Orientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Banca: José Maria Pires / Banca: Alexandre Suman de Araújo / Banca: Sabrina Thais Broggio Costa / Resumo: Peptídeos antimicrobianos são moléculas biologicamente ativas que, geralmente, tem as membranas fosfolipídicas como alvo primário. Resultados de diferentes técnicas experimentais têm sugerido que esses peptídeos permeabilizam as membranas pela formação de poros. Parte dos peptídeos caracterizados apresentam especificidade de disrupção para membranas de bactérias, em detrimento das membranas dos hospedeiros. Essa característica tem atraído a atenção da comunidade científica internacional, porque indica que estas moléculas podem ser modelos para o desenvolvimento de novos antibióticos, portanto o entendimento do mecanismo de ação, ou seja, do mecanismo de formação de poro, tem extrema importância. Simulações por Dinâmica Molecular foram produzidas para investigarmos o impacto que peptídeos antimicrobianos da família Mastoparano tem sobre membranas lipídicas modelo. Dois cenários foram explorados: (i) de baixa concentração peptídeo/lipídeo, P/L=1/128, que consistia de simulações fine-grained das interações de um peptídeo com uma bicamada pura de 128 lipídeos aniônicos (POPG) ou zwiteriônicos (POPC); (ii) de alta concentração, P/L=1/21, que abordava as interações de seis peptídeos com uma bicamada mista de 128 lipídeos POPC/POPG (1/1) usando uma modelagem coarse-grained. Tomando o peptídeo MP1 como caso paradigmático, verificamos que em baixo P/L é possível sugerir que sua característica seletiva surge da capacidade de coordenar e perturbar maior número de lipídeos em membrana aniônica comparada à neutra. Essa capacidade fica acentuada nas simulações com membrana mista, onde a atração dos lipídeos aniônicos pelos peptídeos catiônicos guiou a separação local e a formação de domínios de lipídeos aniônicos, o que facilitou o afinamento local da membrana e a formação de poro transmembrânico. Esses achados ajudam a explicar como peptídeos / Abstract: Antimicrobial peptides are biologically active molecules that, usually, have the phospholipid membranes as a primary target. Results from different experimental techniques have suggested these peptides permeabilize membranes by the pore formation. Part of the characterized peptides have specificity of disruption for bacterial membranes, instead of host membrane. This feature has attracted the attention of the international scientific community, because it indicates that these molecules can be models for the development of novel antibiotics, so understanding the mechanism of action, ie, the mechanism of pore formation, is extremely important. Molecular dynamics simulations were performed to investigate the impact of antimicrobial peptides from the Mastoparano family have on model lipid membranes. Two scenarios were explored: (i) of low peptide/lipid concentration, P/L=1/128, which consisted of fine-grained simulations of the interactions of a peptide with a pure bilayer of 128 anionic (POPG) or zwitterionic (POPC) lipids; (ii) of high concentration, P/L=1/21, which addressed the interactions of six peptides with a mixed bilayer of 128 POPC/POPG (1/1) lipids, using a coarse-grained modeling. Taking the MP1 peptide as a paradigmatic case, we found that in low P/L is possible to suggest that its selective feature arises of its ability to coordinate and disturb large number of lipids in the anionic membrane compared to neutral one. This ability is accentuated in simulations with mixed membrane, where the attraction of the anionic lipids by the cationic peptides led to the local segregation and formation of POPG lipid domains, which facilitated the local thinning of the membrane and the formation of transmembrane pore. These findings help to explain how short peptides, such as MP1, are able of forming pores in a membrane whose thickness is larger than the length of the peptide / Doutor

