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Papel da Ouabaína na inflamação alérgica pulmonar: aspectos fenotípicos e funcionaisGalvão, José Guilherme Ferreira Marques 16 June 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-06-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Ouabain (OUA), a potent Na+/K+ ATPase inhibitor, was identified as an endogenous substance present in human plasma. It was shown that OUA is able to interfere in several aspects of the immune system and inflammation, but the effect of this substance in allergic lung inflammation had not been previously investigated. Lower airways inflammation process is characterized by cell migration and bronchial hyperresponsiveness, as a result of sensitization by protein antigens such as ovalbumin (OVA). Aim: Evaluate the effect of ouabain on the model of allergic pulmonary inflammation induced by OVA. Methods: BALB/c mice (n = 6) were sensitized and challenged with OVA and pretreated intraperitoneally (ip) with OUA (0.56 mg/kg) two days before the sensitization and one hour before them, or dexamethasone (2 mg/kg) subcutaneously 1 hour before to each challenge. Allergic inflammation parameters, such as cell migration, and production of cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), mucus production and pulmonary histopathologic remodeling, and IgE quantitation were analyzed posteriorly. Results: Ouabain reduced (60%) BALF cells as a reflex of polymorphonuclear leukocyte inhibition and T CD3+ lymphocytes, as well as it reduced the production of Th2 profile cytokines, IL-4 and IL-13. Furthermore, ouabain also reduced histopathologic parameters of inflammation, such as hyperplasia of goblet cells and with consequent mucus decrease, besides it reduced OVA-specific IgE titer. Conclusion: These results suggests that OUA presents anti-inflammatory effect on pulmonary allergic inflammation, modulating Th2 phenotype parameters. / A ouabaína (OUA), um potente inibidor da Na+/K+ ATPase, foi identificada como uma substância endógena presente no plasma humano. Nos últimos anos, foi evidenciado que a OUA é capaz de interferir em diversos aspectos do sistema imunológico e em diferentes modelos de inflamação, porém o seu efeito na inflamação alérgica pulmonar não tinha sido investigado previamente. Processos inflamatórios alérgicos das vias aéreas inferiores são caracterizados por migração celular e hiperresponsividade brônquica, em decorrência da sensibilização por antígenos proteicos como a ovalbumina (OVA). Objetivo: Avaliar o efeito da ouabaína no modelo de inflamação alérgica pulmonar induzida por OVA. Métodos: Camundongos BALB/c fêmeas (n = 6) foram sensibilizados e desafiados com OVA e pré-tratados via intraperitoneal (i.p.) com OUA (0,56 mg/kg) dois dias antes das sensibilizações e uma hora antes destas, ou com dexametasona (2 mg/kg) subcutânea 1 hora antes de cada desafio. Parâmetros da inflamação alérgica, como migração celular e produção de citocinas no fluido do lavado broncoalveolar (BALF), produção de muco e remodelamento histopatológico pulmonar quantificação de IgE sérica, foram analisados posteriormente. Resultados: A ouabaína reduziu em 60% o número total de células presentes no BALF como um reflexo da inibição de leucócitos polimorfonucleares e linfócitos T CD3+, bem como a produção de citocinas do fenótipo Th2, IL-4 e IL-13. Ademais, a ouabaína reduziu os parâmetros inflamatórios histopatológicos, como hiperplasia das células caliciformes com consequente diminuição de muco, além de reduzir o título de OVA-IgE específica. Conclusão: Estes dados sugerem que a OUA apresenta efeito anti-inflamatória no modelo de inflamação alérgica pulmonar, modulando parâmetros do fenótipo Th2.
