Neste trabalho apresentamos simulações em dinâmica molecular de uma “brush” de polieletrólitos esférica, cercada de contraíons, em um meio livre de sais, onde a heterogeneidade dielétrica entre os materiais é levada em consideração. Estes conjuntos de polieletrólitos tem sido estudados experimentalmente de maneira ampla, tendo mostrado uma gama de diferentes aplicações como o uso para biosseparação e como portadores de drogas/genes para transporte controlado. Entretanto, teorias e simulações formais que expliquem o seu comportamento não são tão numerosas. A teoria e o trabalho presentes são detalhados nesta dissertação na forma de múltiplas seções, mas os resultados permanecem contidos ao artigo anexado1 publicado em 2017. Começamos com uma breve introdução do trabalho e então apresentamos o artigo, posteriormente a teoria é melhor explorada no apêndice da metodologia, finalmente, terminamos com as considerações finais para com os resultados do trabalho e as conclusões do projeto. O projeto consiste das simulações anteriormente mencionadas, as quais tinham o propósito principal de investigar os efeitos da descontinuidade dielétrica, entre o núcleo da “brush” e o meio em que está envolta, sobre a dinâmica do sistema. Isso é investigado através do uso do método de cargas imagem. As propriedades da “brush” de polieletrólitos também são obtidas para diferentes parâmetros, dentre os quais, a valência dos contra íons, o raio da nanopartícula central e a carga total da “brush”. Uma teoria de campo médio é apresentada para comparação com os perfis de densidade obtidos para os contra íons monovalentes, e nós terminamos o artigo apresentando as propriedades osmóticas do sistema. / In this work we present a molecular dynamics simulation of a polyelectrolyte spherical brush and counterions in a salt-free medium, in which the dielectric inhomogeneity between materials is taken in consideration. Polyelectrolyte brushes have been studied experimentally broadly, having shown a range of different applications such as for bioseparation and targeted drug/gene delivery. In spite of that, formal simulations and theories explaining its behavior are not as numerous. The theory and the work we present are unfold into more details throughout the thesis in the form of multiple sections, but the results remain contained to the paper annexed1, published in 2017. We start with a brief introduction of the work and then present the paper, later on, the theory is further explored in the methodology appendix, and we finish with the final considerations for the work results and the project conclusion. The project consists of the aforementioned simulations with the main purpose of investigating the effect of the dielectric discontinuity, between the brush core and its surrounding medium, over the dynamics of the system. This is investigated through the use of the method of image charges. Properties of the polyelectrolyte brush are obtained for different parameters, including valence of the counterions, radius of the nanoparticle and the brush total charge. A mean-field theory is presented for the comparison with density profiles obtained for monovalent counterions, and we finish the paper by presenting the osmotic properties of the system.

Neste trabalho, a docagem e a dinâmica molecular foram utilizadas para investigar a interação entre oligonucleotídeos e duas bases de Tröger: uma base simétrica - contendo duas proflavinas – e uma base assimétrica – contendo uma proflavina e uma fenantrolina. Nas docagens que utilizaram DNA canônico com gap como receptor, os resultados reproduziram corretamente a estereosseletividade da interação, que favorece os isômeros levorrotatórios em relação aos dextrorrotatórios, e apontou para os modos de interação sugeridos pela literatura: ligação ao sulco menor para a Tröger simétrica e intercalação com ligação ao sulco menor (modo misto) para a Tröger assimétrica. Para as simulações, foram escolhidos quatro complexos contendo os enantiômeros levorrotatórios das bases de Tröger e oligonucleotídeos com e sem gap. Embora os complexos representassem pontos de partida diferentes, houve convergência entre aqueles que continham o mesmo oligonucleotídeo como receptor. Os complexos com DNA com gap (complexos de intercalação) convergiram para um modo misto de interação, com intercalação de uma proflavina, enquanto os