Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:02:48Z No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / O Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico e o principal agente etiológico da cromoblastomicose, infecção crônica da pele e tecidos subcutâneos iniciada pela inoculação transcutânea das formas saprofíticas do fungo. No hospedeiro, essas células transformam-se em células muriformes, tida como a forma parasítica do fungo e grandes produtoras de melanina, considerada um importante fator de virulência. Estudos recentes têm proposto que a cronicidade da cromoblastomicose decorre de falhas, tanto no reconhecimento inato do fungo, levando à baixa produção de citocinas pró-inflamatórias, quanto na montagem de uma resposta imune adequada para a contenção da infecção. Nesse contexto, considerando o inflamassoma como um importante sistema de reconhecimento inato que compõe respostas imunes antifúngicas, este trabalho foi conduzido visando avaliar a ativação do inflamassoma por F. pedrosoi, bem como o seu papel na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo. Foi observado, inicialmente, que hifas, ao contrário de conídios, induzem a secreção de IL-1 provendo os 2 sinais necessários à ativação do inflamassoma, tanto em BMDMs, quanto em BMDCs. O fornecimento exógeno do primeiro ou segundo sinal não só incrementou a secreção da citocina durante a infecção com hifas, como possibilitou a secreção de IL-1β por BMDCs infectadas com conídios. Utilizando inibidores ou células nocautes, verificou-se que a secreção de IL-1β é dependente do receptor NLRP3, da caspase-1, e influenciada pela caspase-8. Em adição, observamos que a secreção de IL-1 mediada pelo inflamassoma NLRP3 é dependente: da sinalização via NF-κB independente de MyD88; dos mecanismos de efluxo de K+; da liberação de catepsina B; e, de forma não essencial, da geração de espécies reativas de oxigênio. Ademais, foi mostrado que a melanina presente na parede do fungo, mas não a secretada, contribui para a secreção da IL-1. Foi demonstrado, ainda, que a caspase-1, caspase-11 e o receptor NLRP3, não foram capazes de promover a atividade fungicida de macrófagos em ensaios de co-cultura com o fungo. Entretanto, dados dos ensaios de infecções in vivo sugerem que as caspases-1 e -11, assim como o NLRP3, auxiliam na contenção da infecção por propágulos fúngicos de F. pedrosoi. No entanto, eles são dispensáveis na resposta à infecção com o conídio, confirmando o papel desta forma fúngica na persistência do F. pedrosoi no hospedeiro como resultado da ativação inadequada da resposta imune e seus mecanismos efetores. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, and the main etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infection of the skin and subcutaneous tissue initiated after transcutaneous inoculation of saprophytic forms of the fungus. Inside the host, these cells turn into muriformes cells, considered the parasitic form, which produce large amount of melanin, an important virulence factor. Recent studies have suggested that the chronicity observed in chromoblastomycosis is due to both, failure in innate recognition of the fungus, leading to low production of pro-inflammatory cytokines, and development of an inappropriate immune response unable to contain the disease. In this context, and considering the inflammasome as an important innate recognition system that comprises antifungal immune responses, this study was conducted to evaluate inflammasome activation by F. pedrosoi, as well as its role in the infection induced by saprophytic forms of the fungus. First, it was observed that, in contrast to conidia, hyphae induced the secretion of IL-1, and provides both first and second signals for inflammasome activation in BMDMs and BMDCs. Exogenous stimulation of the first or second signal not only increased IL-1 secretion during infection with hyphae, but also enabled the secretion of IL-1 by BMDCs infected with conidia. Using inhibitors or knockout cells, it was found that IL-1β secretion is dependent on NLRP3, caspase-1 and influenced by caspase-8. In addition, we observed that IL-1 secretion mediated by NLRP3 inflammasome is dependent: on a NF-kB signaling pathway independent of MyD88; on efflux of K+; on cathepsin B release; and, in an unessential way, on generation of reactive oxygen species. Furthermore, it was demonstrated that melanin present in fungal cell wall, but not the secreted one, contribute to IL-1β secretion. It was further demonstrated that caspase-1, caspase-11 and NLRP3 receptor did not promote in vitro fungicidal activity of macrophages. However, data from in vivo infection studies suggest that caspase-1 and -11, as well as NLRP3, assist in the disease containment caused by infection with fungal propagules of F. pedrosoi. However, they are dispensable in response to infection with conidia, confirming the role of conidia in F. pedrosoi conidial form persistence in the host through the inappropriate activation of the immune response and its effectors mechanisms.

