Thesis (Ph.D. in Pharmaceutical Sciences) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 209-236). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

L’intérêt des peptides comme des médicaments potentiels est en constante augmentation. Des stratégies ont été développées pour améliorer la sélectivité, l’activité, et la stabilité des peptides vis-à-vis de la protéolyse. Dans ce mémoire de thèse, deux nouvelles modifications de peptides sont proposées.Dans le premier chapitre, nous présentons une nouvelle application de la réaction de transfert O-N acylique pour la synthèse de peptides agrafés (ou ‘stapled peptides’). L’introduction d’une ‘agrafe’ dans un peptide est un moyen de stabiliser une structure secondaire hélicoïdale en établissant un pont entre les résidus appropriés des chaînes latérales. Dans notre cas, l'agrafe est formée par un O-acyl isodipeptide. La liaison ester peut être convertie en liaison amide par un transfert O-N acylique. Cette stratégie permet une amélioration de la solubilité d’un peptide hydrophobe agrafé, avant son réarrangement à pH neutre.Dans le dernier chapitre, nous avons développé une méthodologie nouvelle pour la dimérisation de peptides non protégés. Cette méthode repose sur la formation de liaisons siloxane entre des peptides hybrides portant chacun un groupement dimethylchlorosilane. Nous avons ainsi dimérisé une séquence dérivée de la protéine p53, impliquée dans l’apoptose. A titre de comparaison, cette même séquence a été dimérisée en utilisant la cycloaddition d’Huisgen entre deux peptides modifiés possédant un azoture ou un alcyne en position N-terminale. Enfin, plusieurs dimères de la séquence du GHRP-6 (growth hormone releasing peptide) ont été synthétisés, avec des bras dimethylhydroxysilane placés à différentes positions. L’homodimérisation a été effectuée dans l'eau à pH neutre. / The interest in peptides as potential drug candidates was revived and is increasing constantly. Strategies have been developed to improve their selectivity and activity, and their stability toward proteolysis. In this thesis, two new peptide modifications are proposed.In the first chapter, we present a new application of the O-N acyl transfer reaction for the synthesis of stapled peptides. Peptide ‘stapling’ is a way of stabilizing secondary helical structure by establishment of a bridge between the side chains of suitable residues. In our case, the staple is formed by an O-acyl isopeptide which can be converted into amide bond by acyl migration. This strategy allows an improved solubility of the stapled hydrophobic peptide prior to rearrangement at neutral pH.In the last chapter, we developed also a new methodology for the dimerization of unprotected peptides. This method is based on siloxane bond formation between hybrid dimethylhydroxysilane peptides. A peptide derived from the tumor suppressor protein p53 was dimerized in water, at neutral pH using this methodology. The method was compared with the homodimerization carried out by Cu(I) azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). For that purpose, p53 peptide derivative was synthesized with azide and alkyne linkers at the N-terminus. At last, several homodimers of growth hormone releasing hexapeptide (GHRP-6) were synthesized, with dimethylhydroxy silane linkers placed at various positions.

Cette thèse se focalise sur la synthèse multi-étape et l’étude par différentesspectroscopies de plusieurs systèmes supramoléculaires photoactifs. Des sondes fluorescentesmoléculaires capables d’éjecter le Ca2+ de façon réversible ont été élaborées afin de modulerl’arrivée et le départ d’ions Ca2+ dans un milieu. Ces photoéjecteurs basés sur le récepteur àCa2+ BAPTA (l’acide 1,2-bis(2-aminophénoxy)éthane-N,N,N’,N’-tetraacétique) et sur desfluorophores photodimérisables, ont été synthétisés. Leurs comportements photochimiquesont été testés. Ensuite, des échangeurs d’ions moléculaires ont été développés afin d’étudier lavariation de Ca2+ et Mg2+ à partir de deux récepteurs synthétiques. Ils sont basés sur deuxrécepteurs hydrosolubles, le BAPTA pour Ca2+ et l’APTRA (l’acide o-aminophénol-N,N,Otriacétique)permettant de complexer sélectivement le Mg2+. Ces récepteurs ont été conçusafin que Mg2+ et Ca2+ ne puissent être complexés simultanément. Enfin, des boites quantiquesdécorées de ligands pyrène ont été synthétisées pour obtenir un senseur optique à oxygène. / This thesis focuses on the multi-step synthesis and study of several photoactivesupramolecular systems by different spectroscopies. Fluorescent sensors capable of reversiblyejecting Ca2+ were developed in order to control the arrival and depart of Ca2+ ions insolution. These photoejectors were synthesized based on the Ca2+ receptor BAPTA (1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid) and on photodimerizable fluorophores andtheir photochemical behaviour was tested. Molecular ion exchangers were developped inorder to study the variation of Ca2+ and Mg2+ with two synthetic receptors. Their molecularstructures hydrosoluble receptors: BAPTA for Ca2+ and APTRA (o-aminophenol-N,N,Otriaceticacid) allowing the selective complexation of Mg2+. Integration of these receptorsensures that Mg2+ and Ca2+ cannot be simultaneously complexed. Finally, quantum dotsdecorated at the surface with pyrene-containing ligands were synthesized to obtain aratiometric optical oxygen sensor.