complexos com DNA sem gap (complexos de ligação ao sulco menor) convergiram para um modo de interação novo, em que as bases de Tröger se ligam ao sulco menor unicamente através da ponte diazocina, com os substituintes projetados para fora. Os complexos de intercalação apresentaram tempos de residência altos (20 ns) e diminuíram o ângulo de torção da dupla hélice na região do gap, levando os ângulos x e y da cadeia principal para uma região não-canônica, associada à forma A do DNA. Já nos complexos de ligação ao sulco menor, houve mudança tanto do modo como do sítio de interação e, embora tenham ocorrido eventuais curvaturas no DNA, não houve alterações significativas nos ângulos da cadeia principal, de modo que a estrutura global do DNA se manteve dentro da região considerada B-canônica. Dessa forma, os resultados sugerem que a intercalação (com adicionais contatos no sulco menor) seja o modo preferencial de interação dessas bases de Tröger com o DNA. O modo de ligação ao sulco menor, por depender quase que exclusivamente da ponte diazocina, seria independente da quiralidade e, portanto, não seria capaz de explicar enantiosselevidade das bases de Tröger. / In this work, molecular docking and molecular dynamics simulations were applied to investigate the interaction between DNA oligomers and two Tröger bases: a symmetric Tröger base derived from proflavine and a mixed Tröger base containing proflavine and phenanthroline. The dockings that used canonical DNA with an artificial intercalation gap as receptor correctly reproduced the stronger DNA binding affinity of the levorotatory isomers when compared to the dextrorotatory ones. Moreover, the results pointed out to the binding modes suggested, yet not established, by experimental data: minor groove binding for symmetric Tröger base and intercalation with additional minor groove binding for the asymmetric one. For the simulations, four complexes were selected, containing the (-)-isomers of the Tröger bases and DNA oligomers with or without intercalation gap. Interestingly, the systems containing the same DNA as receptor converged to similar binding modes: those containing DNA with gap (intercalation complexes) resulted in a mixed binding – with one proflavine intercalated and the other moiety occupying the minor groove – while those containing DNA without gap (minor groove complexes) lead to a new binding mode, in which the Tröger bases interact with the minor groove mainly through the diazocin bridge. In the intercalation complexes, the ligands presented long residence times (20 ns) and also unwound the double helix in the region of the intercalation gap, leading some backbone angles (x and y) to assume non-canonical values typical of the A form of DNA. In minor groove complexes, the ligands displayed enhanced mobility – changing both the binding mode and the binding site – and, although they promoted some bending of the double helix, the main chain torsion angles of DNA remained in the B-canonical region. Altogether, these results suggest that intercalation of proflavine (with additional contacts in the minor groove) might be the stronger DNA binding mode for these Tröger bases. Since the minor groove binding depends almost exclusively of the diazocin bridge, it appears to perform independently of the ligand chirality and, therefore, could not explain the enantioselectivity of the interaction.

Combinando métodos computacionais da eletrostática e dinâmica molecular, este trabalho teve como objetivo descrever processos de solvatação em sistemas quimicamente importantes. Foram obtidas propriedades termodinâmicas necessárias para o entendimento do processo de solvatação. Estão descritos e testados modelos para descrever a interação soluto-solvente, possibilitando, assim, aprimorar a descrição físico-química dos processos de solvatação. Utilizaram-se programas desenvolvidos em nosso grupo e programas comerciais que permitem os cálculos de dinâmica molecular e química quântica. Uma nova abordagem para o cálculo de energia livre de solvatação foi desenvolvida proporcionando a obtenção acurada e eficiente dessa propriedade, dentro do enfoque da dinâmica molecular. Nessa nova abordagem, novas metodologias para a geração de cavidades moleculares foram propostas e avaliadas. As energias livres de solvatação obtidas estão em boa concordância com os valores experimentais.

