Este trabalho teve como principais objetivos avaliar os efeitos dos agentes bióticos (Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Lentinula edodes e Agaricus blazei), e abióticos (UV-C, irradiação gama, acibenzolar-S-metil, quitosana, ácidos acético e salicílico) na proteção de mamões contra C. gloeosporioides, bem como estudar os mecanismos bioquímicos de resistência ativados no tecido vegetal, em resposta ao tratamento com os agentes de maior eficiência, além de investigar os efeitos destes sobre o desenvolvimento in vitro do fungo. Para tanto, mamões cv. Golden foram inoculados com C. gloeosporioides através de injeção subcuticular de 15 µL da suspensão de esporos e, após 10 h, tratados com os diferentes agentes bióticos e abióticos. Para avaliar a possibilidade de indução de resistência pelos agentes, mamões foram também inoculados após 24, 48 e 72 h dos tratamentos. Os frutos foram armazenados a 25 ºC / 80 %UR por 7 dias e, avaliados diariamente quanto a incidência e severidade da podridão. Ao final do período de armazenamento, efetuou-se a avaliação dos parâmetros físico-químicos (cor de casca e de polpa, firmeza, sólidos solúveis, pH e acidez total). Quando de interesse, as atividades de peroxidase, β-1,3-glucanase e quitinase foram também investigadas. In vitro, avaliou-se o crescimento micelial, a germinação de conídios e a esporulação do fungo em resposta aos diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que a irradiação gama (0,75 e 1 kGy) reduziu a incidência e a severidade da antracnose. Não houve efeito da UV-C no controle da podridão e todas as doses testadas causaram danos na casca dos frutos. O acibenzolar-S-metil reduziu em mais de 50 % a incidência e a severidade da podridão, além de induzir a maior atividade das enzimas peroxidase, quitinase e β-1,3-glucanase, e não alterar as características físico-químicas dos frutos. O ácido acético, a 2,5 µL L-1, reduziu a severidade e a incidência das lesões nos frutos. A quitosana (1, 2 e 4 %) reduziu significativamente a severidade da antracnose, e a 4 % foi também eficiente em reduzir a incidência da podridão. Concentrações acima de 0,25 % suprimiram a esporulação de C. gloeosporioides nas lesões. No entanto, os frutos tratados com 2 e 4 % de quitosana não amadureceram normalmente, permanecendo com a coloração da casca verde até o final do período de armazenamento. S. cerevisiae (20 mg mL-1) e B. thuringiensis (7,5 mg mL-1), aplicadas 24 h antes da inoculação do patógeno, reduziram a incidência da antracnose nos frutos, mas não o acúmulo de proteínas relacionadas à patogênese. Os cogumelos (A. blazei e L. edodes) e o ácido salicílico não foram eficientes em reduzir a incidência e a severidade da antracnose. In vitro, a irradiação gama, a UV-C, os ácidos acético e salicílico, a quitosana, S. cerevisiae e L. edodes inibiram o crescimento micelial do fungo. A germinação de conídios foi reduzida pelas irradiações gama e UV-C, pelos ácidos acético e salicílico e pela quitosana. Esses resultados demonstram a possibilidade dos agentes estudados serem utilizados no manejo da antracnose, bem como na redução da utilização ou da dosagem de fungicidas empregados no controle da doença. / This work had as main objectives evaluate the effect of biotic and abiotic agents (Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Lentinula edodes and Agaricus blazei), and abiotic (UV-C, gamma irradiation, acibenzolar-S-methyl, chitosan, acetic and salicylic acids) on the protection of papaya fruits against C. gloeosporioides, and study the biochemical mechanisms of resistance activated in the tissues in response to the treatment with the agents exhibiting better efficiency. The effects of the agents on the in vitro development of the fungus were also investigated. For this, papaya fruits cv. Golden were inoculated with C. gloeosporioides through subcuticular injection of 15 µL of the spore suspension and after 10 h treated with the different biotic and abiotic agents. To evaluate the possibility of resistance induction by the different agents, fruits were also inoculated 24, 48 and 72 h after treatments. The fruits were stored at 25 ºC / 80 %RH for 7 days and evaluated daily for the incidence and severity of the anthracnose. At the end of the storage period, the evaluation of the physical-chemical parameters (skin and flesh color, firmness, total soluble solids, pH and tritatable acidity) was carried out. The peroxidase, β- 1,3-glucanase and chitinase activities were also investigated when need. In vitro, mycelial growth, conidium germination and sporulation of the fungus in response to the different treatments were also evaluated. The results showed that the gamma irradiation (0.75 and 1 kGy) reduced the anthracnose incidence and severity. The UV-C did not have effect on the control of the rot and all the doses caused damages in the skin of the fruits. The acibenzolar-S-methyl reduced in more than 50 % anthracnose incidence and severity, and induced the highest activity of peroxidase, chitinase and β-1,3-glucanase, and did not modify the physical-chemical characteristics of the fruits. The acetic acid at 2.5 µL L-1 reduced rot severity and incidence. The chitosan (1, 2 and 4 %) significantly reduced the rot severity, and at 4 % was also efficient in reducing anthracnose incidence. Chitosan concentrations above 0.25 % suppressed the sporulation of C. gloeosporioides in the lesions. However, the fruits treated with chitosan at 2 and 4 % did not ripen normally, remaining with green skin until the end of the storage period. S. cerevisiae (20 mg mL-1) and B. thuringiensis (7.5 mg mL-1), applied 24 h before the pathogen inoculation, reduced anthracnose incidence, but did not change the activities of pathogenesis related proteins. The mushrooms (A. blazei and L. edodes) and the salicylic acid were not efficient in reducing the incidence and the severity of anthracnose. In vitro, gamma irradiation, UV-C, acetic and salicylic acids, chitosan, S. cerevisiae and L. edodes inhibited the mycelial growth. The conidium germination was reduced by gamma and UV-C irradiation, acetic and salicylic acids and chitosan. These results show that these agents can be utilized for anthracnose management, and on the reduction in the use or dosage of fungicides utilized on the anthracnose control.