Les plantes sont de plus en plus confrontées à une diminution de la disponibilité en eau du sol, constituant une contrainte hydrique et osmotique impactant leur survie. La tolérance des plantes face à cette contrainte sera conditionnée par la perception de celle-ci. Un des mécanismes de signalisation de cette contrainte est appelé MultiStep Phosphorelay (MSP) et est composé de 3 partenaires : un récepteur Histidine-aspartate Kinase (HK), des protéines Histidine Phosphotransfert (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR), dont les facteurs de transcription RR-B. Chez Arabidopsis, un MSP constitué d’AHK1, AHP2 et ARR18 a été identifié dans le cadre de la contrainte osmotique. Pour le peuplier, HK1a et b, gènes paralogues et homologues à AHK1, ainsi que 10 et 9 gènes codant respectivement des HPt et des RR-B ont été isolés. La fonction d’osmosenseur d’HK1a a été avancée, et une voie de signalisation de la contrainte osmotique chez le peuplier constituée de ce récepteur, 3 HPt et 6 RR-B a été proposée. L’objectif de la thèse visait à déterminer et caractériser des facteurs de transcription RR-B liés à la contrainte osmotique de façon spécifique. Les résultats phares de cette thèse sont la mise en évidence de la fonction de facteur de transcription de deux RR-B, RR13 et RR19, via l’étude de leur capacité à dimériser et à transactiver ou non des gènes de réponses à la contrainte osmotique. Le RR13 semblerait spécifique de la voie cytokinines et le RR19 de la voie osmosensing. Ce travail étaye fortement l’implication du RR19 dans le MSP dédié à cette contrainte. De nombreuses études ont par ailleurs été initiées durant ce travail de thèse et pourront faciliter la caractérisation du MSP étudié. / Plants are increasingly faced with a decrease in soil’s water availability, leading to a hydric and osmotic stress and impacting on their survival. Plant tolerance to this stress will be dependent on its perception. One of the signaling mechanisms related to this stress is called MultiStep Phosphorelay (MSP) and is composed by 3 partners: a histidine-aspartate receptor kinase (HK), histidine phosphotransfer proteins (HPt) and response regulators (RR), including the B-type RR transcription factors. In Arabidopsis, an MSP with AHK1, AHP2 and ARR18 has been identified for osmotic stress signaling. For poplar, HK1a and b, paralogous genes and homologous with AHK1, 10 HPt and 9 B-type RR genes have been isolated respectively. The osmosensor function of HK1a was proposed, and an osmosensing signaling pathway composed by HK1a, 3 HPt proteins, and 6 B-type RR has been suggested. The purpose of this work was focused on the identification and characterization of B-type RR transcription factors specifically linked to osmotic stress in poplar. The main results of this work are the highlight of the transcription factor function of two B-type RR, RR13 and RR19, through the study of their ability to dimerize and transactivate or not osmotic stress-responsive genes. The RR13 seems to be specific for cytokinins signaling pathway, whereas the RR19 seems to be specific for the osmosensing one. This work strongly supports the involvement of RR19 in the osmosensing MSP. Many studies have also been initiated during this work and will facilitate the characterization of the studied MSP.

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An extended Hubbard model with large short and long-ranged Coulomb repulsions and distant transfer is numerically investigated by use of the Lanczos exact diagonalization (ED) method to study the charge order and unconditional dimerization of a chain at density rho (ρ)= 0.4. From the analysis of the spin and charge correlation functions, a picture consistent with the formation of a dimer insulating state, which is of Wigner lattice-type (WL) charge order (CO), is obtained. The next-nearest neighbour (NNN) hopping t2 enhances the intradimer correlations and weakens the interdimer correlations. Implications for the CuO2 chains in Sr14Cu24O41 are discussed.We have also introduced a Heisenberg model which parametrically depends on hole positions. If the electrostatic hole-hole repulsion is included such a model allows to evaluate all energy eigenvalues and eigenstates (for small system size) and thus enables us to evaluate thermodynamic properties as function of temperature,magnetic field, and doping. Assuming certain exchange constants we can investigate the influence of the electrostatic hole-hole repulsion on ground state properties as well as on thermal averages like the magnetization which include contributions of low-lying spin-hole configurations.

A series of picosecond excite-probe experiments was performed on various concentrations of aqueous and ethanolic solutions of rhodamine B in order to determine the existence of dimerization in those solutions. The goals of the research presented in this dissertation were twofold. Initially, various techniques of time-resolved spectroscopy were to be employed to further characterize the ground and excited-state molecular properties of the aqueous RB dimer. The information obtained, and the techniques developed in that study would then be utilized in an effort to secure evidence which would support or refute the claims of rhodamine B dimerization in an ethanolic solution.

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Une étape clé dans la maturation des pré-ARNms est le clivage et la polyadénylation que ceux-ci subissent sur leur extrémité 3’. Chez les métazoaires, le complexe CstF (Cleavage stimulation Factor) reconnaît une région de l’ARNm riche en U et U/G et stabilise le complexe CPSF (Cleavage Polyadenylation Stimulating Factor) sur le site de polyadénylation. Nous avons déterminé la structure cristallographique du domaine N-terminal d’une des trois sous-unités de CstF, CstF-50. Ce domaine forme un homodimère compact et présente deux surfaces identiques conservées dérivées de la formation du dimère. La structure dimérique de CstF-50 est en accord avec le modèle hexamèrique du complexe. L’homologue de CstF chez la levure, CF IA (Cleavage/polyadenylation Factor IA), est impliqué dans les réactions de clivage et polyadénylation de la maturation 3’. Nous avons reconstitué le complexe entier ‘in vitro’ et résolu la structure en solution par RMN des régions minimales impliquées dans l’interaction des sous-unités Rna14p et Rna15p. Pour la formation de l’hétérodimère, la région C-terminale de Rna14p, que nous avons appelé domaine « monkeytail », s’entrelace intimement avec la région « hinge » de Rna15p. La présence de ces deux domaines chez leurs homologues de mammifères, CstF-77 et CstF-64, suggère la conservation de ce type d’organisation entre ces deux sous-unités à travers les espèces. / The removal of the 3’ region of pre-mRNA followed by polyadenylation is a key step in mRNA maturation. In metazoa, Cleavage stimulation Factor (CstF) recognizes U and G/U rich cis-acting RNA sequence elements through its 64kDa subunit and helps stabilize the Cleavage Polyadenylation Stimulating Factor (CPSF) complex at the polyadenylation site. We describe the crystal structure of the N-terminal domain of the CstF-50 subunit. Through highly conserved residues, CstF-50 forms a compact homodimer that exposes two geometrically opposite and identical conserved surfaces. Together with prior data, the structure of the CstF-50 homodimerization domain supports a hexameric model of CstF. The yeast homologue of CstF is the Cleavage/polyadenylation Factor IA (CF IA) complex and is involved in both the cleavage and polyadenylation of pre-mRNA. We have reconstituted ‘in vitro’ the overall complex and also solved the solution structure of one of the inter-subunit regions, specifically the heterodimer involving peptides from Rna14p and Rna15p. Upon binding, a short C-terminal region from Rna14p wraps intimately within the central hinge domain from Rna15p. Conservation of residues reveals that the structural tethering is preserved in the homologous mammalian proteins. / La maduración 3’ del pre-ARNm es un proceso clave de la expresión génica que incluye el corte y la poliadenilación del extremo 3’ libre del pre-ARNm. En metazoos, el complejo CstF (Cleavage stimulation Factor) reconoce una secuencia del pre-ARNm rica en U y G/U y permite la estabilización del complejo CPSF (Cleavage Polyadenylation Stimulating Factor) en el sitio de poliadenilación. Hemos descrito la estructura cristalina del dominio N-terminal de una de las tres subunidades de CstF, CstF-50. La estructura ha revelado la organización de la proteína en un dímero compacto y conservado entre las especies. Dos zonas idénticas conservadas se encuentran expuestas a ambos lados de la superficie estructural. Nuestros resultados corroboran así la hipótesis sobre el modelo hexamérico del complejo CstF. CF IA (Cleavage/ polyadenylation Factor IA), el homólogo de CstF en levaduras, interviene en las dos etapas de la maduración 3’. Las bases para la reconstitución del factor CF IA ‘in vitro’ han sido establecidas. Al mismo tiempo, hemos resuelto la estructura del subcomplejo formado por las regiones de interacción de Rna14p y de Rna15p en solución mediante RMN. En el heterodímero, las dos proteínas forman una entidad única a través de la región C-terminal de Rna14p, dominio “monkeytail”, y el dominio “hinge” de Rna15p, quedando las hélices de la dos proteínas entrelazadas. La localización de estos dominios en sus homólogos mamíferos, CstF-77 et CstF-64, sugiere que este tipo de organización está conservada entre las especies.

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA. / Natriuretic peptide receptor-A (NPRA) is a member of the particulate guanylate cyclase family. NPRA activation by natural agonists, ANP and BNP, leads to cGMP production, which is responsible for their role in cardiovascular homeostasis, cardiac hypertrophy and fibrosis inhibition and lipolysis regulation. NPRA is a non covalent dimer composed of an extracellular domain (ECD) with a ligand binding site, a single transmembrane region (TM), a kinase homology domain, and a guanylyl cyclase domain. Although NPRA plays an important physiologic role, molecular mecanisms driving its activation process are yet unknown. We thus analysed the first steps of NPRA’s activation process. First, we studied the role of ECD dimerization in receptor activation and determined the sequential steps of this dimerization process. We used radioligand binding, FRET and molecular modeling to characterize the interaction of ECD with natural agonists, a superagonist and an antagonist. ANP binds to preformed ECD dimers and spontaneous dimerization is the rate-limiting step of the ligand binding process. Furthermore, like demonstrated with fluorescence homoquenching, all the studied peptides, including A71915 antagonist, stabilize a dimeric form of the receptor. However, A71915 stabilizes the ECD dimer in a conformation distinct from those induced by ANP. Thus, ECD dimerization is necessary but not sufficient for NPRA activation. The activation state of NPRA seems to depend on the orientation of the receptor subunits within the dimer. Then, we tried to identify the molecular mechanism of signal transduction through the plasma membrane. Previous studies have shown that activation of NPRA involves a conformational change of the juxtamembrane domain (JM). However, crystallographic study of the soluble ECD of NPRA has failed to document JM structure, and the conformational change involved in transmembrane signal transduction is still unknown. To analyse this conformational change, we first sequentially substituted nine amino acids of JM by a cysteine residue. By studying the mutant’s capacity to form ANP-induced or constitutive covalent disulfide dimers, we evaluated the relative proximity of JM residues, before and after NPRA activation. These results demonstrate a high proximity of specific JM residues and are in disagreement with crystallography data. We also demonstrated that intracellular domain imposes a conformational constraint on JM at basal state, which becomes relaxed upon ANP binding. We finally confirmed, with a full-length receptor, that A71915 stabilizes NPRA in a dimeric form where JM are in a conformation distinct from the basal state. By introducing 1 to 5 alanine residues in the transmembrane α-helix, we showed that a TM rotation of 40° leads to constitutive NPRA activation. Activation signal could thus be transmitted through the membrane by a TM rotation mechanism. We finally studied the role of the TM in NPRA dimerization. By using the ToxR system, we demonstrated that the last JM residues are required to stabilize the TM dimer. Using these experimental data, we generated the first molecular model illustrating the active conformation of NPRA, where JM and TM are depicted. In summary, this study allows a better understanding of molecular mecanisms driving the first steps of NPRA’s complex activation process.