of the experiment, after six hours fasting, blood samples were collected and metabolic and hemodynamic measures were done. At this moment, a group of rats received prazosin and propranolol for SNS blockade and another group received vehicle. A third group of animals received LA and a fourth group received D-arginine (DA). Another group of rats only on HSD received diltiazen (calcium channel blocker). Fourty five minutes after drug infusion the CLAMP was started. BW, plasma glucose, insulin, lipids, and nitrate/nitrite (NOx), systolic BP (SBP), diastolic (DBP), and heart rate (HR) were measured. BW was higher on LSD than on NSD and HSD. BW was also higher on NSD than HSD. Basal plasma glucose and insulin were higher during salt restriction than on NSD and HSD. SBP and DBP were higher on HSD than on NSD and LSD, and HR was higher on LSD than on NSD and HSD. Cholesterol (CHOL) and triacylglycerol (TAG) plasma levels were higher on salt restriction. LSD rats presented lower insulin sensitivity compared to animals on NSD or HSD. SNS blockade corrected effect of salt on glucose uptake. SNS blockade had no influence on glucose levels but reduced the higher plasma insulin in LSD rats, without differences in insulin levels between diets at the start of the CLAMP. LA improved the lower glucose uptake observed in LSD rats, with no influence on the rats on NSD or HSD. Diltiazen had no effect on insulin sensitivity. SNS blockade reduced SBP and DBP in rats on the three diets, with an intense BP fall on HSD rats at the start of the CLAMP. Diltiazen reduced SBP and DBP. DA had no influence in SBP and DBP. On the other hand, LA decreased SBP and DBP only in salt overloaded rats and reduced the higher HR observed on salt restricted rats. SNS blockade and LA infusion reduced the higher TAG concentration at the end of the CLAMP, which was not observed in vehicle and DA groups. COL level was not influenced by drug infusion. During salt restriction, lower plasma NOx was observed compared to salt overload. LA infusion promoted plasma NOx increment at the end of the CLAMP. At the end of the CLAMP, no difference was observed in plasma NOx among the rats on the three salt diets and infused with LA. Plasma NOx was lower in rats in the DA group. In conclusion, SNS blockade and LA/NO pathway activation improved the metabolic effects due to chronic dietary salt restriction.