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

Este trabalho objetivou investigar a existência de polimorfismos de seqüência nucleotídica (SNPs "single nucleotide polymorphisms") em fragmentos genômicos de cana-de-açúcar homólogos a genes de resistência. Para tal, iniciadores sintéticos homólogos às extremidades de uma seqüência expressa identificada (ESTs "expressed sequence tag") como homóloga ao gene Xa1 de arroz (EST SCCCCL3080E03.g) e outra ao gene Rp1-D de milho (EST SCCCCL3080B03.g) foram utilizados para amplificar, em duplicata, fragmentos genômicos de variedades de cana-de-açúcar. Em seguida, os fragmentos foram clonados e seqüenciados. No caso do primeiro EST, foram obtidas seqüências de 119 insertos de uma variedade resistente (SP804966) e 156 de uma variedade suscetível (SP80180) a Xanthomonas albilineans. No segundo caso, foram obtidas seqüências de 167 insertos de uma terceira variedade resistente (R570) e 135 de outra suscetível (SP811763) a Puccinia melanocephala. Para cada EST considerado, as seqüências foram comparadas por meio do programa DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Nesta análise, somente foram consideradas seqüências reproduzíveis, isto é, que ocorreram nas duas repetições. No caso de ambos ESTs, a comparação de seqüências entre variedades possibilitou a identificação de quatro a seis fragmentos distintos. A comparação entre variedades, por sua vez, revelou a existência de até duas seqüências comuns. Presume-se que estas seqüências reproduzíveis e confirmadas por meio de digestões de clones representativos de cada uma com enzimas de restrição, correspondam a seqüências alélicas. Iniciadores foram sintetizados com base em polimorfismos encontrados entre os diferentes alelos. No entanto, tentativas de amplificar alelos específicos por meio destes iniciadores se revelaram infrutíferas. Tal insucesso deve-se possivelmente à condição polialélica da cana-de-açúcar, que faz com que polimorfismos entre dois alelos sejam compensados por monomorfismos entre estes e os demais alelos. Assim, a utilização de SNPs como marcadores moleculares baseados em PCR em cana-de- açúcar mostra-se mais complexa quando comparada a plantas diplóides. / The objective of this work was to investigate the existence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genomic fragments homologous to resistance genes in sugarcane. For this purpose, primers were designed based on the sequence of the extremities of an identified expressed sequence tag (ESTs) similar to the Xa1 gene of rice (EST SCCCCL3080E03.g) and another to the maize Rp1-D gene (EST SCCCCL3080B03.g). These primers were used to amplify genomic fragments of sugarcane varieties in duplicate. The fragments were then cloned and sequenced. In the case of first EST, sequences of 119 inserts from a resistant variety (SP804966) and 156 from a susceptible variety (SP80180) to Xanthomonas albilineans were analyzed. In the case of the second EST, sequences of 167 inserts from a third variety (R570) and 135 of a fourth one (SP811763), resistant and susceptible respectively to Puccinia melanocephala, were analyzed. Sequences were compared using the program DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). In this analysis, only reproducible sequences were considered, that is, sequences that occurred in both replicates. Four to six different sequences were identified within varieties whereas comparisons among varieties revealed the existence of up to two sequences in common. These reproducible sequences, which were further confirmed through digestion of representative clones with appropriate restriction enzymes, could correspond to allelic sequences. Primers were designed based on the SNPs detected among these so-called alleles. However, attempts to amplify specific alleles using these primers were unsuccessful. This could be due to the polyallelic condition of sugarcane in which polymorphisms between two alleles could be compensated by monomorphisms between these and other alleles. Thus the use of SNPs as PCR-based molecular markers is not as straightforward in sugarcane as in diploid species.