Acidentes envolvendo abelhas africanizadas são freqüentemente relatados, particularmente na América do Sul. As picadas de abelhas causam reações localizadas e sistêmicas e os sintomas do envenenamento incluem náuseas, vômitos, hemólise, falência renal e coagulação intravascular disseminada. Durante muito tempo todas as reações tóxicas eram atribuídas à presença de uma fosfolipase A2, mesmo sendo o veneno uma mistura complexa de substâncias. A melitina, o componente mais abundante e tóxico do veneno de abelha, é um peptídeo de 26 aminoácidos com a habilidade de interagir e danificar membranas celulares. A melitina é também capaz de modular muitas proteínas, aumentando a diversidade de atividades biológicas do peptídeo. Até recentemente, acreditava-se que a estrutura tri-dimensional biologicamente ativa do peptídeo, que possui conformação em hélice, era um tetrâmero. Neste trabalho avaliamos a conformação da melitina e seus estados oligoméricos em solução por dinâmica molecular e a interferência da melitina na função plaquetária. Aqui está demonstrado que a melitina possui uma conformação randômica em condições fisiológicas e que sua estrutura tri-dimensional sofre alterações de acordo com as condições ambientais. Ainda, foi demonstrada uma nova atividade biológica do peptídeo melitina. O peptídeo é capaz de induzir a 8 agregação plaquetária de forma dose-dependente e de interagir diretamente com a superfície de plaquetas. A correlação entre a conformação da melitina e suas atividades biológicas é discutida. Os resultados aqui apresentados podem ser valiosos no entendimento do papel da melitina nas coagulopatias induzidas por veneno de abelha. O estudo estrutural mostrado aqui pode ser aplicado para explicar as diferentes atividades do peptídeo. / Accidents involving africanized bees are frequently reported, particularly in South America. Bee stings cause localized and systemic reactions and the symptoms of envenomation include nausea, vomiting, hemolysis, kidney failure and disseminated intravascular coagulation. For a long time, all toxic reactions were ascribe to the presence of a phospholipase A2, despite of being the venom a complex mixture of substances. Melittin, the most abundant and the major toxic component of bee venom, is a 26 amino acid peptide with the ability to interact and disrupt cell membranes. Melittin is also able to modulate many proteins, enhancing the wide range of the peptide biological activities. The biologically active tridimensional structure of the peptide, which has a helical conformation, has been described until now as a tetramer. In this work we evaluated the conformation of melittin and its oligomeric states in solution by molecular dynamics simulations and performed studies of melittin effect on platelet function. Here we demonstrate that melittin has a random conformation under physiological conditions and its tridimensional structure changes under different environmental conditions. Moreover, here we describe a new biological activity of melittin. The peptide is able to induce platelet aggregation in a dose10 dependent manner and can interact directly with the platelet surface. The correlation between melittin conformation and biological activity is discussed. Our results might contribute to elucidate the role of melittin in bee venom induced coagulopathies. The structural data gathered in this work may explain the different activities of the peptide.

aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.

A Esqualamina, primeiramente isolada do tubarão Squalus acanthias, é um aminoesteróide promissor para o desenvolvimento de novas drogas, como antibióticos, agentes para o tratamento de vários tipos de câncer e degeneração macular da retina. O principal objetivo desse trabalho é propor um conjunto de cargas atômicas ajustadas para compor o campo de força utilizado em simulações por Dinâmica Molecular para essa molécula. Através de estruturas geradas com a Dinâmica Molecular, obteram-se as cargas atômicas por meio de cálculos quânticos, com metodologia do potencial eletrostático ChelpG. A análise estrutural da molécula revelou que no vácuo ela apresenta formato semelhante a um anel, enquanto que, em meio fisiológico, sua conformação é alterada para uma forma linear. Os resultados obtidos são apoiados pela análise de ligações de hidrogênio, Função de Distribuição Radial (RDF) e Desvios Quadráticos Médios (RMSD). / Squalamine, initially isolated from Squalus acanthias shark, is an aminosterol promising in the development of new drugs, such as antibiotics, agents for the treatment of several kinds of cancer and retina macular degeneration. The aim subject of this work is to propose an atomic charge set to be used in force field by Molecular Dynamics simulations for this molecule. Using structures generated by Molecular Dynamic, the atomic charges were obtained from quantum calculations, with the electrostatic potential methodology ChelpG. According to structural analysis, this molecule was revealed it has a ring shape in vaccum, whereas in fisiological environment its conformation changes to linear form. The results obtained are supported by analysis of hydrogen bonds, Radial Distribution Function (RDF) and Root Mean Square Deviation (RMSD).