A histoplamose é uma micose sistêmica que pode se apresentar desde uma infecção assintomática até a forma disseminada, potencialmente fatal. Causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, é tratada de forma transdisciplinar, sua epidemiologia se alicerça em quatro pilares: biológico, social, econômico e cultural. Essa abordagem permite compreender o complexo sistema de irradiação da doença nos mais diversos ambientes, sendo mais comum em países tropicais e subtropicais. O Centro de Pesquisa Canguçu (CPC) localiza-se no estado do Tocantins, no município de Pium em uma região de transição dos biomas Cerrado/Amazônia. O presente trabalho objetivou analisar a participação dos morcegos frugívoros no processo epidemiológico de disseminação do fungo Histoplasma capsulatum no Centro de Pesquisa Canguçu, utilizando técnicas de captura com redes de neblina “mist nets” e coleta de material biológico do tipo guano seco e fresco e o cultivo em laboratório das amostras em Ágar Sabouraud a fim de se determinar a presença do agente etiológicoe as condições ambientais envolvidas na sua disseminação e infecção. Outro ponto relevante como foco do estudo foi o perfil climático da região e sua relação com as amostras das culturas obtidas em laboratório. Na área do Centro foi verificada a presença de esporos do fungo, assim também como no sistema gastrointestinal dos morcegos da espécie Carollia perspicillata, sendo positivada quinze por cento das culturas das amostras do guano seco e fresco, demonstrando a necessidade de cuidado redobrado com os frequentadores do Centro, em especial às pessoas imunocomprometidas. / Histoplasmosis is a systemic mycosis that can range from an asymptomatic infection to the disseminated, potentially fatal form. Caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, it is treated in a transdisciplinary way, its epidemiology is based on four pillars: biological, social, economic and cultural. This approach allows to understand the complex system of irradiation of the disease in the most diverse environments, being more common in tropical and subtropical countries. The Canguçu Research Center (CPC) is located in the state of Tocantins, in the municipality of Pium in a transition region of the Cerrado / Amazon biomes. The objective of this work was to analyze the participation of frugivore bats in the epidemiological process of dissemination of the fungus Histoplasma capsulatum at the Canguçu Research Center, using mist nets and collection of dry and fresh guano type biological material. laboratory culture of the samples in Sabouraud Agar in order to determine the presence of the etiologic agent and the environmental conditions involved in its dissemination and infection. Another relevant point as the focus of the study was the climatic profile of the region and its relation with the samples of the cultures obtained in the laboratory. In the area of the Center, the presence of spores of the fungus was verified, as well as in the gastrointestinal system of the bats of the Carollia perspicillata species. Fifteen percent of the cultures of the dry and fresh guano samples were positivized, demonstrating the need for redoubled care with regulars of the Center, in particular to immunocompromised persons.

Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B is a cosmopolitan, devastating insect pest due to their direct damages and transmission of plant viruses. Entomopathogenic fungi comprise the most diverse group of pathogens regulating arthropod pest populations in agroecosystems. Anamorphic fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea, and Lecanicillium spp., are among the main biocontrol agents of whitefly populations. Advances in research focusing on virulence, mass production, formulation, and storage stability of fungal propagules are imperative for the development of efficient mycopesticides toward whiteflies and other soft-bodied insects. Therefore, this study placed emphasis on screening for virulent fungal strains, enhancement of efficacy using nonionic surfactants in spray tank-mix, development of liquid culture conditions for rapid production and stabilization processes of single-yeast like cells known as blastospores. Firstly, we selected virulent strains of B. bassiana and I. fumosorosea displaying fastest speed of kill and inciting highest mortality levels of whitefly nymphs and adults along with their ability to produce high numbers of conidia on moistened parboiled rice. Secondly, insecticidal performance was enhanced by combining nonionic surfactants with spore suspensions rendering additive or synergistic effects. These surfactants also allowed reducing the volume application rate without altering fungal bioefficacy. Results from liquid fermentation studies using B. bassiana and I. fumosorosea revealed that appropriate amounts of inexpensive ingredients, such as cottonseed flour and glucose, are suitable for the rapid production of high yields of blastospores (3 days