A mancha preta dos citros (MPC) é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para o Japão e países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. O fungo Guignardia citricarpa, descoberto por Kiely em 1948 em New South Wales na Austrália, é o estádio sexual do agente causal da MPC e a sua fase imperfeita é Phyllosticta citricarpa. Uma importante característica da MPC é seu longo período de latência. A infecção pode ser efetuada por ascósporos e picnidiósporos. A lesão nos frutos fica restrita ao flavedo (epicarpo), sendo que o fungo não infecta o albedo (mesocarpo). O albedo é rico em celulose, carboidratos solúveis, pectinas, compostos fenólicos (flavonóides), aminoácidos e vitaminas. Os compostos fenólicos presentes nas plantas são produtos do metabolismo secundário, e podem ser resultantes da interação planta-ambiente e podem sintetizados como resposta ao ataque de fitopatógenos. Os fenólicos presentes nos citros incluem flavonóides, antocianinas, coumarinas e psorolenos entre outros. Estes compostos podem exibir ação antimicrobiana e antiviral e podem contribuir controle da MPC. A aplicação de fungicidas é o método de controle da MPC. Uma outra possibilidade de controle seria a ativação de fatores de resistência através do uso de indutores bióticos (Saccharomyces cerevisiae) e abióticos (Bion e ácido salicílico). Deste modo, este trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do uso de extratos aquosos, metanólicos e etanólicos de albedo de laranja na germinação formação de apressório e crescimento micelial de P. citricarpa in vitro, bem como avaliar o uso da indução de resistência para o controle da MPC através dos indutores S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico em pós e pré-colheita em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’ e folhas de limão ‘Siciliano’. Os resultados experimentais mostraram que os extratos de albedo, nas concentrações de 10 e 100 mg / mL de água, foram capazes de inibir em 100% a germinação, formação de apressório e o crescimento micelial de P. citricarpa. Foi observado que os extratos, dependendo da concentração, podem ter ação fungicida ou fungistática. No tocante a utilização de S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico, aplicados em pós-colheita, foi observado que estes agentes não foram capazes de impedir o desenvolvimento de novas lesões em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’. Também foi constatado que S. cerevisiae e Bion, aplicados em pré-colheita, não foram capazes de induzir resistência contra P. citricarpa em folhas de limão ‘Siciliano’ inoculadas previamente a campo com G. citricarpa. Nesse sentido, sugere-se que outros estudos sejam conduzidos, principalmente no que se refere ao uso potencial de extratos do albedo de laranja como medida alternativa de controle da MPC. / Black spot of citrus (CBS) has been a limiting factor in the export of brazilian oranges to Japan and European countries and Japan. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all commercially growing Citrus spp. are susceptible to the pathogen. The fungus Guignardia citricarpa, discovered by Kiely in 1948 in New South Wales, is the sexual stage of the causal agent of CBS and Phyllosticta citricarpa is the imperfect stage. An important characteristic of CBS is the long latent period after infection. The infection is carried out by ascospores and pycnidiospores. The fungicidal application is the most important method of control of CBS. The CBS lesion in citrus fruits is limited to the flavedo, since P. citricarpa does not infect the albedo. The albedo is rich in cellulose, soluble carbohydrates, pectin, phenolic compounds, amino acids and vitamins. The phenolics present in the plants are secondary metabolic products and are believed to be produced as a result of the plant interaction with the enviromment and synthesized as a response to attempted phytopathogen attacks. The phenolics that occur in Citrus include flavonoids, anthocyanins, coumarins and psorolens. These compounds may exhibit antiviral and antimicrobial activities, and may contribute to the control of CBS disease. An another possibility to the CBS control is the activation of factors resistance by the use of abiotics (Bion and salicylic acid) and biotics (Saccharomyces cerevisiae) “plant defence activator” (inducers). Therefore, the objectives of this paper were to study the in vitro effects of aqueous, ethanolic and methanolic albedo orange extracts on the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa as well as to evaluate the use of the S. cerevisiae, Bion and salicylic acid as “plant defence activator” at post and preharvest conditions in fruit of “Pêra-Rio” and leaves of ’Siciliano’ lemon. The results showed that the use of albedo extracts, 10 and 100 mg per mL of water, inhibited 100 % the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa. It was also observed that the extracts of albedo, depending upon the concentration, exhibited fungicidal or fungistatic activity. The use of S. cerevisiae, Bion and salicylic acid at postharvest conditions did not affect the development of new lesions of CBS in ‘Pêra-Rio’ orange fruit. It was also observed that the use of S. cerevisiae and Bion at preharvest conditions, did not induce resistance against P. citricarpa in leaves of ‘Siciliano’ lemon naturally infected with G. citricarpa under field conditions. Thus, it is suggested that other studies be carried out, mainly regarding the potential of orange albedo’s extracts as a alternative method for CBS control.

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens, adequada para causar 100% de mortalidade de gemas susceptíveis à doença. Simultaneamente, testes de radiossensitividade foram desenvolvidos através da irradiação gama em gemas in vitro e a dose de 20Gy foi escolhida para indução de mutações. As gemas irradiadas que passaram por vários ciclos de multiplicação e sobreviveram ao agente seletivo, filtrado de cultura do fungo, estão sendo clonadas para serem submetidas à seleção artificial com esporos do fungo em casa-de-vegetação, seleção natural em campo de ocorrência da doença e avaliação agronômica. Testes indicaram, a concentração de 2x10 6 esporos/ml em suspensão e a aplicação no solo do fungo adequada para seleção em casa-de-vegetação. As plantas V5 e V6 avaliadas em campo quanto a mortalidade e caracteres de produção apresentaram performance semelhante às plantas da cultivar original quanto à média de comprimento de espiga (8,4 cm), peso (4,42g) e número de frutos (40 frutos) por espiga, peso de 100 frutos (10,67g) e rendimento de pimenta preta (> 30%). Entretanto, melhores resultados para a média de produção de pimenta verde (3.290g) e sobrevivência em área de ocorrência da fusariose. As análises por componentes principais e variáveis canônicas apresentaram divergência genética entre as plantas originadas por estacas que sofreram irradiação gama e aquelas da cultivar original. / The purposes of the present work were to develop in vitro technology, associating it with mutagenesis, and to evaluate the V5 and V6 plants based on agronomical characters of production in Fusarium incidence areas, aiming at the genetic improvement of black pepper to obtain tolerant and/or resistant plants to the disease. The use of in vitro techniques started with the production of explant donor plants from greenhouse-grown cuttings and from seeds and in vitro zygotic embryos. The micropropagation process was developed using young shoots of in vitro plants by establishment of proper growing conditions in culture media for multiplication, rooting and production of plantlets, and by determining a suitable substrate type for acclimatization and growing of plantlets. After the process was defined, young shoots obtained from greenhouse grown plants underwent different aseptic treatments and the surviving plantlets were micropropagated. In vitro selection was carried out by cultivating pathogenic isolates of Fusarium solani f. sp. piperis in Czapek-Dox medium and, by using a growing curve, the most suitable growing period (28 days) for obtaining the fungus culture filtrate was defined. Different filtrate concentrations and sterilization techniques were tested in culture medium for young shoot multiplication. A concentration of 55% (v/v) of fungus filtrate under sterilization by double autoclavation was considered adequate to cause 100% mortality of fusariosis susceptible young shoots. Simultaneously, radiosensitivity tests were carried out through gamma irradiation of in vitro young shoots and dose of 20Gy was selected for mutation induction. Irradiated young shoots which underwent several multiplication cycles and survived the selective agent, fungus culture filtrate, are being cloned in order to be submitted to artificial selection with the fungus spores in greenhouse, to natural selection in a disease incidence area and to agronomical evaluation. These tests indicated that the concentration of 2x10 6 spores/ml in suspension and the application of the fungus on soil were appropriate for greenhouse selection. The V5 and V6 plants evaluated in field conditions for mortality and production characters showed similar performance to the original cultivar plants regarding average height (8.4 cm), weight (4.42g) and number of fruits (40 fruits) per spike, weight of 100 fruits (10.67g) and black pepper yield (>30%). However, better results were observed for average green pepper production (3,290g) and survival rates in a fusariosis incidence area. Analyses of principal components and canonic variables evidenced genetic divergence between plants grown from gamma-irradiated cuttings and the original cultivar ones.

O custo ferrugem que engloba gastos com fungicidas, os custos operacionais das aplicações, perdas de produção, e redução na arrecadação de impostos representa um elevado valor para sojicultura mundial. Assim, a ferrugem asiática da soja apresenta-se como um dos grandes desafios para a pesquisa agrícola nos próximos anos, pois o controle químico da doença é alternativa obrigatória enquanto não se dispõe de cultivares resistentes. Porém a prática representa aumento considerável no custo de produção. No Brasil estima-se que este custo, para duas aplicações gire, em torno de US$ 40,00.ha-1, sem contar os gastos operacionais com máquinas e combustível, ou seja, gasto apenas o fungicida. Considerando o exposto, este trabalho tem como objetivo avaliar duas fontes de resistência à ferrugem asiática da soja (PI 200487 e PI 459025A), e verificar se os genes responsáveis pela reação ao patógeno já foram descritos na literatura, ou seja, identificar seus respectivos grupos de ligação. A estratégia de segregantes agrupados (Bulked segregant analysis) foi utilizada para mapear os genes de interesse. Os resultados obtidos permitiram chegar as seguintes conclusões: a) a técnica BSA foi eficiente para detectar locos relacionados com a resistência à ferrugem asiática da soja; b) a PI 459025 (Bing Nam) apresenta o gene de resistência Rpp4 localizado no grupo de ligação G e c) A PI 200487 (Kinoshita) apresenta um gene diferente daqueles descritos na literatura, sendo este localizado no grupo de ligação N. Este gene pode ser denominado de Rpp5. / The costs due to Asian soybean rust, which consists of fungicides, operational application costs and reduction in paid taxes, represent severe losses for worldwide soybean production. Thus, Asian soybean rust represents one of the most challenging problems for agricultural research in the future, since chemical control of the disease is the obligated alternative while resistant cultivars are unavailable. However, fungicide application significantly increases production costs. In Brazil, it is estimated that the costs of two applications are of approximately US$ 40,00.ha-1, aside the operational costs incurred due to machinery and fuel, that is, the figure represents solely fungicide costs. Taking into account the previous considerations, the present work aims to evaluate two sources of resistance to Asian soybean rust (PI 200487 and PI 459025A), and to verify if the genes involved in pathogen-responses have already been described in previous work, by identifying their respective linkage groups. Bulked segregant analysis was used to map the genes of interest. The results allowed the following conclusions: a) BSA was effective to detect loci associated to Asian soybean rust resistance; b) PI 459025A (Bing Nam) carries the resistance gene Rpp4 mapped to the linkage group G and c) PI 200487 (Kinoshita) has a novel resistance gene mapped to the linkage group N. The identified gene is denominated Rpp5.

No description available.

No description available.

Thesis (MScAgric (Viticulture and Oenology. Wine Biotechnology))--University of Stellenbosch, 2010. / ENGLISH ABSTRACT: Necrotrophic fungi infect many economically important crop plants. This results in great losses in the agricultural sector world-wide. Understanding the nature by which plants respond to pathogens is imperative for genetically enhancing disease resistance in plants. Research tools have significantly contributed to our understanding of how the plant responds to pathogen attack, identifying an array of defence mechanisms used by plants upon attack. Many fungal pathogens secrete endopolygalacturonases (endoPGs) when infecting plants. These hydrolytic enzymes are inhibited by polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) associated with plant cell walls. PGIPs are well characterised and their current known functions are all linked to endoPG inhibition and the subsequent upregulation of plant defence pathways. Work on grapevine PGIPs have shown that apart from being efficient antifungal proteins, leading to protection of the plant against Botrytis cinerea when overexpressed, PGIPs might also have additional functions linked to cell wall strengthening. This working hypothesis formed the motivation of this study where a cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) (1.1.1.195) gene was targeted for functional analysis in tobacco (Nicotiana tabacum). Some previous work and genetic resources obtained is relevant to this study, specifically previously characterized transgenic tobacco lines overexpressing the Vitis vinifera pgip1 (Vvpgip1) gene. These lines have confirmed PGIP-specific resistance phenotypes against B. cinerea, as well as increased levels of CAD transcripts in healthy plants. Moreover, preliminary evaluations indicated increased lignin levels as well as differential expression of several other cell wall genes in these overexpressing lines (in the absence of infections). In this study we generated a transgenic tobacco population, overexpressing the native CAD14 gene, via Agrobacterium transformations. The transgene was overexpressed with the Cauliflower Mosaic Virus promoter (CaMV 35Sp). The CAD transgenic population was analyzed for transgene integration and expression and showed active transcription, even from leaves that normally don’t express CAD to high levels. These lines, together with the untransformed control, and a representative transgenic VvPGIP1 tobacco line previously characterized with elevated expression of CAD were used for all further analyses, specifically CAD activity assays of stems and leaves, as well as whole plant infections with B. cinerea. CAD enzyme activity assays were performed on healthy uninfected plant lines, without inducing native CAD expression or resistance phenotypes (i.e. without Botrytis infection). CAD activity was detected in leaves and stems, but a statistically sound separation between the CAD population and the untransformed control was only observed in the stems. The CAD assays also confirmed previous results that indicated that CAD transcription was upregulated in the PGIP line in the absence of infection. Overall, in all plant lines the stems exhibited 10-fold higher levels of CAD activity than the leaves, but the transgenic VvPGIP1 line showed a further 2-3-fold increase in CAD activity in the stems, when compared to the untransformed control and the majority of the CAD overexpressing lines. Disease assessment by whole plant infections with B. cinerea of the CAD transgenic plants revealed reduced disease susceptibility towards this pathogen. A reduction in disease susceptibility of 20 – 40% (based on lesion sizes) was observed for a homologous group of transgenic lines that was statistically clearly separated from the untransformed control plants following infection with Botrytis over an 11-day-period. The VvPGIP1 transgenic line displayed the strongest resistance phenotype, with reduction in susceptibility of 47%. The reduction in plant tissue maceration and lesion expansion was most pronounced in the VvPGIP1 line compared to the CAD transgenic plants, while the CAD transgenic plants showed more reduction than the untransformed control. In combination, the data confirms that CAD upregulation could lead to resistance phenotypes. Relating this data back to the previously observed upregulation of CAD in the VvPGIP1-overexpressing lines, the findings from this study corroborates that increased CAD activity contributes to the observed resistance phenotypes, possibility by strengthening the cell wall. In conclusion, this study yielded a characterized transgenic population overexpressing the CAD14 gene; this overexpression contributed to increased RNA transcription compared to the untransformed control plant, increased CAD activity (most notably in the stems) and a disease resistance phenotype against Botrytis. These findings corroborates the current working hypothesis in our group that PGIPs might have a role in preparing the plant cell for attack by contributing to specific cell wall changes. The exact mechanisms are still currently unknown and under investigation. The transgenic lines generated in this study will be invaluable in the subsequent analyses where these various phenotypes will be subjected to profiling and accurate cell wall analyses. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Nekrotrofiese swamme infekteer en beskadig verskeie ekonomies belangrike gewasse. Dit lei wêreldwyd tot groot verliese vir die landbousektor. Dit is noodsaaklik om te verstaan hoe plante reageer teenoor patogene, sodat die siekteweerstand van plante verbeter kan word. Navorsingshulpbronne het beduidend bygedra tot die kennis van plantreaksies tydens patogeniese aanvalle, en het sodoende ‘n reeks van weerstandmeganismes, wat die plant inspan tydens ‘n aanval, geïdentifiseer. Verskeie patogeniese swamme skei endopoligalakturonases (endoPGs) af tydens plantinfeksie. Hierdie hidrolitiese ensieme word geïnhibeer deur poligalakturonase-inhiberende proteïene (PGIPs) wat met die plantselwand geassosieerd is. PGIPs is goed gekarakteriseerd en al hulle huidiglik bekende funksies is gekoppel aan endoPG inhibisie en die daaropvolgende opregulering van plant weerstandspaaie. Navorsing op wingerd PGIPs het gewys dat, afgesien van die feit dat PGIPs goeie antifungiese proteïene is wat lei tot beskerming van die plant teen Botrytis cinerea wanneer dit ooruitgedruk word, PGIPs ook moontlik addisionele funksies verrig wat verwant is aan selwandversterking. Hierdie werkshipotese vorm die motivering vir hierdie studie waarin ‘n sinnamiel alkohol dehidrogenase (SAD) (1.1.1.195) geen geteiken is vir funksionele analise in tabak (Nicotiana tabacum). Vorige navorsing en genetiese hulpbronne daardeur verkry is belangrik vir hierdie studie, spesifiek die gekarakteriseerde transgeniese tabaklyne wat die Vitis vinifera pgip1 (Vvpgip1) geen ooruitdruk. Hierdie lyne besit bevestigde PGIP-spesifieke weerstandsfenotipes teen B. cinerea, sowel as hoër vlakke van SAD transkripte in gesonde plante. Voorlopige analises het ook aangedui dat hierdie ooruitdrukkende lyne hoër lignien vlakke het, asook differensiële uitdrukking van verskeie ander selwandgene (in die afwesigheid van infeksie). In hierdie studie is ‘n transgeniese tabakpopulasie gegenereer wat die natuurlike tabak SAD14 geen ooruitdruk, deur middel van Agrobacterium transformasie. Die transgeen is ooruitgedruk deur die Blomkool Mosaïek Virus promoter (CaMV 35Sp). Die SAD transgeniese populasie is geanaliseer vir transgeen integrasie en uitdrukking en het aktiewe transkriptering getoon, selfs in blare waar daar normaalweg nie hoë vlakke van SAD uitgedruk word nie. Hierdie lyne, die ongetransformeerde wilde-tipe kontrole sowel as ’n verteenwoordigende transgeniese VvPGIP1 tabaklyn wat vooraf gekarakteriseerd was met hoë SAD uitdrukking, is gebruik vir alle verdere analises, spesifiek SAD aktiwiteitstoetse in stingels en blare, asook heelplantinfeksies met B. cinerea. Aktiwiteitsanalises van die SAD ensiem is gedoen op gesonde ongeinfekteerde plantlyne, sonder om natuurlike tabak SAD uitdrukking of weerstandsfenotipes te induseer (dus sonder Botrytis infeksie). SAD aktiwiteit is waargeneem in beide die blare en stingels, maar ‘n statisties betekenisvolle skeiding is slegs gevind tussen die SAD populasie en die ongetransformeerde kontrole in die stingels. Die SAD toetse het ook vorige resultate bevestig wat aangedui het dat SAD transkripsie opgereguleer word in die PGIP lyn in die afwesigheid van infeksie. Die stingels het oor die algemeen ‘n 10-voudige vermeerdering in SAD aktiwiteitsvlakke getoon in vergelyking met die blare, maar die transgeniese VvPGIP1 lyn het ‘n verdere 2-3-voudige verhoging in SAD aktiwiteit gehad in die stingels ,in vergelyking met die ongetransformeerde kontrole en die meerderheid van die SADooruitdrukkende lyne. Siekteweerstand ondersoeke deur middel van heelplantinfeksies met B. cinerea van die SAD transgeniese plante, het verminderde vatbaarheid aangedui ten opsigte van hierdie patogeen. ‘n Afname in siekte-vatbaarheid van 20 – 40% (gebaseer op wondgroottes) is waargeneem vir ‘n homoloë groep transgeniese lyne wat statisties betekenisvol geskei kon word van die ongetransformeerde kontrole plante na infeksie met Botrytis in ‘n infeksietoets wat 11 dae geduur het. Die VvPGIP1 transgeniese lyn het die mees weerstandbiedende fenotipe gehad, met ‘n afname in siekte-vatbaarheid van 47%. Die afname in plantweefselafbreking en wondgrootte was die duidelikste in die VvPGIP1 lyn in vergelyking met die SAD transgeniese plante, terwyl die SAD transgeniese plante ‘n groter afname aangedui het as die ongetransformeerde kontrole. In kombinasie het die data bevestig dat SAD opregulasie kan lei tot weerstandbiedende fenotipes. Hierdie data, in vergelyking met die vorige bevinding van opregulasie van SAD in die VvPGIP1-ooruitdrukkende lyne, bevestig dat hoër SAD aktiwiteit bydra tot die waargenome weerstandbiedende fenotipes, moontlik deur versterking van die plantselwand. Ter afsluiting, hierdie studie het ‘n gekarakteriseerde transgeniese populasie wat die SAD14 geen ooruitdruk gelewer; hierdie ooruitdrukking het bygedra tot hoër RNA transkripsie in vergelyking met die kontrole, verhoogde SAD aktiwiteit (veral in die stingels) en siekteweerstandbiedende fenotipes teenoor Botrytis. Hierdie bevindinge ondersteun die huidige werkshipotese in ons groep dat PGIPs moontlik ‘n rol speel in die voorbereiding van die plantsel teen infeksie deur spesifieke selwandveranderinge te veroorsaak. Die spesifieke meganismes is steeds onbekend en word verder ondersoek. Die transgeniese lyne wat tydens hierdie studie gegenereer is, sal baie belangrik wees in opvolgende analises waar hierdie verskillende fenotipes gebruik kan word om die profiel van selwandkomponente, maar ook die akkurate selwandsamestelling te bestudeer.

Na última década, a podridão vermelha das raízes da soja (PVR), ou síndrome da morte súbita, causada pelo fungo Fusarium solani f.sp. glycines, tornou-se uma doença que é motivo de preocupação para os sojicultores, técnicos e pesquisadores nas regiões onde esta doença já foi constatada, sendo a única estratégia de controle viável a utilização de cultivares resistentes. Diante disto, o principal objetivo do presente trabalho foi o estudo do controle genético da reação da soja a PVR por meio de técnicas de genética clássica e molecular. Foi utilizada a geração F2 de um dialelo 5x5, sem os recíprocos, envolvendo cinco cultivares: Forrest, MG/BR-46 (Conquista), IAC-4, FT-Cristalina e FT-Estrela, sendo as duas primeiras mais resistentes a PVR que IAC-4, considerada moderadamente resistente e, as duas últimas, altamente suscetíveis. Além de testes de inoculação com as cultivares, foram conduzidos três experimentos com a geração F2: um em telado (semeadura em julho de 2001) e dois em casa de vegetação (semeadura em setembro de 2001 e julho de 2002), sendo os dois primeiros em blocos ao acaso e o terceiro no delineamento inteiramente casualizado. O patógeno foi inoculado com grãos de sorgo colonizados, colocando-se três grãos no fundo de cada cova, no momento da semeadura, fazendo-se cinco covas por vaso, cada qual constituindo uma parcela com cinco plantas. Em cada experimento, foram avaliadas individualmente 50 plantas de cada genitor e 150 plantas de cada cruzamento F2, entre os 30 e 40 dias após a emergência, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 5 para a severidade dos sintomas foliares da PVR. A porcentagem de incidência da doença em cada parcela e um índice de doença também foram calculados. Nas análises de variância com os dados de médias de parcelas, observaram-se diferenças altamente significativas entre os genitores e entre populações F2 para a severidade e índice de doença dos sintomas foliares, na maioria dos casos, embora os genitores resistentes e suscetíveis não foram muito contrastantes. As cultivares Forrest e Conquista comportaram-se sempre como resistentes, e Cristalina e Estrela como suscetíveis, enquanto que IAC-4 apresentou comportamento instável. Pela análise dialélica de Jinks-Hayman reafirmou-se a influência do ambiente sobre o controle da resistência à manifestação dos sintomas foliares da PVR, a qual foi controlada quantitativamente. Nos experimentos de 2001, constatou-se apenas a ação de efeitos gênicos aditivos. Porém, no experimento conduzido em telado, a resistência demonstrou controle por genes recessivos, enquanto que na casa de vegetação, na maior parte, por genes dominantes. No experimento de 2002 constatou-se a presença de efeitos gênicos aditivos e de dominância, predominando o efeito destes últimos. Assim, com base no experimento de 2002, para o grupo de cultivares estudado, os parâmetros genéticos calculados permitiram verificar que: o grau médio de dominância indicou a presença de sobredominância; predominaram genes recessivos no grupo dos genitores; pelo menos três locos ou blocos gênicos que exibiram dominância foram responsáveis pelo controle da resistência a PVR; as herdabilidades estimadas no sentido restrito foram médias (0,33 a 0,62) e, no sentido amplo, altas (0,90 a 0,96), confirmando a presença de dominância; a resistência foi controlada, na maior parte, por genes dominantes e a ordem decrescente de dominância das cultivares foi a seguinte: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' e 'IAC-4'; a exclusão de 'Cristalina', por suspeita de apresentar distribuição de genes correlacionada com 'Conquista' e 'Estrela', melhorou a adequação dos dados de índice de doença ao modelo genético aditivo-dominante de Jinks-Hayman. A utilização de cinco marcadores moleculares microssatélites (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 e Satt570), relatados como ligados a cinco QRLs da PVR, indicou a provável presença de multialelismo nestes locos, o que não invalidou a adequação dos dados ao modelo de Jinks-Hayman. Pela análise de ligação entre 126 indivíduos F2 do cruzamento 'Conquista' x 'Estrela' com os marcadores Satt163 e Satt354, no experimento conduzido em telado, houve ligação fraca (P<0,10) entre estes locos e os respectivos QRLs, havendo tendência dos alelos recessivos serem os responsáveis pelo controle da resistência nestes dois locos, concordando com os resultados da análise dialélica para este experimento. / In order to study the genetic control of soybean resistance to sudden death syndrome (SDS) by classical and molecular genetic techniques a 5x5 diallel with the F2 generation, without the reciprocals, was carried out. The following parents were used: 'Forrest', 'MG/BR-46 (Conquista)', 'IAC-4', 'FT-Cristalina' and 'FT-Estrela'. The first two cultivars are more resistant to SDS than 'IAC-4', that is considered to be moderately resistant to SDS, and the last two cultivars are highly susceptible. Tests of inoculation were done with the cultivars and three experiments with the F2 generation (two in 2001 and one in 2002) were carried out, all of them in greenhouses. The fungus was inoculated by three colonized sorghum grains placed at the bottom of the holes at the planting. It was used five-holes/clay pot, which one was considered a plot with five plants. In each experiment with the F2 generation 50 single plants of each parent and 150 single plants of each F2 population were evaluated between 30 and 40 days after emergency by using a scale (1 to 5) based on foliar severity symptoms. The disease incidence and a disease index also were calculated for each plot. In the ANOVAs with data plot average for severity and disease index highly significant differences were detected among the treatments in almost all cases, although the resistant and the susceptible parents did not differ too much. The parents 'Forrest' and 'Conquista' were always more resistant than the others. 'Cristalina' and 'Estrela' were the most susceptible parents, while 'IAC-4' was unstable. Jinks-Hayman's analysis reaffirmed the environment effect on the genetic control of the resistance to SDS foliar symptoms, which was quantitatively controlled. In the 2001 experiments there was observed only additive genic effects, but in one experiment recessive genes had controlled the resistance, while in the other, in major part, dominant genes had controlled the resistance to SDS. In the 2002 experiment it was showed mainly dominance effects and also some additive genic effects. In the last experiment, for the group of parents used, the genetic parameters indicated that: the average degree of dominance showed the presence of overdominance; there were more recessive than dominants genes in the group of the parents; at least three loci or genic blocks that exhibited dominance were responsible for the genetic control of the resistance to SDS; the heritability in the narrow-sense had middle values (0.33 to 0.62), and in the broad-sense had high values (0.90 to 0.96), reinforcing the presence of dominance effects; the resistance to SDS was controlled, mostly, by dominant genes; the decreasing order of dominance of the parents were: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' and 'IAC-4'; and the exclusion of 'Cristalina' of the diallel for disease index by suspect of gene correlated distribution with 'Conquista' and 'Estrela' improved the fitting of the data to Jinks-Hayman's additive-dominant model. Five microsatellite markers (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 and Satt570), reported as linked to five SDS QRLs, were used and showed the possibility of occurrence of multiallelism in those loci, but this evidence did not invalidate the fitting of the data to Jinks-Hayman's model. The molecular analysis in 126 plants of 'Conquista' x 'Estrela' cross with the markers Satt163 and Satt354, in the first experiment of 2001, showed the tendency of weakly association (P<0,10), between those loci and the QRLs. This analysis showed also tendency that the recessive genes controlled the resistance to SDS in both loci, in according to the results obtained in the diallel analysis for this experiment.