Neste trabalho usamos simulações de Dinâmica Molecular para analisarmos interações e alterações estruturais em complexos não covalentes e covalentes entre o fármaco Ecteinascidina (ET743) e o DNA (modelado como dodecâmeros). De acordo com a literatura, a Ecteinascidina forma primeiro um complexo nãocovalente, determinado por ligações de hidrogênio, com um segmento do DNA, sendo que ocorre uma posterior alquilação de uma guanina, levando a um complexo covalente ET743-DNA. Dependendo da seqüência de DNA, constata-se a existência de diferentes reatividades frente à ET743. Assim, foram escolhidas para a formação dos complexos duas seqüências de alta interação com o fármaco, duas de baixa interação e uma de interação moderada. A interação do fármaco induz uma torção estrutural do DNA em direção ao sulco maior, impedido a ação do sistema de reparo celular, levando a morte da célula. Em simulações envolvendo DNA e ligantes, é fundamental a boa parametrização e descrição das interações eletrostáticas e a caracterização dos parâmetros estruturais, bem como de suas flutuações. As simulações confirmaram a interação entre a ET743 e as seqüências escolhidas, sendo constatada a permanência do fármaco no sítio de interação por um longo período de tempo e uma forte distorção dos oligonucleotídeos. A análise das ligações de hidrogênio confirmou algumas das ligações previstas e também algumas não antes reportadas. Não foi constatada nenhuma correlação significativa entre a interação induzida e a reatividade das seqüencias, embora em um caso tenha sido constatada a migração da ET743 em direção a um sítio de interação de maior reatividade. A análise termodinâmica foi realizada calculando-se as energias de interação em complexos não-covalentes e, após, afastando gradualmente os mesmos em relação ao DNA e monitorando os diversos termos energéticos até a convergência. Apesar da estabilidade do complexo, a análise termodinâmica, obtida mediante simulações de afastamento da ET743, mostrou que a formação do complexo não covalente é endotérmica. A simulação dos complexos covalentes destes oligonucleotídeos com o ligante também mostrou fortes distorções induzidas. / In this work we used molecular dynamics simulations to analyse the interactions and induced structural changes in non-covalent and covalent complexes between Ecteinascidin (ET743) and DNA dodecamers. According to the literature, the interaction between Ecteinascidin and DNA involves the formation of a non-covalent complex characterized by several hydrogen bonds with a DNA segment. Further, there is an alkylation of a guanine, leading to a covalent complex between ET743 and DNA. Depending on the base pair sequence, ET743 displays different reactivities. In this work, two sequences of high reactivity, two sequences of low reactivity and one sequence of moderate reactivity were chosen. The interaction between the Ecteinascidin and DNA leads to a bending of the DNA towards the major groove, blocking the cell repair system and leading to cell´s death. In simulations with DNA and ligands the detailed description of the structural parameters as well as a carefull parameterization, especially in the description of the electrostatic interactions, are fundamental. The simulations confirmed the strong interaction between Ecteinascidin and the chosen sequences, with a high residence time of the drug in the site of interaction and a strong distortion of the oligonucleotides. The analysis of the hydrogen bonds (HBs) confirmed some of known HBs and revealed some alternative HBs. There were no significant correlation between the induced distortion and interactions and the reactivity of the sequences, although a migration of the ET743 towards a higher interaction site was found in one system. The thermodynamic analysis was carried out calculating the interaction energies of the non-covalent complexes and gradually increasing the distance between drug and interaction site, until the energetic terms converge. Despite of the stability of the complex, the thermodynamic analysis showed a endothermic enthalpy of formation for the non-covalent complex. The simulation of covalent complexes between ET743 and oligonucleotides also showed strong induced distortions.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