pre-culture and 2-3 days culture). The resultant blastospores of various strains survived well to desiccation and remained viable for more than one year under refrigeration. Moreover, these air-dried blastospores of both fungal species showed higher virulence against whitefly nymphs when compared with solid-substrate produced conidia. Optimized liquid culture production for B. bassiana blastospores was also achieved through the manipulation of oxygen rates and osmotic pressure in the liquid media. Furthermore, these blastospores produced in highly aerated and hyperosmotic liquid medium containing 140 g glucose L-1 were also more virulent to whitefly nymphs than those cells derived from low-osmotic medium amended with 40 g glucose L-1. These optimal conditions were also scaled up in 5-L bioreactor that yielded 1-2 × 1012 viable blastospores L-1 in 6 days at a cost of US$ 0.19 L-1. These blastospores were formulated with diatomaceous earth for air drying or for spray drying. Formulated blastospores of B. bassiana survived dehydration using both drying methods and showed improved shelf life when stored under vacuumpackaged at 4 °C rather than 28 °C. However, when these blastospores were actively packaged with dual action oxygen-moisture scavenging system, blastospores showed prolonged stability for up to 7 months at 28 °C and still remained virulent to whiteflies. Therefore, this low-cost production and stabilization method for the rapid production of shelf stable, virulent blastospores of B. bassiana and I. fumosorosea may expand the commercial use of mycopesticides for insect control in mainstream agriculture. / A mosca-branca, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biótipo B, é uma praga cosmopolita e devastadora devido aos prejuízos oriundos dos seus danos diretos e transmissão de vírus. Fungos entomopatogênicos compreendem um grupo diversificado, que desempenha ação importante na regulação de populações de praga em agroecossistemas. Fungos ascomicetos anamórficos, como Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea e Lecanicillium spp., constituem relevantes agentes de biocontrole de moscas-brancas. Avanços na pesquisa focando virulência, produção massal, formulação e estabilização de propágulos fúngicos são fundamentais para o desenvolvimento de micopesticidas eficientes contra moscas-brancas e outros insetos. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar isolados fúngicos virulentos à mosca-branca; aumentar a eficácia mediante uso de surfactants não-iônicos em suspensões conidiais; desenvolver meios de cultura para produção rápida e estável por fermentação líquida submersa de células leveduriformes conhecidas por blastosporos. Na primeira etapa, isolados virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea foram selecionados pela rápida e elevada atividade inseticida a ninfas e adultos de mosca-branca, bem como alto rendimento de conídios em arroz parboilizado. A adição de surfactantes organosiliconados permitiu a redução do volume de calda aplicado com resultados aditivos ou sinérgicos de controle. Foi ainda verificado que altos rendimentos de blastosporos tanto de B. bassiana como I. fumosorosea foram obtidos em curto tempo de fermentação líquida (3 dias de précultivo e 2-3 dias de cultivo) usando nutrientes de baixo custo, como glucose e farelo de algodão. Esses blastosporos foram tolerantes à dessecação e mantiveram viabilidade por mais de um ano sob refrigeração (4 °C). Os blastosporos foram mais virulentos que conídios aéreos, o que coloca esta estrutura como a mais indicada como ingrediente ativo em bioinseticidas para moscas-brancas. Mediante manipulação nutricional e física do ambiente de fermentação, a produção de blastosporos de B. bassiana foi optimizada mediante aumento da aeração e pressão osmótica do meio líquido. Blastosporos produzidos em meio líquido altamente aerado e hiperosmótico (140 g glucose L-1) mostraram-se mais virulentos à mosca-branca em relação àqueles produzidos em meio hipo-osmótico (40 g glucose L-1). Esse processo foi reproduzido em escala piloto usando biorreator de 5 L resultando numa produção de 1-2 × 1012 blastosporos viáveis L-1 em apenas 3 dias a um custo de US$ 0,19 L-1. Blastosporos de B. bassiana formulados com terra de diatomáceas e secados em fluxo de ar contínuo, ou secados em spray dryer tiveram estabilidade extendida por até 8 meses a 4 °C e superior em relação a 28 °C. Durante empacotamento, o uso de sachês absorventes de oxigênio e umidade prolongou consideravelmente a viabilidade de blastosporos armazenados a 28 °C por até 7 meses sem afetar sua eficiência contra mosca-branca. Em suma, esses resultados demonstram a viabilidade técnica e econômica de produção de blastosporos virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea, tolerantes à dessecação e estáveis durante armazenamento. Esta tecnologia é uma nova opção que pode contribuir para expansão comercial de bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos.