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Purificação e caracterização do fragmento Fab anti-digoxina obtido pela técnica de phage display. / Purification and characterization of anti-digoxin Fab fragments obtained by phage display technology.Inocencio, André Luís 23 March 2016 (has links)
A digoxina é um dos medicamentos indicados para o tratamento de falência cardíaca. Possui janela terapêutica estreita, sendo responsável por casos de intoxicação. O único antídoto disponível para a desintoxicação é o anticorpo policlonal DigiFab®, no formato Fab. O seu uso é eficaz, porém de custo elevado. Clones bacterianos produtores de fragmento Fab monoclonal anti-digoxina foram obtidos previamente pelo nosso grupo, pela técnica de phage display. Neste trabalho as variantes Fab dos 4 clones foram expressas em E.coli para estabelecer o método para a purificação. Com a obtenção dos fragmentos Fab purificados, foi caracterizada a sua afinidade ao antígeno e especificidade, em ensaios de inibição por digoxina, digitoxina, digoxigenina e ouabaina. Os parâmetros cinéticos da ligação dos fragmentos Fab dos 4 clones e do DigiFab® foram avaliados por SPR. Nas condições experimentais, não foram verificadas diferenças significativas entre os produtos dos 4 clones e o comercial, demonstrando o potencial dos fragmentos Fab monoclonais obtidos como antídoto à digoxina. / Digoxin is a medication indicated for heart failure treatment. Its therapeutic window is narrow, being responsible for intoxication cases. The only antidote available for the detoxification is a polyclonal antibody - DigiFab® in Fab format. Its use is effective, but costly. Bacterial clones producing anti-digoxin monoclonal Fab fragments were previously obtained by our group using phage display technology. In this work the Fab variants of the 4 clones were expressed in E.coli to establish the purification method. The purified fragments were characterized regarding the affinity to the antigen and the specificity through inhibition assays with digoxin, digitoxin, digoxigenin and ouabain. The binding kinetic parameters of Fab fragments of the 4 clones and the commercial product to Dig-BSA conjugate were assessed by SPR. Under the experimental conditions no significant differences were observed among the 4 clones and the commercial product, demonstrating the potential of monoclonal Fab fragments as an antidote to digoxin.
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Purificação e caracterização do fragmento Fab anti-digoxina obtido pela técnica de phage display. / Purification and characterization of anti-digoxin Fab fragments obtained by phage display technology.André Luís Inocencio 23 March 2016 (has links)
A digoxina é um dos medicamentos indicados para o tratamento de falência cardíaca. Possui janela terapêutica estreita, sendo responsável por casos de intoxicação. O único antídoto disponível para a desintoxicação é o anticorpo policlonal DigiFab®, no formato Fab. O seu uso é eficaz, porém de custo elevado. Clones bacterianos produtores de fragmento Fab monoclonal anti-digoxina foram obtidos previamente pelo nosso grupo, pela técnica de phage display. Neste trabalho as variantes Fab dos 4 clones foram expressas em E.coli para estabelecer o método para a purificação. Com a obtenção dos fragmentos Fab purificados, foi caracterizada a sua afinidade ao antígeno e especificidade, em ensaios de inibição por digoxina, digitoxina, digoxigenina e ouabaina. Os parâmetros cinéticos da ligação dos fragmentos Fab dos 4 clones e do DigiFab® foram avaliados por SPR. Nas condições experimentais, não foram verificadas diferenças significativas entre os produtos dos 4 clones e o comercial, demonstrando o potencial dos fragmentos Fab monoclonais obtidos como antídoto à digoxina. / Digoxin is a medication indicated for heart failure treatment. Its therapeutic window is narrow, being responsible for intoxication cases. The only antidote available for the detoxification is a polyclonal antibody - DigiFab® in Fab format. Its use is effective, but costly. Bacterial clones producing anti-digoxin monoclonal Fab fragments were previously obtained by our group using phage display technology. In this work the Fab variants of the 4 clones were expressed in E.coli to establish the purification method. The purified fragments were characterized regarding the affinity to the antigen and the specificity through inhibition assays with digoxin, digitoxin, digoxigenin and ouabain. The binding kinetic parameters of Fab fragments of the 4 clones and the commercial product to Dig-BSA conjugate were assessed by SPR. Under the experimental conditions no significant differences were observed among the 4 clones and the commercial product, demonstrating the potential of monoclonal Fab fragments as an antidote to digoxin.
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