Orientador: Ney Lemke / Resumo: Os sistemas de importação nuclear são responsáveis pelo intercâmbio entre o citoplasma e o núcleo da célula, permitindo que proteínas com função nuclear migrem através da membrana que separa essas duas regiões. A via de importação mais estudada é a via clássica de importação nuclear mediada pela Importina-α (Impα). A Impα é uma proteína solenóide, composta por repetições em tandem do motivo Armadillo (ARM) que formam uma estrutura longa e contorcida, com pequenos arcabouços ao longo do eixo da proteína. As sequências de localização nuclear clássicas (cNLSs) presentes nas proteínas-alvo de importação são compostas por resíduos carregados positivamente e estabelecem pontes salinas, ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos com esses arcabouços da Impα. Esse reconhecimento pode ocorrer em um ou em dois sítios da Impα, caracterizando a cNLS como monopartida ou bipartida, respectivamente. A maioria das informações estruturais do complexo cNLS-Impα provém de dados de cristalografia e pouco se sabe sobre a dinâmica conformacional deste sistema. Uma abordagem para tratar da dinâmica de um sistema é o uso de técnicas de simulação de biomoléculas, tais como dinâmica molecular e análise de modos normais. Com base nessas técnicas de simulação, o presente estudo teve como objetivo compreender os mecanismos de interação e dinâmica conformacional envolvidos no reconhecimento de cNLSs pela Impα. Particularmente, este trabalho focou nas cNLSs das proteínas Nucleoplasmina e Ku70 complexa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nuclear import systems are responsible for the exchange between the cytoplasm and the nucleus of a cell, allowing nuclear proteins to migrate through the membrane that separates these two regions. The most studied import pathway is the classical nuclear import mediated by Importin-α (Impα). Impα is a solenoid protein consisting of tandem repeats of the Armadillo (ARM) motif, forming an extended and twisted structure with small grooves along the protein axis. The classical nuclear localization sequences (cNLSs) of cargo proteins are composed of positively charged residues and establish salt bridges, hydrogen bonds and hydrophobic contacts with the grooves of Impα. Such recognition can occur at one or two sites of Impα, thus characterizing the cNLS as monopartite or bipartite, respectively. Most structural information of the cNLS-Impα complex is from crystallographic data and little is known about the conformational dynamics of this system. One approach to address the dynamics of a system is the use of biomolecular simulation techniques such as molecular dynamics and normal modes analysis. Based on these techniques, this study aimed to understand the mechanisms of interaction and conformational dynamics involved in the recognition of cNLSs by Impα. In particular, this work focused on the cNLSs of Nucleoplasmin and Ku70 proteins complexed with Impα. The study of Nucleoplasmin determined two main motions of Impα that may be associated to the cNLS recognition: bending and twisting... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando, sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical, particularmente áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 95% dos acidentes ofídicos, enquanto o segundo gênero apresenta alta taxa de morbidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops contem fosfolipases A2 ácidas que causam uma considerada mionecrose e severas reações anticoagulantes. De outro lado, os venenos das serpentes do gênero Crotalus possuem o complexo crotoxina, o qual é formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (PLA2 catalítica) que possui potente ação neurotóxica. As serpentes peçonhentas, grupo que inclui ambas as famílias citadas, utilizam esse veneno tanto para a captura de sua presa como para sua própria defesa. Inevitavelmente, essas serpentes terão contato com o seu próprio veneno, como por exemplo, na alimentação, pois as presas estarão envenenadas. Por tal fato, as serpentes peçonhentas apresentam alguns mecanismos de defesa, inclusive algumas proteínas encontradas em seu sangue que são chamadas de proteínas inibitórias de PLA2 (PLIs). Para entender melhor o mecanismo de inibição desses compostos plasmáticos, foi desenvolvido neste trabalho um novo protocolo de docking molecular que consiste em analisar as estruturas ao longo dos modos normais, docking molecular, simulação de dinâmica molecula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, snake envenomation is a public health issue that mostly affects tropical and subtropical regions, particularly rural areas of countries from Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, the Bothrops and Crotalus snake genre are responsible for approximately 95% of all snake bites, and the accidents caused by the latter have a relatively high mortality rate. The venom of Bothrops snakes contains a acid phospholipases A2 that causes drastic local myonecrosis and several anticoagulant reactions. On the other hand, the Crotalus genus snake venom contains the the crotoxin complex, which is formed by crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic PLA2), that have up a strong neurotoxic action. Venomous snakes, including the two afore mentioned genre, use their venoms for capturing their prey and for their own defense. These snakes will inevitably get in contact with their own venom, for example, in alimentation, for the prey itself will be poisoned. For this fact, the poison snakes features in your blood the so-called PLA2 inhibiting proteins (PLIs). In order to understand the inhibition mechanism of these plasmatic components, it has developed in this study a new molecular docking protocol that consists in analyzing the structures using normal modes, molecular docking, molecular dynamics simulation and other bioinformatics tools. The results of this work was the proposition of a new flexible molecular docking protocol between two or more proteins and your... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

[pt] A aparição do HIV na década de 80 e de outros vírus presentes no sangue dos doadores, assim como a expansão de doenças como a hepatite C, tem estimulado as pesquisas para desenvolver substitutos do sangue. Pesquisas recentes têm sido realizadas em derivados artificiais da albumina de soro humano (human serum albumin - HSA) associados com heme, representando uma linha promissora nesse sentido. No presente trabalho, fazemos um estudo computacional da ligação do heme e de seu precursor, a protoporfirina IX, com a HSA, com o objetivo de conhecer os aminoácidos que contribuem à estabilidade da ligação, a natureza do sítio de ligação, a formação de possíveis sítios secundários de ligação e a influência das porfirinas na estrutura global da proteína. Para conseguir este objetivo ut ilizamos técnicas de cálculo quântico usando a Teoria do Funcional de Densidade, Docking Molecular e Dinâmica Molecular. Finalmente fazemos um estudo da correlação existente entre as diferentes regiões da HSA e de como este padrão muda na presença das porfirinas. Para este propósito usamos os coeficientes de correlação generalizada baseados na formulação de Kraskov. Com base nestas informações, discutimos a contribuição que poderiam fornecer nossos cálculos para a reengenharia do HSA, no sentido de fornecer- lhe características de hemoproteínas. / [en] The uprising of HIV and other viruses in the beginning of the 80s, as well as the expansion of other diseases like hepatitis C has stimulated research in order to develop blood substitutes. Research based on modified Human Serum Albumin associated with heme has shown a promissory line in this direction. In the present work we make a computational study about the heme and its precursor, the Protoporphyrin IX complexed with HSA, in order to know the contribution of the main amino acids to the stability of the binding, the character of the binding site, secondary binding sites formation, and the influence of the porphyrins in the global protein structure. To find this objective we use quantum calculations based on Functional Density Theory, Molecular Docking and Molecular Dynamics. Finally, a correlation study between different regions of HSA and the pattern modifications caused by the porphyrins were performed, using the generalized correlation coefficients based on the Kraskov formulation. We also discuss the contribution that our calculations could give to the reengineering of HSA, to provide them with hemeprotein characteristics.

[pt] A simulação da adsorção da prednisolona em um modelo de surfactante pulmonar foi realizada com sucesso usando dinâmica molecular coarse grained a uma temperatura de 310 K. O modelo coarse grained da prednisolona foi parametrizado usando o modelo do colesterol e validado utilizando cálculos de coeficientes de partição octanol-água e coeficientes de difusão lateral. O coeficiente de partição octanol-água calculado para prednisolona a 298 K é 3,9 mais ou menos 1,6 que possui um acordo razoável com o valor experimental. O coeficiente de difusão lateral da prednisolona na monocamada mista de DPPC/POPC é estimado ser (6 mais ou menos 4) x10(-7) cm(2) s(-1) a 20 mN m(-1), o que está de acordo com o encontrado para o colesterol. A monocamada mista de DPPC/POPC foi utilizada como modelo de surfactante pulmonar onde moléculas de prednisolona foram adsorvidas formando nanoagregados. Os nanoagregados de prednisolona foram transferidos dentro da monocamada mista DPPC/POPC sendo espalhados na tensão superficial de 20 mN m(-1). A 0 e 10 mN m(-1) os nanoagregados de prednisolona induzem o colapso da monocamada mista DPPC/POPC formando bicamadas. A implicação deste trabalho é que a prednisolona pode apenas ser administrada com surfactante pulmonar utilizando baixas frações em massa de prednisolona por lipídio (menor que 10 por cento). Com frações elevadas, o colapso inativa as propriedades do surfactante pulmonar pela formação de uma bicamada. Os resultados desta pesquisa podem ser utilizados para o desenvolvimento de novos tratamentos clínicos de doenças como a síndrome da angústia respiratória do recém-nascido, asma e doença pulmonar obstrutiva crônica. / [en] The simulation of prednisolone adsorption on a lung surfactant model was successfully performed using coarse grained molecular dynamics at 310 K (dynamics first performed). The coarse grained model for prednisolone was parameterized using a well-established cholesterol model and validated by using calculations of octanol–water partition coefficients and lateral diffusion coefficients. The calculated octanol–water partition coefficient of prednisolone at 298 K is 3.9 more or less 1.6, which is in reasonable agreement with experiment. The lateral diffusion coefficient of prednisolone in the DPPC/POPC mixed monolayer is estimated to be (6 more or less 4) x10(-7) cm(2) s(-1) at 20 mN m(-1), which is in agreement with that found for cholesterol. The DPPC/POPC mixed monolayer was used as lung surfactant model where prednisolone molecules were adsorbed forming nanoaggregates. The nanoaggregates of prednisolone were transferred into the DPPC/POPC mixed monolayer being spread at the surface tension of 20 mN m(-1). At 0 and 10 mN m(-1) , the prednisolone nanoaggregates induce the collapse of the DPPC/POPC mixed monolayer forming a bilayer. The implications of this work are that prednisolone may only be administered with lung surfactant by using low mass fractions of prednisolone per lipid (less than 10 percent). And, with high fractions, the collapse inactivates the properties of the lung surfactant by forming a bilayer. The results of this research can be used to develop new clinical treatments for diseases such as respiratory distress syndrome of the newborn, asthma and chronic obstructive pulmonary disease.

[pt] As doenças trasmitidas pelo sangue, assim como a necessidade de bancos de sangue para um pronto auxílio em casos de acidentes tem estimulado esforços para desenvolver substitutos do sangue. A albumina serica humana (HSA do ingles Human Serum Albumin) é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo. A molécula heme é a transportadora de oxigênio no sangue. Portanto, um estudo detalhado da interação HSA/heme seria útil em pesquisas que visam tornar o complexo HSA-heme em um substituto do sangue. Nesta tese, foram usadas técnicas de dinâmica molecular e ferramentas estatísticas para estudar o sistema HSA-heme em solvente explícito. Tanto o ligante quanto a proteína foram também estudados separadamente em meio aquoso. Dentre outros resultados, nosso estudo revelou a organização da água circundante, os efeitos da ligação do heme na HSA, os mecanismos moleculares da ligação do heme, os movimentos coletivos da proteína livre e ligada, assim como também os aminoácidos que atuam como dobradiças moleculares na mudança conformacional que sofre a proteína ao ligar o heme. / [en] Diseases transmitted through the blood, as well as the need for blood banks to help in case of accidents, stimulated efforts to develop blood substitutes. The human serum albumin (HSA) is the most abundant protein in blood plasma. The heme molecule is the carrier of oxygen in the blood. Therefore, a detailed study of the interaction HSA/heme could give useful insights in the research aimed to convert the HSA-heme complex into a blood substitute. In this thesis, molecular dynamics techniques and statistical tools were applied to study the HSA-heme system in explicit solvent. Both ligand and protein were also studied separately in aqueous medium. Among other results, our study reveals the organization of the surrounding water, the effects of the heme upon its binding to HSA, the molecular mechanisms for heme binding, the collective motions of the protein with and without the heme, as well as the amino acids that act as molecular hinges in the conformational change between the free and bound forms of the protein.