Orientador: Arielle Cristina Arena / Resumo: Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), entre eles o Ibuprofeno, são amplamente utilizados para o tratamento da dor e de processos inflamatórios, e estão entre as classes de medicamentos mais utilizadas por gestantes. Através da inibição da enzima ciclo-oxigenase, os AINEs inibem a síntese de prostaglandinas, compostos eicosanoides que atuam não somente como mediadores e moduladores inflamatórios, mas também em diversos processos fisiológicos do organismo, como no mecanismo de diferenciação sexual hipotalâmica. O processo de masculinização do hipotálamo é dependente de testosterona, que por ação da enzima citocromo P450 aromatase, é convertida em estradiol. Este hormônio regula positivamente a expressão da enzima ciclo-oxigenase no hipotálamo, aumentando a produção de prostaglandina do subtipo E2 (PGE2), que atua aumentando a formação de espinhas dendríticas no núcleo sexualmente dimórfico da área pré-optica (SDN-POA). Em virtude da importância da PGE2 no processo de diferenciação sexual hipotalâmica, torna-se preocupante o uso de anti-inflamatórios durante a gestação. Desta forma, o objetivo desse estudo foi avaliar os possíveis efeitos resultantes da exposição in utero e lactacional ao ibuprofeno e suas repercussões tardias sobre parâmetros reprodutivos masculinos em ratos machos. Para tanto, ratas prenhes foram expostas a três doses de ibuprofeno (10; 30; 60 mg/kg) entre a última semana de prenhez (Dias gestacionais 15-21) até o final da lactação (Dias pós-natal 21)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID), including Ibuprofen, are widely used in the treatment of pain and inflammatory processes, and are of the most commonly classes of drugs used by pregnant women. By inhibiting the cyclooxygenase enzyme (COX), NSAID inhibit the synthesis of prostaglandins, eicosanoids compounds that act not only as mediators and inflammatory modulators, but also in various physiological processes of the organism, such as in the mechanism of sexual hypothalamic differentiation. The hypothalamus masculinization process is testosterone dependent, which by action of the aromatase cytochrome P450 enzyme is metabolized to estradiol. This hormone upregulates the expression of COX enzyme in the hypothalamus, increasing the production of prostaglandin E2, which acts by increasing the formation of dendritic spines in the neurons of the sexually dimorphic nucleus of the preoptic area in males (SDN-POA). Due to the importance of prostaglandin E2 in the process of hypothalamic sexual differentiation, the use of anti-inflammatory drugs during pregnancy is of concern. Thus, the aim of this study was to evaluate the possible effects resulting from in utero and lactation exposure to non-steroidal anti-inflammatory ibuprofen and its late repercussions on male reproductive parameters in male rats. For this, pregnant rats were exposed to three doses of ibuprofen (10; 30; 60 mg/kg) between the last week of pregnancy (Gestational Days 15-21) until the end of lactation (P... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B is a cosmopolitan, devastating insect pest due to their direct damages and transmission of plant viruses. Entomopathogenic fungi comprise the most diverse group of pathogens regulating arthropod pest populations in agroecosystems. Anamorphic fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea, and Lecanicillium spp., are among the main biocontrol agents of whitefly populations. Advances in research focusing on virulence, mass production, formulation, and storage stability of fungal propagules are imperative for the development of efficient mycopesticides toward whiteflies and other soft-bodied insects. Therefore, this study placed emphasis on screening for virulent fungal strains, enhancement of efficacy using nonionic surfactants in spray tank-mix, development of liquid culture conditions for rapid production and stabilization processes of single-yeast like cells known as blastospores. Firstly, we selected virulent strains of B. bassiana and I. fumosorosea displaying fastest speed of kill and inciting highest mortality levels of whitefly nymphs and adults along with their ability to produce high numbers of conidia on moistened parboiled rice. Secondly, insecticidal performance was enhanced by combining nonionic surfactants with spore suspensions rendering additive or synergistic effects. These surfactants also allowed reducing the volume application rate without altering fungal bioefficacy. Results from liquid fermentation studies using B. bassiana and I. fumosorosea revealed that appropriate amounts of inexpensive ingredients, such as cottonseed flour and glucose, are suitable for the rapid production of high yields of blastospores (3 days pre-culture and 2-3 days culture). The resultant blastospores of various strains survived well to desiccation