O presente trabalho relata a parametrização do modelo de contínuo IEF-PCM para o estudo da solvatação de ânions monovalentes em acetonitrila e N,N-dimetilformamida. Nós propomos duas metodologias de parametrização do modelo de contínuo polarizável para este estudo teórico. A primeira proposta é baseada unicamente no cálculo do termo eletrostático da energia livre e na equiparação deste termo com a energia livre de solvatação experimental. Na segunda proposta de metodologia, a parametrização do modelo de contínuo polarizável foi realizada com o auxílio das simulações de dinâmica molecular e dentro desta segunda proposta nós calculamos todos os termos que contribuem para a energia livre de solvatação, a energia de cavitação. a energia eletrostática e a energia de van der Waals. Com a aplicação da primeira metodologia, é obtido um erro médio absoluto de 2,1 kcal/mol nas energias de solvatação dos ânions em acetonitrila enquanto que o erro médio absoluto calculado para energias de solvatação dos ânions em N,N-dimetilformamida é 2,8 kcal/mol. A aplicação da segunda metodologia resulta num erro médio absoluto de 1,4 kcal/mol nas energias de solvatação dos ânions em acetonitrila e um erro médio absoluto de 1,2 kcal/mol nas energias de solvatação calculadas para os ânions em N,N-dimetilformamida. Estes resultados indicam que o modelo de contínuo polarizável IEF-PCM é adequado para o estudo dos efeitos termodinâmicos nas soluções de ânions nos solventes acetonitrila e N,N-dimetilformamida.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-15T13:26:00Z No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Anestésicos gerais são diariamente utilizados em uma miríade de procedimentos cirúrgicos. Todavia o intricado mecanismo molecular de ação desses compostos ainda é desconhecido. A hipótese mais creditada sugere uma ação de anestésicos em diferentes canais iônicos de tecidos neurais por interação em múltiplos sítios de ligação nessas proteínas de membrana. Estudos in vitro recentes mostram alteração na condução dos canais de potássio dependentes de voltagem pela ligação de anestésicos halogenados em múltiplas cavidades com distintas afinidades em diferentes conformações. Entre esses canais está o canal iônico dependente de voltagem de mamífero Kv1.2. Foi demonstrado que uma mutação pontual G329T nesse canal iônico confere maior sensibilidade ao anestésico geral sevoflurano. Nesse contexto, a investigação da interação envolve não somente a descoberta de regiões putativas de ligação, como também de que forma essa interação poderia alterar o equilíbrio entre as diferentes conformações do canal iônico. Contudo, a ligação do anestésico pode ser uma condição necessária, mas não suficiente para ter efeito modulatório. Sabese que o sevoflurano, um anestésico inalável, potencializa o canal Kv1.2, deslocando a curva de condutância-voltagem para voltagens mais negativas e aumentando a condutância máxima. Para tanto, foram realizadas simulações de dinâmica molecular do canal Kv1.2 selvagem e do canal Kv1.2 G329T em bicamada lipídica com solvente explícito, a fim de amostrar as flutuações estruturais das conformações aberta e fechada desta proteína. Uma ligeira diminuição da flutuação da cadeia do canal mutante foi conferida por análise de RMSD (Root Mean Square Deviation) e RMSF (Root Mean Square Fluctuation) ao longo das trajetórias. Dessas simulações, foram escolhidos ao acaso 120 frames de cada simulação para a realização de docking molecular por meio do AutoDock Vina, assim obtidos aproximadamente 2400 modos de interação. Após o agrupamento e análise das soluções, foram eleitos os centros das nuvens de soluções de quatro potenciais sítios distintos para estruturar o complexo anestésico-canal e, então, avaliar a afinidade do ligante sítio-específica por cálculos de energia livre baseados em simulações de dinâmica molecular. Pela utilização do método LIE (Linear Interaction Energy), percebeu-se grande afinidade pelo sítio próximo ao filtro de seletividade, de tal forma que este pode estar favorecendo a estabilização da conformação condutiva, logo aumentando a condutância do canal. Pela mutação estar associada com um aumento da constante de equilíbrio para um estado pré-aberto, é proposto que um conjunto de sítios podem estar desestabilizando esse estado. Como resposta ao resultado obtido e pelo desafio em conciliar os resultados microscópicos com o efeito na relação condutância voltagem por anestésico, é apresentado um esquema teórico para avaliar múltiplos estados de ligação. Aqui, é exposta uma perspectiva inicial para uso do modelo teórico apresentado. Ao considerar, por indisponibilidade da definição precisa das outras conformações, apenas as conformações aberta e fechada do canal, além das afinidades obtidas para múltiplos sítios, foi possível calcular as densidades de probabilidades para os estados ligados e, dessa forma, encontrar um deslocamento da curva condutância-voltagem com a mesma tendência ao experimental. Os presentes dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína e permite a proposição de formas de análise do intricado mecanismo de modulação por ligantes, favorecendo assim futuros estudos experimentais dos mecanismos de ação na anestesia. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / General anesthetics are daily used in a myriad of surgical procedures worldwide. Nevertheless their molecular mechanism of action remains elusive. An accredited hypothesis suggests that anesthetics modulate distinct ion channels in neural tissue by interacting in multiple binding sites in these membrane proteins. New in vitro studies show that halogenated anesthetics modifies the conductance/voltage relation of voltage gated potassium channels by binding to multiple cavities with different affinities in a conformationdependent fashion. Within this context, the present investigation is focused not only on searching the putative binding sites, but also on discovering the manner by which the binding could modify the conformation energy landscape, since the binding of the anesthetic can be a necessary but not sufficient condition to have a modulatory effect. The mammal Kv1.2 channel stands as a potential target of inhalation anesthetics. Sevoflurane, a halogenated anesthetic, potentiates this channel, shifting the conductance/voltage relation leftward and increasing the maximum conductance. Recently, the G329 point mutation in this channel has been associated with an augmentation of the sensitivity to the general anesthetic sevoflurane. To explore this issue, molecular dynamics simulations of the Kv1.2 wild type and Kv1.2 G329T inserted in a phospholipidic membrane with explicit water treatment were performed. The sampling was performed to both open and closed conformations. A slightly reduction of fluctuation near the linker S4-S5 was noticed on the mutant by analysis of RMSF through the simulated trajectory. From these simulations, 120 frames were selected from each construction for running docking calculation. These approach was used in order to account for molecular flexibility of the protein. From the molecular docking applying AutoDock Vina, nearly 2400 binding modes were obtained. After clustering and analysis of solutions, four putative independent binding cavities were selected to construct the anesthetic/channel complex and then ligand site-specific affinities were estimated by free energy calculations based on molecular dynamics simulations. By employing the LIE (Linear Interaction Energy) method, a relative strong affinity by the site near the selectivity filter was noted. The interaction with this site could favor the stabilization of the conductive state, hence increasing the conductance of the channel. Since the G329T mutation is associated with an increased equilibrium constant of the pre-open state, it is proposed that a group of sites could destabilize this state. As an answer to the issue of conciliating the obtained binding affinities with the anesthetic effect on the conductance/voltage relation, it is presented here a theoretic model to evaluate multiple binding states. In an initial attempt to analyze the accuracy of the prediction by the model, considering only the conductive open and closed conformations, since the unavailability of a detailed structure of the other relevant states, besides the calculated binding affinities, it was possible to compute probability densities for the bound states, thus estimating a leftward shift on the conductance-voltage curve. The present data reveals putative anesthetic binding regions and potential binding free energies and allows proposition of a approach to rationalize the complex mechanism of modulation by multiple binding sites with multiple occupancies.