O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos de ação da combinação dos quimioterápicos bevacizumab e erlotinib em modelos de câncer coloretal in vitro e in vivo e o potencial antigenotóxico, antimutagênico e antiproliferativo do ditelureto de difenila in vitro, visando a aplicação destes agentes na terapia antitumoral. As combinações de bevacizumab com uma pequena molécula inibidora de EGFR, erlotinib, são significativamente mais ativas que o bevacizumab sozinho em modelos CRC independente da presença de KRAS mutado. Nossos resultados mostram que o tratamento com bevacizumab provocou níveis aumentados de VEGFR1, VEGFR2 e EGFR fosforilados ativos em todos modelos de celulares, bem como nas células endoteliais associadas ao tumor que são atenuadas na presença de erlotinib e que erlotinib regula a secreção de anfiregulina e TGF-alfa in vitro como in vivo independentemente do status KRAS e sensibilidade ao bevacizumab, aumentando assim a atividade antitumoral. Ditelureto de difenila (DTDF) é um composto orgânico de telúrio que demonstrou atividades antioxidantes interessantes, tanto in vitro como in vivo. No presente estudo, DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações variando de 0,01 a 0,1 μM. O pré-tratamento com DPDT por 2h nestas concentrações mostrou propriedades antioxidantes, antigenotóxicas e antimutagênicas contra peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (t- BOOH), metil metanossulfonato (MMS) ou radiação ultravioleta (C) em células V79. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 μmol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Além disso, DTDF mostrou propriedades antitumorais em várias linhagens celulares de câncer. Em conjunto, nossos resultados elucidam aspectos importantes do mecanismo de ação dos agentes bevacizumab, erlotinib e DTDF, destacando as atividades promissoras dessas drogas que, empregadas como agentes únicos ou em associação com quimioterápicos, podem contribuir para melhoramento dos protocolos de terapia antitumoral. / This study investigated the mechanisms of action of the combination of chemotherapeutics bevacizumab and erlotinib in colorectal cancer models in vitro and in vivo and the antigenotoxic, antimutagenic and anti-proliferative potential of diphenyl ditelluride, aiming the application of these agents in antitumor therapy. The combinations of bevacizumab with a small molecule EGFR-inhibitor, erlotinib, are significantly more active than bevacizumab alone in CRC models with different KRAS status and bevacizumab sensitivity. Our results show that bevacizumab treatment provoked increased levels of active, phosphorylated VEGFR1, VEGFR2 and EGFR in all tumor models as well as in the tumor-associated endothelial cells which is attenuated in the presence of erlotinib and that erlotinib down-regulates the secretion of amphiregulin and TGF-alpha in vitro as in vivo irrespective of KRAS status, increasing the antitumor activity. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo. In the present study, DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.1 μM. The pre-treatment for 2h with DPDT showed antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties against hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl methanesulphonate (MMS) or ultraviolet (UV)C radiation in V79 cells. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 μmol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Furthermore, DPDT showed anticancer properties in several cancer cell lines. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the agents bevacizumab, erlotinib and DPDT, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumor therapy.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de neoplasia maligna mais frequente no mundo, o qual apresenta elevadas taxas de mortalidade. Os compostos organotelurados (OT) possuem interessantes efeitos biológicos, como potenciais antioxidantes e ações antiproliferativas. O ditelureto de difenila (DTDF), um composto OT, simples e estável, atualmente é investigado quanto aos seus efeitos biológicos. Em estudos anteriores, o DTDF apresentou ação antigenotóxica e antimutagênica em baixas concentrações. No entanto, em concentrações mais elevadas, o DTDF mostrou-se citotóxico em células de mamífero (V79) pela indução de genotoxicidade, parada do ciclo celular e inibição de topoisomerase I (TopoI). Por conseguinte, a citotoxicidade dos compostos OTs tem sido explorada em diversos estudos, assim como sua ação como agentes antiproliferativos em terapias anticâncer é também investigada. O objetivo deste estudo é avaliar o potencial antiproliferativo, genotóxico e análise de ciclo celular do DPDT em linhagens de células humanas HCT116 (carcinoma) e HT-29 (adenocarcinoma). Os resultados mostraram diminuição da viabilidade celular após exposição ao DTDF por 72 horas em ambas as linhagens celulares, avaliadas por MTT e ensaio clonogênico. Os valores de IC50 obtidos foram de 10,74 e 2 μM para MRC5 e HCT116, respectivamente, no ensaio MTT. No ensaio cometa, o DTDF mostrou capacidade de induzir aumento de índice de dano (ID) no DNA com 10 μM após 3 e 24 horas de exposição, em MRC5 e HCT116. Para 24 horas de exposição, o aumento no ID ocorre apenas em células HCT116, em concentrações ≤ 5 μM de DTDF. Para uma melhor compreensão, foi avaliado se DTDF foi capaz de causar quebras ou interações diretas com DNA pelas análises de quebra de DNA plasmidial e de dicroísmo circular (DC). Não foram detectadas quebras duplas ou simples em concentrações que vão de 0 a 400 μM de DTDF pela análise de quebra de DNA plasmidial. No experimento de DC, na mesma faixa de concentrações, não foi possível detectar interações diretas de DTDF com o DNA plasmidial. Por citometria de fluxo, foi realizada a análise de ciclo celular, onde foi observado a parada em G2/M após 24, 48 e 72 horas de exposição em 5 e 10 μM de DTDF. Foi avaliado pelo método TARDIS se o DTDF foi capaz causar a inibição da enzima topoisomerase II (TopoII) em HCT116 e MRC5. Em 3 horas de exposição, em 5 e 10 μM, o DTDF não foi capaz de induzir formação de complexos DNA-TopoII. Os resultados mostraram que a linhagem HCT116 foi mais sensíveis aos efeitos citotóxicos do DTDF do que as células MRC5. Como foi demonstrado que o DTDF não é capaz de interagir diretamente com DNA, essa diferença pode estar relacionada com os efeitos genotóxicos indiretos, como estresse oxidativo ou inibição de TopoI, que levaram a parada em G2/M. Esses resultados fortalecem a hipótese de inibição de TopoI, visto que os mecanismos celulares do DTDF estão relacionados com seu efeito genotóxico e parada no ciclo celular. Assim, os resultados desse trabalho abrem possibilidades de estudos futuros para investigações mais aprofundadas de possíveis mecanismos de ação moleculares do DTDF em células de câncer colorretal. / Colorectal cancer is the third more frequent type of cancer worldwide and has high mortality rates. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium (OT) compound with biological effects, such as potential antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic at low concentrations. However, higher concentrations of DPDT showed cytotoxic effects in mammalian V79 cells by inducing oxidative damage, DNA strand breaks, cell cycle arrest and topoisomerase I (TopoI) inhibition. In this sense, the cytotoxicity of OT compounds has been reported, and the observed effects attributed for anticancer therapy application. Thus, the objective of this study is to investigate the antiproliferative, genotoxic and cell cycle arrest potential of DPDT in human colon cancer cells (HCT116) and human fibroblast cells (MRC5). The results showed a decrease in cell viability after DPDT exposition for 72 h in both cell lines, as evaluated by MTT and clonogenic assays. The IC50 values obtained were 10.74 and 2 μM for MRC5 and HCT116, respectively in MTT assay. In the comet assay, DPDT at concentrations ≤ 5 μM was able to increase DNA strand breaks induction only in HCT116 cells after 24 h of exposure. For a better understanding, we evaluated if DPDT was able to cause strand breaks in direct interaction with plasmidial DNA breakage analysis. No single or double strand breaks were detected in a range of concentrations from 0 to 400 μM. By circular dichroism analysis, no direct interactions with DNA were found at the same concentrations. Furthermore, cell cycle arrest in G2/M phase detected by flow cytometry was more pronounced in the HCT116 than MRC5 cell lines after 24, 48 and 72 h of exposure. By the TARDIS method, we evaluate if DPDT was able to inhibit topoisomerase II. For 3 h exposure, in 5 and 10 μM, DPDT does not shows topoisomerase II inhibition. Taken together, HCT116 colon cancer cells were more sensitive to DPDT biological effects than MRC5 cells. This difference may be related to the stronger indirect genotoxic effects induced by DPDT in HCT116 cells, which probably triggered the cell cycle arrest. The action of DPDT apparently occurs in the S phase, taking place to cell cycle arrest in G2/M, reinforcing the hypothesis of TopoI inhibition. Thus, the results of this work open up possibilities for future studies on further investigation of possible mechanisms of molecular action of DTDF in colorectal cancer cells.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de neoplasia maligna mais frequente no mundo, o qual apresenta elevadas taxas de mortalidade. Os compostos organotelurados (OT) possuem interessantes efeitos biológicos, como potenciais antioxidantes e ações antiproliferativas. O ditelureto de difenila (DTDF), um composto OT, simples e estável, atualmente é investigado quanto aos seus efeitos biológicos. Em estudos anteriores, o DTDF apresentou ação antigenotóxica e antimutagênica em baixas concentrações. No entanto, em concentrações mais elevadas, o DTDF mostrou-se citotóxico em células de mamífero (V79) pela indução de genotoxicidade, parada do ciclo celular e inibição de topoisomerase I (TopoI). Por conseguinte, a citotoxicidade dos compostos OTs tem sido explorada em diversos estudos, assim como sua ação como agentes antiproliferativos em terapias anticâncer é também investigada. O objetivo deste estudo é avaliar o potencial antiproliferativo, genotóxico e análise de ciclo celular do DPDT em linhagens de células humanas HCT116 (carcinoma) e HT-29 (adenocarcinoma). Os resultados mostraram diminuição da viabilidade celular após exposição ao DTDF por 72 horas em ambas as linhagens celulares, avaliadas por MTT e ensaio clonogênico. Os valores de IC50 obtidos foram de 10,74 e 2 μM para MRC5 e HCT116, respectivamente, no ensaio MTT. No ensaio cometa, o DTDF mostrou capacidade de induzir aumento de índice de dano (ID) no DNA com 10 μM após 3 e 24 horas de exposição, em MRC5 e HCT116. Para 24 horas de exposição, o aumento no ID ocorre apenas em células HCT116, em concentrações ≤ 5 μM de DTDF. Para uma melhor compreensão, foi avaliado se DTDF foi capaz de causar quebras ou interações diretas com DNA pelas análises de quebra de DNA plasmidial e de dicroísmo circular (DC). Não foram detectadas quebras duplas ou simples em concentrações que vão de 0 a 400 μM de DTDF pela análise de quebra de DNA plasmidial. No experimento de DC, na mesma faixa de concentrações, não foi possível detectar interações diretas de DTDF com o DNA plasmidial. Por citometria de fluxo, foi realizada a análise de ciclo celular, onde foi observado a parada em G2/M após 24, 48 e 72 horas de exposição em 5 e 10 μM de DTDF. Foi avaliado pelo método TARDIS se o DTDF foi capaz causar a inibição da enzima topoisomerase II (TopoII) em HCT116 e MRC5. Em 3 horas de exposição, em 5 e 10 μM, o DTDF não foi capaz de induzir formação de complexos DNA-TopoII. Os resultados mostraram que a linhagem HCT116 foi mais sensíveis aos efeitos citotóxicos do DTDF do que as células MRC5. Como foi demonstrado que o DTDF não é capaz de interagir diretamente com DNA, essa diferença pode estar relacionada com os efeitos genotóxicos indiretos, como estresse oxidativo ou inibição de TopoI, que levaram a parada em G2/M. Esses resultados fortalecem a hipótese de inibição de TopoI, visto que os mecanismos celulares do DTDF estão relacionados com seu efeito genotóxico e parada no ciclo celular. Assim, os resultados desse trabalho abrem possibilidades de estudos futuros para investigações mais aprofundadas de possíveis mecanismos de ação moleculares do DTDF em células de câncer colorretal. / Colorectal cancer is the third more frequent type of cancer worldwide and has high mortality rates. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium (OT) compound with biological effects, such as potential antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic at low concentrations. However, higher concentrations of DPDT showed cytotoxic effects in mammalian V79 cells by inducing oxidative damage, DNA strand breaks, cell cycle arrest and topoisomerase I (TopoI) inhibition. In this sense, the cytotoxicity of OT compounds has been reported, and the observed effects attributed for anticancer therapy application. Thus, the objective of this study is to investigate the antiproliferative, genotoxic and cell cycle arrest potential of DPDT in human colon cancer cells (HCT116) and human fibroblast cells (MRC5). The results showed a decrease in cell viability after DPDT exposition for 72 h in both cell lines, as evaluated by MTT and clonogenic assays. The IC50 values obtained were 10.74 and 2 μM for MRC5 and HCT116, respectively in MTT assay. In the comet assay, DPDT at concentrations ≤ 5 μM was able to increase DNA strand breaks induction only in HCT116 cells after 24 h of exposure. For a better understanding, we evaluated if DPDT was able to cause strand breaks in direct interaction with plasmidial DNA breakage analysis. No single or double strand breaks were detected in a range of concentrations from 0 to 400 μM. By circular dichroism analysis, no direct interactions with DNA were found at the same concentrations. Furthermore, cell cycle arrest in G2/M phase detected by flow cytometry was more pronounced in the HCT116 than MRC5 cell lines after 24, 48 and 72 h of exposure. By the TARDIS method, we evaluate if DPDT was able to inhibit topoisomerase II. For 3 h exposure, in 5 and 10 μM, DPDT does not shows topoisomerase II inhibition. Taken together, HCT116 colon cancer cells were more sensitive to DPDT biological effects than MRC5 cells. This difference may be related to the stronger indirect genotoxic effects induced by DPDT in HCT116 cells, which probably triggered the cell cycle arrest. The action of DPDT apparently occurs in the S phase, taking place to cell cycle arrest in G2/M, reinforcing the hypothesis of TopoI inhibition. Thus, the results of this work open up possibilities for future studies on further investigation of possible mechanisms of molecular action of DTDF in colorectal cancer cells.

O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos de ação da combinação dos quimioterápicos bevacizumab e erlotinib em modelos de câncer coloretal in vitro e in vivo e o potencial antigenotóxico, antimutagênico e antiproliferativo do ditelureto de difenila in vitro, visando a aplicação destes agentes na terapia antitumoral. As combinações de bevacizumab com uma pequena molécula inibidora de EGFR, erlotinib, são significativamente mais ativas que o bevacizumab sozinho em modelos CRC independente da presença de KRAS mutado. Nossos resultados mostram que o tratamento com bevacizumab provocou níveis aumentados de VEGFR1, VEGFR2 e EGFR fosforilados ativos em todos modelos de celulares, bem como nas células endoteliais associadas ao tumor que são atenuadas na presença de erlotinib e que erlotinib regula a secreção de anfiregulina e TGF-alfa in vitro como in vivo independentemente do status KRAS e sensibilidade ao bevacizumab, aumentando assim a atividade antitumoral. Ditelureto de difenila (DTDF) é um composto orgânico de telúrio que demonstrou atividades antioxidantes interessantes, tanto in vitro como in vivo. No presente estudo, DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações variando de 0,01 a 0,1 μM. O pré-tratamento com DPDT por 2h nestas concentrações mostrou propriedades antioxidantes, antigenotóxicas e antimutagênicas contra peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (t- BOOH), metil metanossulfonato (MMS) ou radiação ultravioleta (C) em células V79. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 μmol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Além disso, DTDF mostrou propriedades antitumorais em várias linhagens celulares de câncer. Em conjunto, nossos resultados elucidam aspectos importantes do mecanismo de ação dos agentes bevacizumab, erlotinib e DTDF, destacando as atividades promissoras dessas drogas que, empregadas como agentes únicos ou em associação com quimioterápicos, podem contribuir para melhoramento dos protocolos de terapia antitumoral. / This study investigated the mechanisms of action of the combination of chemotherapeutics bevacizumab and erlotinib in colorectal cancer models in vitro and in vivo and the antigenotoxic, antimutagenic and anti-proliferative potential of diphenyl ditelluride, aiming the application of these agents in antitumor therapy. The combinations of bevacizumab with a small molecule EGFR-inhibitor, erlotinib, are significantly more active than bevacizumab alone in CRC models with different KRAS status and bevacizumab sensitivity. Our results show that bevacizumab treatment provoked increased levels of active, phosphorylated VEGFR1, VEGFR2 and EGFR in all tumor models as well as in the tumor-associated endothelial cells which is attenuated in the presence of erlotinib and that erlotinib down-regulates the secretion of amphiregulin and TGF-alpha in vitro as in vivo irrespective of KRAS status, increasing the antitumor activity. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo. In the present study, DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.1 μM. The pre-treatment for 2h with DPDT showed antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties against hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl methanesulphonate (MMS) or ultraviolet (UV)C radiation in V79 cells. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 μmol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Furthermore, DPDT showed anticancer properties in several cancer cell lines. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the agents bevacizumab, erlotinib and DPDT, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumor therapy.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de neoplasia maligna mais frequente no mundo, o qual apresenta elevadas taxas de mortalidade. Os compostos organotelurados (OT) possuem interessantes efeitos biológicos, como potenciais antioxidantes e ações antiproliferativas. O ditelureto de difenila (DTDF), um composto OT, simples e estável, atualmente é investigado quanto aos seus efeitos biológicos. Em estudos anteriores, o DTDF apresentou ação antigenotóxica e antimutagênica em baixas concentrações. No entanto, em concentrações mais elevadas, o DTDF mostrou-se citotóxico em células de mamífero (V79) pela indução de genotoxicidade, parada do ciclo celular e inibição de topoisomerase I (TopoI). Por conseguinte, a citotoxicidade dos compostos OTs tem sido explorada em diversos estudos, assim como sua ação como agentes antiproliferativos em terapias anticâncer é também investigada. O objetivo deste estudo é avaliar o potencial antiproliferativo, genotóxico e análise de ciclo celular do DPDT em linhagens de células humanas HCT116 (carcinoma) e HT-29 (adenocarcinoma). Os resultados mostraram diminuição da viabilidade celular após exposição ao DTDF por 72 horas em ambas as linhagens celulares, avaliadas por MTT e ensaio clonogênico. Os valores de IC50 obtidos foram de 10,74 e 2 μM para MRC5 e HCT116, respectivamente, no ensaio MTT. No ensaio cometa, o DTDF mostrou capacidade de induzir aumento de índice de dano (ID) no DNA com 10 μM após 3 e 24 horas de exposição, em MRC5 e HCT116. Para 24 horas de exposição, o aumento no ID ocorre apenas em células HCT116, em concentrações ≤ 5 μM de DTDF. Para uma melhor compreensão, foi avaliado se DTDF foi capaz de causar quebras ou interações diretas com DNA pelas análises de quebra de DNA plasmidial e de dicroísmo circular (DC). Não foram detectadas quebras duplas ou simples em concentrações que vão de 0 a 400 μM de DTDF pela análise de quebra de DNA plasmidial. No experimento de DC, na mesma faixa de concentrações, não foi possível detectar interações diretas de DTDF com o DNA plasmidial. Por citometria de fluxo, foi realizada a análise de ciclo celular, onde foi observado a parada em G2/M após 24, 48 e 72 horas de exposição em 5 e 10 μM de DTDF. Foi avaliado pelo método TARDIS se o DTDF foi capaz causar a inibição da enzima topoisomerase II (TopoII) em HCT116 e MRC5. Em 3 horas de exposição, em 5 e 10 μM, o DTDF não foi capaz de induzir formação de complexos DNA-TopoII. Os resultados mostraram que a linhagem HCT116 foi mais sensíveis aos efeitos citotóxicos do DTDF do que as células MRC5. Como foi demonstrado que o DTDF não é capaz de interagir diretamente com DNA, essa diferença pode estar relacionada com os efeitos genotóxicos indiretos, como estresse oxidativo ou inibição de TopoI, que levaram a parada em G2/M. Esses resultados fortalecem a hipótese de inibição de TopoI, visto que os mecanismos celulares do DTDF estão relacionados com seu efeito genotóxico e parada no ciclo celular. Assim, os resultados desse trabalho abrem possibilidades de estudos futuros para investigações mais aprofundadas de possíveis mecanismos de ação moleculares do DTDF em células de câncer colorretal. / Colorectal cancer is the third more frequent type of cancer worldwide and has high mortality rates. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium (OT) compound with biological effects, such as potential antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic at low concentrations. However, higher concentrations of DPDT showed cytotoxic effects in mammalian V79 cells by inducing oxidative damage, DNA strand breaks, cell cycle arrest and topoisomerase I (TopoI) inhibition. In this sense, the cytotoxicity of OT compounds has been reported, and the observed effects attributed for anticancer therapy application. Thus, the objective of this study is to investigate the antiproliferative, genotoxic and cell cycle arrest potential of DPDT in human colon cancer cells (HCT116) and human fibroblast cells (MRC5). The results showed a decrease in cell viability after DPDT exposition for 72 h in both cell lines, as evaluated by MTT and clonogenic assays. The IC50 values obtained were 10.74 and 2 μM for MRC5 and HCT116, respectively in MTT assay. In the comet assay, DPDT at concentrations ≤ 5 μM was able to increase DNA strand breaks induction only in HCT116 cells after 24 h of exposure. For a better understanding, we evaluated if DPDT was able to cause strand breaks in direct interaction with plasmidial DNA breakage analysis. No single or double strand breaks were detected in a range of concentrations from 0 to 400 μM. By circular dichroism analysis, no direct interactions with DNA were found at the same concentrations. Furthermore, cell cycle arrest in G2/M phase detected by flow cytometry was more pronounced in the HCT116 than MRC5 cell lines after 24, 48 and 72 h of exposure. By the TARDIS method, we evaluate if DPDT was able to inhibit topoisomerase II. For 3 h exposure, in 5 and 10 μM, DPDT does not shows topoisomerase II inhibition. Taken together, HCT116 colon cancer cells were more sensitive to DPDT biological effects than MRC5 cells. This difference may be related to the stronger indirect genotoxic effects induced by DPDT in HCT116 cells, which probably triggered the cell cycle arrest. The action of DPDT apparently occurs in the S phase, taking place to cell cycle arrest in G2/M, reinforcing the hypothesis of TopoI inhibition. Thus, the results of this work open up possibilities for future studies on further investigation of possible mechanisms of molecular action of DTDF in colorectal cancer cells.

O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos de ação da combinação dos quimioterápicos bevacizumab e erlotinib em modelos de câncer coloretal in vitro e in vivo e o potencial antigenotóxico, antimutagênico e antiproliferativo do ditelureto de difenila in vitro, visando a aplicação destes agentes na terapia antitumoral. As combinações de bevacizumab com uma pequena molécula inibidora de EGFR, erlotinib, são significativamente mais ativas que o bevacizumab sozinho em modelos CRC independente da presença de KRAS mutado. Nossos resultados mostram que o tratamento com bevacizumab provocou níveis aumentados de VEGFR1, VEGFR2 e EGFR fosforilados ativos em todos modelos de celulares, bem como nas células endoteliais associadas ao tumor que são atenuadas na presença de erlotinib e que erlotinib regula a secreção de anfiregulina e TGF-alfa in vitro como in vivo independentemente do status KRAS e sensibilidade ao bevacizumab, aumentando assim a atividade antitumoral. Ditelureto de difenila (DTDF) é um composto orgânico de telúrio que demonstrou atividades antioxidantes interessantes, tanto in vitro como in vivo. No presente estudo, DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações variando de 0,01 a 0,1 μM. O pré-tratamento com DPDT por 2h nestas concentrações mostrou propriedades antioxidantes, antigenotóxicas e antimutagênicas contra peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (t- BOOH), metil metanossulfonato (MMS) ou radiação ultravioleta (C) em células V79. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 μmol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Além disso, DTDF mostrou propriedades antitumorais em várias linhagens celulares de câncer. Em conjunto, nossos resultados elucidam aspectos importantes do mecanismo de ação dos agentes bevacizumab, erlotinib e DTDF, destacando as atividades promissoras dessas drogas que, empregadas como agentes únicos ou em associação com quimioterápicos, podem contribuir para melhoramento dos protocolos de terapia antitumoral. / This study investigated the mechanisms of action of the combination of chemotherapeutics bevacizumab and erlotinib in colorectal cancer models in vitro and in vivo and the antigenotoxic, antimutagenic and anti-proliferative potential of diphenyl ditelluride, aiming the application of these agents in antitumor therapy. The combinations of bevacizumab with a small molecule EGFR-inhibitor, erlotinib, are significantly more active than bevacizumab alone in CRC models with different KRAS status and bevacizumab sensitivity. Our results show that bevacizumab treatment provoked increased levels of active, phosphorylated VEGFR1, VEGFR2 and EGFR in all tumor models as well as in the tumor-associated endothelial cells which is attenuated in the presence of erlotinib and that erlotinib down-regulates the secretion of amphiregulin and TGF-alpha in vitro as in vivo irrespective of KRAS status, increasing the antitumor activity. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo. In the present study, DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.1 μM. The pre-treatment for 2h with DPDT showed antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties against hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl methanesulphonate (MMS) or ultraviolet (UV)C radiation in V79 cells. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 μmol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Furthermore, DPDT showed anticancer properties in several cancer cell lines. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the agents bevacizumab, erlotinib and DPDT, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumor therapy.

O presente estudo avaliou as propriedades antigenotóxicas e antimutagênicas do Ditelureto de Difenila (DTDF) contra diversos mutágenos em fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79). O DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações entre 0,01 – 0,5 mol. O pré-tratamento com esse composto organotelurado nas concentrações não citotóxicas (0,01, 0,05 e 0,1 mol) aumentou a viabiliadade celular após a exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2), tert butil hidroperoxido (t-BOOH), metil metano sulfonato (MMS) ou radiação UV C. Além disso, o pré-tratamento com o DTDF diminuiu os danos no DNA e a indução de bases oxidadas por todos os agentes genotóxicos estudados, como pode ser verificado pelo ensaio cometa alcalino e ensaio cometa modificado, respectivamente. O pré-tratamento também reduziu a frequência de micronucleus, revelando um efeito protetor do DTDF contra os dois agentes mutagênicos testados, MMS ou UV C. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 mol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos foci de ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram claramente que o DTDF em baixas concentrações apresenta propriedades antigenotóxicas e antimutagênicas. O efeito protetor observado pode ser atribuído a indução de uma resposta adaptativa em células V79 pelo pré-tratamento com o DTDF. / The present study evaluated antigenotoxic and antimutagenic properties of Diphenyl ditelluride (DPDT) against several known mutagens in Chinese hamster lung fibroblast (V79). DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.5mol. The pre-treatment for 2h with this organotellurium compound at non-cytotoxic dose range (0.01, 0.05 and 0.1 mol) increased cell survival after challenge with hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl-methanesulphonate (MMS), or UV C radiation. In addition, the pre-treatment with DPDT decreased the DNA damage and oxidized bases induction by the studied genotoxic agents, as verified in the comet assay and modified comet assay, respectively. The pre-treatment also reduced micronucleus frequency, revealing the protector effect of DPDT against MMS or UV C induced mutagenesis. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 mol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Our results clearly demonstrate that DPDT at low concentrations presents antigenotoxic and antimutagenic properties. The probable mechanism of the protection effect could be induction of adaptive response in V79 cells by the DPDT pre-treatment.

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

O ditelureto de difenila (DTDF) é um composto organotelurado simples e estável e é um potencial candidato de protótipos para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Então, é importante avaliar os efeitos tóxicos desse composto. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do DTDF em vários modelos biológicos: em células de fibroblastos de pulmão de hamster chinês, em linhagens da levedura S. cerevisiae proficientes e deficientes em algumas vias de reparação de DNA e na bactéria Salmonela typhimurium. O DTDF pode induzir alteração no quadro de leitura em S. typhimurium e em linhagen selvagem haplóide de S. cereviviae. Assim, o DTDF apresenta um comportamento similar a um agente intercalante. Os mutantes de S. cerevisiae defectivos na reparação por excisão de bases e na reparação recombinacional mostraram elevada sensibilidade ao DTDF. Em células V79 tratadas com concentrações crescentes de DTDF, a atividade citotóxica, foi determinada usando ensaio de lactato desidrogenase no meio extracelular, ocorre na concentração de 1 µM após 2 h de exposição. Consistentemente, o tratamento das células por 2 h com concentrações de DTDF citotóxicas aumentaram os níveis de TBARS e diminuíram os níveis de GSH/GSSH em levedura e em células V79, indicando que DTDF pode levar ao aumento da peroxidação lipídica e da oxidação da glutationa intracelular, caracterizando um estado de estresse oxidatívo. Nas concentrações mais elevadas, o DTDF induziu a formação de quebras simples e duplas de DNA em células V79, como evidenciado pelo ensaio cometa, nas versões alcalina e neutra, na presença e ausência de ativação metabólica. O DTDF induziu a danos oxidativos ao DNA, determinados pelo ensaio cometa modificado empregando as endonucleases formamidopirimidina DNA-glicosilase (Fpg) e endonuclease III (endoIII) com e sem ativação metabólica. O tratamento também induziu aumento no número de células binucleadas no teste micronúcleo em células V79, demonstrando potencial mutagênico dessa molécula em altas concentrações. Finalmente, o pré-tratamento com N-acetilcisteina, que restaura o GSH ao nível normal, reduziu os efeitos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos do DTDF em levedura e em células V79. Em resumo, os efeitos celulares do DTDF parecem ser muito complexos e ligados a sua habilidade induzir distúrbios na homeostase redox celular e na capacidade de intercalar no DNA, que conduzem a dano e a quebras do DNA, danos e morte celular. / Diphenyl ditelluride (DPDT) is a simple and stable organotellurium compound and it is a potential candidate to prototype for a development of novel biological active molecules. Thus, it is important to evaluate the toxic effects of this compound. In the present study, we evaluated the putative cytotoxic, genotoxic, and mutagenic properties of DPDT in various biological models: in V79 Chinese lung fibroblast cells, in strains of the yeast S.cerevisiae proficient and deficient in several DNA repair pathways and in Salmonella typhimurium. DPDT is able to induce frameshift mutations in S.typhimurium and in haploid wild type strain of S.cerevisiae. Thus, DPDT presents a behavior similar that of an intercalanting agent. Mutants of S.cerevisiae defective in base excision repair and in recombinational repair showed high sensitivity to DPDT. In V79 cells treated with increasing concentrations of DPDT, the cytotoxic activity, as determined using lactate dehydrogenase leakage assay, occurs in doses up to 1 µM after 2 h of exposure. Accordingly, the treatment of cells for 2 h with cytotoxic doses of DPDT increased TBARS levels and decreased GSH/GSSH ratio in yeast and in V79 cells, indicating that DPDT can lead to increase lipid peroxidation and intracellular glutathione oxidation, characterizing an oxidative stress status. At the higher doses, DPDT generates DNA single and double strand breaks in V79 cells, as observed using the comet assay, at both the alkaline and the neutral versions without and with metabolic activation. DPDT induced pronounced oxidative DNA damage, determined using modified Comet assay with the enzymes formamidopyrimidine DNA-glycosylase (Fpg) and endonuclease III (Endo III) without and with metabolic activation. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test in V79 cells, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. Finally, pre-incubation with N-acetylcysteine, which restored GSH to normal levels, reduce DPDT oxidant, genotoxic and mutagenic effects in yeast and V79 cells. In summary, the cellular effects of DPDT appear to be very complex and linked to its ability to impose disturbs in redox cellular homeostasis and in the ability to intercalate into DNA, which lead to DNA damage and breakage, cellular injury and cell death.

O presente estudo avaliou as propriedades antigenotóxicas e antimutagênicas do Ditelureto de Difenila (DTDF) contra diversos mutágenos em fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79). O DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações entre 0,01 – 0,5 mol. O pré-tratamento com esse composto organotelurado nas concentrações não citotóxicas (0,01, 0,05 e 0,1 mol) aumentou a viabiliadade celular após a exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2), tert butil hidroperoxido (t-BOOH), metil metano sulfonato (MMS) ou radiação UV C. Além disso, o pré-tratamento com o DTDF diminuiu os danos no DNA e a indução de bases oxidadas por todos os agentes genotóxicos estudados, como pode ser verificado pelo ensaio cometa alcalino e ensaio cometa modificado, respectivamente. O pré-tratamento também reduziu a frequência de micronucleus, revelando um efeito protetor do DTDF contra os dois agentes mutagênicos testados, MMS ou UV C. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 mol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos foci de ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram claramente que o DTDF em baixas concentrações apresenta propriedades antigenotóxicas e antimutagênicas. O efeito protetor observado pode ser atribuído a indução de uma resposta adaptativa em células V79 pelo pré-tratamento com o DTDF. / The present study evaluated antigenotoxic and antimutagenic properties of Diphenyl ditelluride (DPDT) against several known mutagens in Chinese hamster lung fibroblast (V79). DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.5mol. The pre-treatment for 2h with this organotellurium compound at non-cytotoxic dose range (0.01, 0.05 and 0.1 mol) increased cell survival after challenge with hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl-methanesulphonate (MMS), or UV C radiation. In addition, the pre-treatment with DPDT decreased the DNA damage and oxidized bases induction by the studied genotoxic agents, as verified in the comet assay and modified comet assay, respectively. The pre-treatment also reduced micronucleus frequency, revealing the protector effect of DPDT against MMS or UV C induced mutagenesis. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 mol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Our results clearly demonstrate that DPDT at low concentrations presents antigenotoxic and antimutagenic properties. The probable mechanism of the protection effect could be induction of adaptive response in V79 cells by the DPDT pre-treatment.