and remained viable for more than one year under refrigeration. Moreover, these air-dried blastospores of both fungal species showed higher virulence against whitefly nymphs when compared with solid-substrate produced conidia. Optimized liquid culture production for B. bassiana blastospores was also achieved through the manipulation of oxygen rates and osmotic pressure in the liquid media. Furthermore, these blastospores produced in highly aerated and hyperosmotic liquid medium containing 140 g glucose L-1 were also more virulent to whitefly nymphs than those cells derived from low-osmotic medium amended with 40 g glucose L-1. These optimal conditions were also scaled up in 5-L bioreactor that yielded 1-2 × 1012 viable blastospores L-1 in 6 days at a cost of US$ 0.19 L-1. These blastospores were formulated with diatomaceous earth for air drying or for spray drying. Formulated blastospores of B. bassiana survived dehydration using both drying methods and showed improved shelf life when stored under vacuumpackaged at 4 °C rather than 28 °C. However, when these blastospores were actively packaged with dual action oxygen-moisture scavenging system, blastospores showed prolonged stability for up to 7 months at 28 °C and still remained virulent to whiteflies. Therefore, this low-cost production and stabilization method for the rapid production of shelf stable, virulent blastospores of B. bassiana and I. fumosorosea may expand the commercial use of mycopesticides for insect control in mainstream agriculture. / A mosca-branca, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biótipo B, é uma praga cosmopolita e devastadora devido aos prejuízos oriundos dos seus danos diretos e transmissão de vírus. Fungos entomopatogênicos compreendem um grupo diversificado, que desempenha ação importante na regulação de populações de praga em agroecossistemas. Fungos ascomicetos anamórficos, como Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea e Lecanicillium spp., constituem relevantes agentes de biocontrole de moscas-brancas. Avanços na pesquisa focando virulência, produção massal, formulação e estabilização de propágulos fúngicos são fundamentais para o desenvolvimento de micopesticidas eficientes contra moscas-brancas e outros insetos. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar isolados fúngicos virulentos à mosca-branca; aumentar a eficácia mediante uso de surfactants não-iônicos em suspensões conidiais; desenvolver meios de cultura para produção rápida e estável por fermentação líquida submersa de células leveduriformes conhecidas por blastosporos. Na primeira etapa, isolados virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea foram selecionados pela rápida e elevada atividade inseticida a ninfas e adultos de mosca-branca, bem como alto rendimento de conídios em arroz parboilizado. A adição de surfactantes organosiliconados permitiu a redução do volume de calda aplicado com resultados aditivos ou sinérgicos de controle. Foi ainda verificado que altos rendimentos de blastosporos tanto de B. bassiana como I. fumosorosea foram obtidos em curto tempo de fermentação líquida (3 dias de précultivo e 2-3 dias de cultivo) usando nutrientes de baixo custo, como glucose e farelo de algodão. Esses blastosporos foram tolerantes à dessecação e mantiveram viabilidade por mais de um ano sob refrigeração (4 °C). Os blastosporos foram mais virulentos que conídios aéreos, o que coloca esta estrutura como a mais indicada como ingrediente ativo em bioinseticidas para moscas-brancas. Mediante manipulação nutricional e física do ambiente de fermentação, a produção de blastosporos de B. bassiana foi optimizada mediante aumento da aeração e pressão osmótica do meio líquido. Blastosporos produzidos em meio líquido altamente aerado e hiperosmótico (140 g glucose L-1) mostraram-se mais virulentos à mosca-branca em relação àqueles produzidos em meio hipo-osmótico (40 g glucose L-1). Esse processo foi reproduzido em escala piloto usando biorreator de 5 L resultando numa produção de 1-2 × 1012 blastosporos viáveis L-1 em apenas 3 dias a um custo de US$ 0,19 L-1. Blastosporos de B. bassiana formulados com terra de diatomáceas e secados em fluxo de ar contínuo, ou secados em spray dryer tiveram estabilidade extendida por até 8 meses a 4 °C e superior em relação a 28 °C. Durante empacotamento, o uso de sachês absorventes de oxigênio e umidade prolongou consideravelmente a viabilidade de blastosporos armazenados a 28 °C por até 7 meses sem afetar sua eficiência contra mosca-branca. Em suma, esses resultados demonstram a viabilidade técnica e econômica de produção de blastosporos virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea, tolerantes à dessecação e estáveis durante armazenamento. Esta tecnologia é uma nova opção que pode contribuir para expansão comercial de bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos.